細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2在介導(dǎo)周期性牽張力對牙周膜細(xì)胞成骨分化中的作用

宋京 任大鵬 顏世果 藍(lán)菁 袁曉, 郭慶圓 戚向敏

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2在介導(dǎo)周期性牽張力對牙周膜細(xì)胞成骨分化中的作用

宋京1任大鵬2顏世果1藍(lán)菁1袁曉2,3郭慶圓3戚向敏1

1.山東大學(xué)口腔醫(yī)院，山東省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250012；2.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院正畸科，青島 266003；3.青島市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心正畸科，青島 266075

目的 研究周期性牽張力刺激下細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2對牙周膜細(xì)胞成骨分化的分子調(diào)控機(jī)制。方法 組織塊法培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞。采用多通道應(yīng)力加載系統(tǒng)對細(xì)胞施加頻率0.5 Hz、振幅10%的周期性牽張力（加力時(shí)間1、3、6、12、24 h），以不加力的細(xì)胞作為對照，并分別在加力前應(yīng)用ERK1/2通路特異性抑制劑U0126以及對細(xì)胞轉(zhuǎn)染ERK1/2顯性負(fù)相變異體（DN-ERK1/2）。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time PCR）及蛋白質(zhì)印跡法研究人牙周膜細(xì)胞的基因蛋白水平變化。結(jié)果 加力后人牙周膜細(xì)胞的p-ERK1/2蛋白水平及骨鈣蛋白（OCN） mRNA、骨涎蛋白（BSP）mRNA水平均顯著升高，Runt相關(guān)基因（Runx）2 mRNA及蛋白水平在加力3、6 h均顯著升高。加入抑制劑U0126或細(xì)胞轉(zhuǎn)染DN-ERK1/2后，Runx2、OCN、BSP mRNA水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均降低。結(jié)論 ERK1/2是周期性牽張力刺激下牙周膜細(xì)胞成骨分化的重要分子途徑，力學(xué)刺激下激活的ERK1/2可能通過提高Runx2蛋白的表達(dá)水平而參與成骨基因OCN和BSP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

牙周膜細(xì)胞； 成骨分化； 周期性牽張力； 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2

牙周膜是位于牙根和牙槽骨之間的纖維結(jié)締組織，主要功能是將牙齒承受的力刺激傳遞給牙槽骨，以利于牙周組織改建。人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是構(gòu)成牙周膜的主體細(xì)胞，在感受力學(xué)刺激并將其轉(zhuǎn)化為生物信號過程中起到重要的作用。這種特性決定了牙周膜細(xì)胞是牙周組織再生與改建的種子細(xì)胞[1]。牙周膜成纖維細(xì)胞對力學(xué)刺激的感受和反應(yīng)，以及在不同狀態(tài)下的基因表達(dá)差異和功能變化已經(jīng)成為學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，多種力學(xué)裝置的使用，如壓應(yīng)力、間斷性牽張力等，均可不同程度地促使牙周膜成纖維細(xì)胞的成骨表型基因表達(dá)，如骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）等[2-4]。

核心結(jié)合因子α1（core binding factor α1，cbfα1），即Runt相關(guān)基因2（runt-related transcription factor 2，Runx2），是成骨細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子，對骨組織的形成和重建起重要作用[5-6]。依賴于其特有的結(jié)構(gòu)域runt，Runx2可以與下游靶基因DNA上的特異性位點(diǎn)結(jié)合從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活作用，促使下游成骨表型基因的表達(dá)，以及干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化[7]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）超家族的重要成員，其在細(xì)胞分化、增殖、凋亡及遷移等多種細(xì)胞行為中發(fā)揮信號傳遞作用[8-9]。目前已證實(shí)ERK1/2與Runx2均是力學(xué)信號的刺激靶點(diǎn)之一，但對于其是否參與了周期性牽張力刺激下hPDLCs的成骨分化，以及具體的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究應(yīng)用細(xì)胞多通道應(yīng)力加載裝置對體外培養(yǎng)的hPDLCs施加振幅10%、頻率0.5 Hz的周期性牽張力，以模擬口腔生理環(huán)境下牙周膜承受的咬合力[3]，觀察hPDLCs中ERK1/2通路及成骨相關(guān)基因的變化，探索ERK1/2參與周期性牽張力刺激下牙周膜細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、雙抗（青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 U·mL-1）（Hyclone公司，美國）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）、鼠抗人波形絲蛋白抗體、鼠抗人角蛋白抗體、通用型免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、ERK1/2鼠抗人單克隆抗體、磷酸化ERK1/2鼠抗人單克隆抗體（phospho-ERK1/2，p-ERK1/2）、ERK1/2通路特異性阻斷劑U0126（Cell Signaling Technology公司，美國），Runx2兔抗人單克隆抗體（Abcam公司，美國），二甲基亞砜（dimathylsulfoxide，DMSO）、細(xì)胞裂解液、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chainreaction，real-time PCR）試劑盒、引物合成（Takara公司，日本）、ERK1/2顯性負(fù)相變異體（dominant negative ERK1/2，DN-ERK1/2）重組慢病毒載體LV-dnERK1/2與慢病毒空載體LV-NC（上海吉瑪生物技術(shù)有限公司）。

MDF-382E型超低溫冰箱（-80 ℃）（SANYO公司，日本），Olympus TH4-200倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)、FluoView FV1200熒光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本），HERA cell恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus公司，德國），HDL-1360B型超凈工作臺（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），多通道應(yīng)力加載系統(tǒng)（哈爾濱工業(yè)大學(xué)研制），ioFlex彈性細(xì)胞培養(yǎng)板（Flexcell公司，美國），Light Cycler Roche 480 real-time PCR擴(kuò)增儀（Roche公司，瑞士），電泳槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、制膠器（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 hPDLCs的原代培養(yǎng)和鑒定

取11～16歲青少年因正畸而拔除的健康前磨牙，并簽署患者知情同意書。采用組織塊法原代培養(yǎng)hPDLCs，使用α-MEM培養(yǎng)液（含15%FBS，100 U·mL-1青霉素，100 U·mL-1鏈霉素）進(jìn)行原代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞爬片，對其進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白的免疫組織化學(xué)染色，鑒定細(xì)胞來源。

1.3 hPDLCs體外培養(yǎng)——力學(xué)刺激模型的構(gòu)建

選擇傳至第3代的牙周膜細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化和細(xì)胞計(jì)數(shù)，將接種密度調(diào)整到1×105·mL-1后接種至BioFlex培養(yǎng)板，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～2 d，待細(xì)胞達(dá)80%以上融合時(shí)，用低血清濃度（含體積分?jǐn)?shù)為3%的胎牛血清）的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。利用多通道應(yīng)力加載系統(tǒng)對細(xì)胞分別施加1、3、6、12、24 h頻率為0.5 Hz、振幅為10%的張應(yīng)力，每一循環(huán)包括1 s拉伸和1 s松弛，以此作為加力組；對照組（不加力組）細(xì)胞放在同一培養(yǎng)箱內(nèi)不加力（即加力0 h）。收集2組細(xì)胞用于后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)。

1.4 ERK1/2通路特異性抑制劑U0126的應(yīng)用

將hPDLC分為3組，對照組采用只添加DMSO的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，不加力；加力組用只添加DMSO的培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后，加力3 h；加力抑制組，首先將U0126抑制劑溶解于DMSO中，制備成濃度為100 mmol·L-1的U0126儲存液，然后將U0126儲存液按照一定比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，使其終濃度為20 μmol·L-1，放入培養(yǎng)箱中孵育1 h后，加力3 h。收集各組細(xì)胞用于后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)。

1.5 DN-ERK1/2的轉(zhuǎn)染

hPDLC以每孔1×105個(gè)接種于六孔板，分為3組：感染慢病毒空載體組（LV-NC組）、感染DNERK1/2重組病毒組（LV-dnERK1/2組）、正常細(xì)胞組。

LV-NC組、LV-dnERK1/2組：分別取LV-NC和LV-dnERK1/2慢病毒原液1 mL，按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值為100的比例加入細(xì)胞中，12 h后棄掉病毒液更換新鮮培養(yǎng)液，每隔2 d換一次培養(yǎng)液。正常細(xì)胞組加入培養(yǎng)液作為對照。1周后利用熒光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

轉(zhuǎn)染成功后LV-NC組、LV-dnERK1/2組再各分為2個(gè)小組，一組加力3 h（LV-NC/加力組，LV-dnERK1/2/加力組），另一組不加力（LV-NC/靜止組，LV-dnERK1/2/靜止組）。收集各組細(xì)胞用于后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)。

1.6 real-time PCR檢測成骨基因Runx2、OCN和BSP的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞，提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照TAKARA公司的說明書提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測量RNA的濃度和純度，利用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將得到的反應(yīng)液加入到real-time PCR的反應(yīng)體系中，再利用各個(gè)基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測Runx2、OCN和BSP mRNA的表達(dá)情況。GAPDH作為管家基因。結(jié)果采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因各自的相對表達(dá)量。各因子的引物序列見表1。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測目的蛋白表達(dá)水平

每組蛋白樣本來源的細(xì)胞約為3×106個(gè)，每組細(xì)胞樣本加入200 μL細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，低溫離心，獲取全蛋白上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎枚量伤幔╞icinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。各組取等量蛋白樣品上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），將電泳分離后的蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h，然后分別加入稀釋的Runx2（1∶500）、ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）的單克隆抗體4 ℃過夜孵育，漂洗后加入TBS稀釋的辣根酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫下?lián)u動(dòng)反應(yīng)2 h。實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參照，對圖像進(jìn)行分析并計(jì)算相對灰度值。

表1 reaI-time PCR各基因引物序列Tab l Primers of genes used in real-time PCR

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)的組織塊約10 d有hPDLCs從組織塊邊緣爬出，3～4周爬滿瓶底。傳代培養(yǎng)的hPDLCs呈長梭形或紡錘形，胞核為圓形或卵圓形，具有成纖維細(xì)胞特性。hPDLCs免疫組織化學(xué)結(jié)果為波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證實(shí)所獲的細(xì)胞來源于中胚層（圖1）。

2.2 牙周膜細(xì)胞體外培養(yǎng)——力學(xué)刺激模型的構(gòu)建

不同加力時(shí)間下各組蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果見圖2、3。與不加力組相比較，加力組的p-ERK1/2蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），其中以加力1 h和3 h最高（P＜0.01）；ERK1/2蛋白總量（t-ERK1/2）無顯著變化（P＞0.05）；Runx2蛋白水平在加力3 h和6 h時(shí)顯著升高（P＜0.01），12 h時(shí)顯著降低（P＜0.05）。這表明，周期性牽張力作用下可以激活牙周膜成纖維細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2通路。

圖1 hPDLCs的體外培養(yǎng)與鑒定 倒置顯微鏡Fig 1 The culture and identification of hPDLCs inverted microscope

圖2 Western blot檢測不同加力時(shí)間下各組ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)Fig 2 Western blot detected the protein level of ERK1/2 and p-ERK1/2 in every group for different time points

圖3 Western blot檢測不同加力時(shí)間下各組Runx2蛋白表達(dá)Fig 3 Western blot detected the expression of Runx2 protein in every group for different time points

不同加力時(shí)間下各組基因表達(dá)的real-time PCR檢測結(jié)果見圖4。Runx2 mRNA水平在加力1 h后即開始升高，在加力3 h后達(dá)到峰值，隨后開始下降，12 h后表達(dá)低于對照組，24 h再次呈現(xiàn)升高趨勢。OCN mRNA表達(dá)在1～6 h期間升高緩慢，12 h達(dá)到峰值，24 h有所下降。BSP mRNA表達(dá)隨加力時(shí)間延長而增加，具有明顯的時(shí)間正相關(guān)性。

圖4 real-time PCR檢測不同加力時(shí)間下各組Runx2、OCN和BSP mRNA表達(dá)Fig 4 real-time PCR detected the mRNA level of Runx2, OCN and BSP in every group for different time points

2.3 U0126阻礙hPDLC在周期性牽張力下的成骨分化

Western blot及real-time PCR檢測結(jié)果（圖5）顯示，加力抑制組和對照組的Runx2、OCN、BSP基因水平及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平低于加力組（P＜0.01）；加力抑制組的Runx2基因水平高于對照組（P＜0.05），OCN、BSP基因水平與對照組無顯著差異（P＞0.05）。這表明，U0126阻礙牙周膜成纖維細(xì)胞在周期性牽張力下的成骨分化。

2.4 DN-ERK1/2轉(zhuǎn)染抑制牙周膜成纖維細(xì)胞在周期性牽張力下的成骨分化

hPDLCs轉(zhuǎn)染慢病毒空載體LV-NC和重組慢病毒載體LV-dnERK1/2 1周后，熒光顯微鏡下可見陽性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胞漿發(fā)出綠色熒光，陽性轉(zhuǎn)染比例為70%～80%（圖6）。

圖5 U0126對hPDLC周期性牽張力作用下成骨分化的影響Fig 5 Effect of U0126 on the osteogenic differentiation of hPDLCs under stretch stimulation

圖6 LV-NC和LV-dnERK1/2轉(zhuǎn)染hPDLCs × 100Fig 6 hPDLCs transfected by LV-NC and LV-dnERK1/2 × 100

Western blot及real-time PCR檢測結(jié)果（圖7）顯示，LV-NC/加力組的Runx2、OCN、BSP基因水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均高于LV-dnERK1/2/加力組、LV-NC/靜止組、LV-dnERK1/2/靜止組（P＜0.05），而其他三組之間均無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 DN-ERK1/2轉(zhuǎn)染對hPDLC周期性牽張力作用下成骨分化的影響Fig 7 Effect of DN-ERK1/2 transfected on the osteogenic differentiation of hPDLCs under stretch stimulation

3 討論

牙周組織的改建離不開機(jī)械力的刺激作用。hPDLCs具有一定程度的成骨細(xì)胞的特征，在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下具有礦化能力，可形成礦化的細(xì)胞外基質(zhì)。作為牙周膜的主要成分，hPDLCs在感受外界的力學(xué)刺激信號并將其轉(zhuǎn)化為生物信號的過程中發(fā)揮重要的作用[4,10]。關(guān)于機(jī)械力學(xué)信號的傳導(dǎo)一直是學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)。關(guān)于細(xì)胞對力學(xué)信號的感受方式存在兩種觀點(diǎn)[11]：1）機(jī)械力作用于細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生變化，激活細(xì)胞膜表面的黏附蛋白、整聯(lián)蛋白和鈣離子通道等，并形成級聯(lián)反應(yīng)，將信號逐級向下游傳遞；2）機(jī)械力使細(xì)胞骨架發(fā)生變化，促使細(xì)胞對細(xì)胞骨架內(nèi)的張力重新分布，從而實(shí)現(xiàn)了力信號向化學(xué)信號的轉(zhuǎn)化。目前學(xué)者們一致認(rèn)為，力學(xué)信號的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式在很大程度上依賴于組織細(xì)胞的種類和力學(xué)刺激的類型。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）是一類具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶超家族[12]。ERK1/2作為MAPK的成員之一，在力學(xué)信號的傳遞中起著重要作用。研究[11,13]表明，機(jī)械力刺激可以通過整聯(lián)蛋白和鈣離子通道途徑激活ERK1/2通路，促使成骨細(xì)胞分化。本研究應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測ERK1/2激活后的磷酸化形式p-ERK1/2，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在加力后顯著升高，尤其以1 h和3 h加力組更為明顯。這一研究結(jié)果提示，hPDLCs在應(yīng)力刺激下ERK1/2通路被激活。

目前，對ERK1/2功能的研究主要是通過加入干預(yù)因素過度激活或者抑制ERK1/2的磷酸化，從而研究其下游靶基因的相應(yīng)變化[14]。本實(shí)驗(yàn)通過分別使用ERK1/2通路的阻斷劑U0126和過表達(dá)顯性負(fù)相基因DN-ERK1/2從而達(dá)到對ERK1/2通路活化的抑制[15-16]。DN-ERK1/2是ERK1/2的基因變異體（T192A或Y194F），可以永久性抑制ERK1/2在T192和Y194位點(diǎn)上發(fā)生磷酸化而成為活化的p-ERK1/2，因而被廣泛應(yīng)用于ERK1/2的功能研究中[17]。

real-time PCR結(jié)果顯示在不同的加力時(shí)間下，成骨細(xì)胞表型基因OCN和BSP的mRNA水平也有升高，提示機(jī)械力刺激激發(fā)了hPDLCs成骨分化的潛力。通過使用抑制劑U0126對ERK1/2通路實(shí)施特異性的阻斷后，發(fā)現(xiàn)以上基因的表達(dá)均下降；而過表達(dá)ERK1/2的顯性負(fù)相基因DN-ERK1/2也相應(yīng)地阻斷了上述基因的表達(dá)在應(yīng)力刺激下的升高，這進(jìn)一步證實(shí)ERK1/2通路的活化參與了應(yīng)力刺激下hPDLCs的成骨分化。Miraoui等[18]研究認(rèn)為，成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化也是通過ERK1/2通路介導(dǎo)的，并且DN-ERK1/2過表達(dá)抑制了FGF對成骨分化的促進(jìn)作用，這與本研究結(jié)果相一致。另外，韓悅等[19]發(fā)現(xiàn)ERK1/2通路還參與了張應(yīng)力刺激下牙周膜細(xì)胞的增殖。結(jié)合當(dāng)前研究結(jié)果，筆者推測ERK1/2是牙周膜細(xì)胞感受應(yīng)力刺激、發(fā)生增殖和分化的重要分子激酶途徑。

Runx2是骨發(fā)育和骨改建的重要調(diào)控基因，參與了間充質(zhì)細(xì)胞系向成骨細(xì)胞系的定向分化，并抑制其向軟骨細(xì)胞系的分化[20]。Ziros[21]研究證實(shí)，具有成骨樣特征的hPDLCs中Runx2是力學(xué)信號的靶蛋白，在機(jī)械力的刺激下可以顯著提升Runx2的基因和蛋白的表達(dá)，并通過凝膠滯留移動(dòng)實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）發(fā)現(xiàn)，在機(jī)械拉伸30 min后能探測到Runx2與成骨細(xì)胞特異性元件OSE2的結(jié)合，6 h后達(dá)峰值。本研究結(jié)果也顯示：Runx2的基因水平在1 h加力組即有升高，并在3 h達(dá)到峰值，而相應(yīng)的Runx2蛋白在3 h和6 h表達(dá)最高。在加力3 h組的細(xì)胞進(jìn)行U0126預(yù)處理后，Runx2的基因和蛋白水平較單純加力組下降，提示ERK1/2通路可能參與了對Runx2的調(diào)控過程。綜上所述，筆者推測在周期性牽張力作用下，hPDLCs的成骨分化過程可能是通過ERK通路的激活，繼而引起下游靶基因Runx2表達(dá)的升高，并促使Runx2與成骨基因（BSP，OCN）上的啟動(dòng)子結(jié)合，激活這些基因的轉(zhuǎn)錄過程。

臨床上由于牙齒缺失導(dǎo)致的牙槽骨萎縮是牙周組織在缺乏咬合力刺激下發(fā)生退行性改變的重要表現(xiàn)。本研究利用振幅10%、頻率0.5 Hz的周期性牽張力模擬口腔環(huán)境中的咬合力，對體外培養(yǎng)的hPDLCs施加力學(xué)刺激，初步證實(shí)ERK1/2通路參與了張應(yīng)力作用下牙周膜細(xì)胞的成骨分化，并且可能由其下游因子Runx2介導(dǎo)，但其確切的分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步的深入研究。

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（本文編輯 李彩）

The role of extracellular signal regulated kinase 1/2 in mediating osteodifferentiation of human periodontal ligament cells induced by cyclic stretch

Song Jing1, Ren Dapeng2, Yan Shiguo1, Lan Jing1, Yuan Xiao2,3, Guo Qingyuan3, Qi Xiangmin1. (1. Stomatology Hospital of Shandong University, Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Biomedicine, Jinan 250012, China; 2. Stomatology College of Qingdao University; Dept. of Orthodontics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China; 3. Dept. of Orthodontics, Stomatological Center, The Affiliated Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266075, China)
Supported by: National Natural Science Foundation of China (31170891); Key Fund of Shandong Provincial Health Bureau(2011HD001). Correspondence: Qi Xiangmin, E-mail: qidoc105@sdu.edu.cn.

Objective This study aimed to investigate the mechanism of cyclic stretch that promotesthe osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells (hPDLCs) through the mediation of extracellular-signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2). Methods hPDLCs were isolated throughthe explant method and cultured in vitro. hPDLCs were mechanically stimulated by a multi-channel cell-stress-loading system for 1, 3, 6, 12, and 24 h. The magnitude of stretch was 10% deformation, and the frequency was 0.5 Hz. Nonloaded cells were used as control group. ERK1/2 activation was blocked by U0126,a specific ERK1/2 pathway inhibitor. Additionally, hPDLCs were transfected with adenoviral vector encoding dominant negative ERK1/2 (DN-ERK1/2) to continuouslyinhibit ERK1/2 activation. The mRNA and protein levels of target geneswere detected through real-time polymerase chain reaction and Western blot. Results Cyclic stretching promoted the expression of ERK1/2, osteocalcin (OCN) mRNA, and bone sialoprotein(BSP) mRNA. The expression of runt-related transcription factor (Runx) 2 protein and mRNA also increased at 3 and 6 h of cyclic stretching. The inhibition of ERK1/2 by U0126 and DN-ERK1/2 suppressed the expressionof Runx2 mRNA,OCN mRNA, BSP mRNA, Runx 2 protein, and p-ERK1/2 protein relative to that in stretched cells without the ERK1/2 inhibitor. Conclusion ERK1/2 is a critical molecule in the mediation ofthe osteogenic differentiation of hPDLCs under mechanical stimulation. ERK1/2 activation induced the elevation of Runx2 protein levels, which may be involved in the stretch-induced expressions of OCN and BSP.

periodontal ligament cells; osteogenic differentiation; cyclic stretch; extracellular signal regulated kinase 1/2

Q 254

A

10.7518/hxkq.2017.05.015

2016-08-11；

2016-12-09

國家自然科學(xué)基金（31170891）；山東省衛(wèi)生廳重點(diǎn)基金（2011HD001）

宋京，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：jinglydentist@163.com

戚向敏，教授，碩士，E-mail：qidoc105@sdu.edu.cn