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    基于大豆粕酶解物美拉德反應(yīng)制備咸味香精的研究

    2017-10-18 04:00:59鄭家倫李晨陸利霞熊曉輝
    中國調(diào)味品 2017年10期
    關(guān)鍵詞:水解酶解液香精

    鄭家倫,李晨,陸利霞,熊曉輝

    (南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院,南京 201611)

    基于大豆粕酶解物美拉德反應(yīng)制備咸味香精的研究

    鄭家倫,李晨,陸利霞,熊曉輝

    (南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院,南京 201611)

    實(shí)驗(yàn)以大豆粕為原料,通過酶解進(jìn)而利用美拉德反應(yīng)制備咸味香精。研究了堿性蛋白酶和復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的添加順序?qū)γ附庖盒再|(zhì)的影響。利用HPLC和GC-MS對(duì)產(chǎn)物的氨基酸組分及香氣成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明:先添加底物濃度10%的堿性蛋白酶,再添加底物濃度15%的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的酶解效果最佳,此時(shí)酶解液水解度是11.64%,還原糖含量為0.674 mg/m L,氨基氮含量為1.553 mg/m L,游離氨基酸總量達(dá)到1433.14 mg/g。從美拉德反應(yīng)液中檢測(cè)出癸醛、2-癸酮、2-己基呋喃等揮發(fā)性化合物物質(zhì),它們對(duì)肉香味的生成具有重要的作用。

    大豆粕;酶解液;美拉德反應(yīng)

    咸味香精包括豬肉香精、牛肉香精、雞肉香精、羊肉香精等具有肉制品香味的香精和各類海鮮味食用香精[1],是20世紀(jì)70年代興起的一種新型食品香精,自20世紀(jì)80年代開始,我國開始研究咸味食品香精,而20世紀(jì)90年代則是我國咸味食品香精快速發(fā)展的10年。利用美拉德反應(yīng)生產(chǎn)咸味香精是目前研究的熱點(diǎn)[2]。通過美拉德反應(yīng)制得的咸味香精比起調(diào)配制得的香精,香氣更加逼真、飽滿且醇厚感更好[3]。控制美拉德反應(yīng)的原料和反應(yīng)條件,可以產(chǎn)生不同的肉香味,以美拉德反應(yīng)為基料的香精質(zhì)量一般較好[4]。

    研究表明:水解動(dòng)物蛋白、水解植物蛋白、酵母抽提物、廢骨提取物、類脂肪質(zhì)等各種天然原料都可以作為氨基酸來源制取香精香料。植物蛋白有大豆粕、花生粕、小麥面筋和玉米面筋等。其氨基酸成本較低,且原料來源廣泛。大豆粕作為植物蛋白的主要來源,價(jià)格低廉且營養(yǎng)價(jià)值較高,符合現(xiàn)代人對(duì)于健康的需求。

    本實(shí)驗(yàn)以市售食品級(jí)大豆粕為原料,依次加入堿性蛋白酶及復(fù)合植物水解酶Viscozyme L,以此酶解得到氨基酸和還原糖。實(shí)驗(yàn)無需添加任何糖類來滿足美拉德反應(yīng)的條件。探究了兩種酶的最佳添加順序及添加量,利用液相色譜法對(duì)酶解液中的游離氨基酸進(jìn)行分析,利用GC-MS法對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行香氣成分分析,旨在為大豆粕咸味香精的開發(fā)及制備提供技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    大豆粕(食品級(jí)) 市售;Alcalase 2.4 L蛋白酶(2.4 AU-A/G),復(fù)合植物水解酶Viscozyme L(100 FEB/g)諾維信公司。

    PHS-3C p H計(jì): 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;WSC-S測(cè)色差計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 南京文爾儀器設(shè)備有限公司;紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;反應(yīng)釜、電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;氣質(zhì)聯(lián)用儀、AG1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 酶解液的制備

    大豆粕溶液中加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L,簡(jiǎn)稱V(分別為底物質(zhì)量的5%,10%,15%),55℃酶解1.5 h,煮沸滅酶后冷卻到室溫,再加入堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L,簡(jiǎn)稱A(分別為底物質(zhì)量的5%,10%,15%)60℃酶解2 h后。煮沸滅酶10 min,酶解液離心取上清液[5],噴霧干燥制得酶解液干粉。調(diào)換復(fù)合植物水解酶Viscozyme L和堿性蛋白酶的加入順序,重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。

    1.2.1.1 堿性蛋白酶水解度的測(cè)定

    計(jì)算方法依據(jù)p H-Stat法[6]。

    1.2.1.2 酶解液還原糖濃度的測(cè)定

    利用DNS法對(duì)酶解液中的還原糖進(jìn)行測(cè)定[7]。

    1.2.1.3 酶解液氨基氮含量的測(cè)定

    利用甲醛滴定法對(duì)酶解液中的氨基氮含量進(jìn)行測(cè)定[8]。

    1.2.2 氨基酸組分的測(cè)定

    采用高效液相色譜法[9],OPA和FMOC柱前衍生處理。HYPERSIL ODS(C18)色譜柱:250 mm×4.6 mm×5μm;柱溫:40℃;流速:1.0 m L/min;紫外檢測(cè)器:338 nm,262 nm(Pro,Hypro)。

    流動(dòng)相:A相為0.6 mmol/L醋酸鈉;B相為0.15 mmol/L乙酸鈉∶乙腈∶甲醇為1∶2∶2(V/V/V);流速為1 m L/min。

    流動(dòng)相:A相為稱取5.44 g結(jié)晶乙酸鈉于1000 mL燒杯中,加入1000 mL水?dāng)嚢柚镣耆芙?,再加?00μL三乙胺,攪拌并滴加5%的醋酸,將p H調(diào)到7.20±0.05,加入5 mL四氫呋喃,混合后備用。B相為稱取5.44 g結(jié)晶乙酸鈉于800 mL燒杯中;加入200 mL水?dāng)嚢柚镣耆芙?;滴?%醋酸將p H調(diào)到7.20±0.05;將此溶液加入400 mL乙腈和400 mL甲醇,混合后備用。

    氨基酸分析梯度洗脫表見表1。

    表1 氨基酸分析梯度洗脫表

    1.2.3 美拉德反應(yīng)制備

    咸味香精取1 g酶解液干粉,以水料比10∶1加水,將溶液置于反應(yīng)釜內(nèi),將反應(yīng)釜放入120℃的烘箱內(nèi)加熱1.5 h。

    1.2.4 褐變程度的測(cè)定

    將樣品分別用去離子水稀釋至一定的倍數(shù),在420 nm和294 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)420和A294,重復(fù)測(cè)定3次[10],取平均值。A420nm處的吸光值代表美拉德反應(yīng)后期棕褐色物質(zhì)的形成程度,A294nm的吸光值代表美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的形成程度。

    1.2.5 色差值的測(cè)定

    采用色差計(jì)測(cè)量反應(yīng)體系中色澤的變化[11],取1.0 m L樣品注入直徑2.5 cm的樣品槽中。本體系提供3種顏色屬性,其中L*(光度,正值白,負(fù)值黑),a*(正值紅,負(fù)值綠),b*(正值黃,負(fù)值藍(lán))。以水為參照,計(jì)算相應(yīng)參數(shù):飽和度C=(a2+b2)1/2;總色差ΔE=(ΔL2+Δa2+Δb2)1/2。

    1.2.6 頂空固相微萃取

    提取揮發(fā)性成分在20 m L的頂空瓶中裝入5 m L大豆粕咸味香精,將頂空瓶放入55℃恒溫水浴中平衡30 min,再將已老化好的SPME針頭插入樣品瓶中,用手柄將石英纖維頭暴露到頂空氣體中萃取30 min后,用手柄使纖維頭推回到針頭內(nèi)拔出針頭,將吸附了分析組分的萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣器中,使待測(cè)組分解吸,進(jìn)入GC-MS進(jìn)行分離與分析[12]。

    1.2.7 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析

    1.2.7.1 氣相色譜條件

    色譜毛細(xì)管柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25μm);載氣為He,流速1.8 m L/min;不分流;程序升溫,起始溫度40℃,保持3 min,以5℃/min的速率升溫到80℃,以10℃/min的速率升溫到160℃,保持0.5 min,以2℃/min的速率升溫到175℃,后以10℃/min的速率升溫到230℃,最后在230℃保持7 min;汽化室溫250℃[13]。

    1.2.7.2 質(zhì)譜條件

    EI電離源,電子能量70 e V,燈絲發(fā)射電流35μA,離子源溫度200℃,接口溫度250℃,檢測(cè)器電壓350 V,掃描質(zhì)量范圍35~450 m/z。

    1.2.7.3 揮發(fā)性化合物的鑒定

    以1.00 mg/m L 1,2-二氯苯甲醇為內(nèi)標(biāo),確定揮發(fā)性化合物含量。根據(jù)GC-MS分析對(duì)大豆粕咸味香精中揮發(fā)性化合物鑒定,將分離出的化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫相匹配[14]。

    1.2.8 感官評(píng)定

    通過鮮味溶液來進(jìn)行評(píng)定[15],鮮味溶液由1.0%MSG和0.5%食鹽配制而成。各美拉德反應(yīng)液按0.5%的比例加入鮮味溶液中,60℃恒溫水浴加熱10 min,進(jìn)行感官評(píng)定。由經(jīng)訓(xùn)練過的有咸味風(fēng)味劑評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的6位感官評(píng)定員(3男3女)根據(jù)所提供的評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)定,打分采用7分制,將麥芽糊精的對(duì)照溶液設(shè)定為3分,分值越大表明作用效果越強(qiáng)。

    1.2.9 數(shù)據(jù)分析

    采用Microsoft Excel 2013和Matlab進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 12.0進(jìn)行顯著性分析(顯著性水平為p<0.05或者p<0.01)、本研究中所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都進(jìn)行了平行實(shí)驗(yàn),游離氨基酸分布和GC-MS揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析平行測(cè)定2次,色差值、褐變程度、感官評(píng)定平行測(cè)定3次。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 水解度測(cè)定

    圖1 先加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L后加堿性蛋白酶水解度

    圖2 先加堿性蛋白酶后加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L水解度

    由圖1和圖2可知,隨著糖酶5%,10%,15%的不斷增大,酶解液的水解度并無顯著性增加,因此糖酶加入的多少并不影響水解度的大小。而堿性蛋白酶從5%增加到10%時(shí),水解度有明顯的增加,而從10%增加到15%時(shí)并無顯著增加,可能是因?yàn)榧尤?0%底物濃度的堿性蛋白酶時(shí)已將酶解液中的蛋白質(zhì)基本水解成氨基酸,從而再加入更多的堿性蛋白酶效果并不顯著。由圖1和圖2還可知,先加入堿性蛋白酶后加入糖酶的樣品比先加入糖酶后加入堿性蛋白酶的樣品有更好的水解度。

    2.2 還原糖的測(cè)定

    圖3 先加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L后加堿性蛋白酶還原糖含量

    圖4 先加堿性蛋白酶后加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L還原糖含量

    由圖3和圖4可知,堿性蛋白酶的加入對(duì)大豆粕酶解液還原糖含量并無顯著性差異影響。而隨著復(fù)合植物水解酶Viscozyme L 5%,10%,15%的不斷增加,還原糖含量不斷增加,復(fù)合植物水解酶Viscozyme L從5%到10%還原糖含量增加迅速,從10%增加到15%時(shí)的幅度不大,可見還原糖含量隨糖酶增加的速率變緩。同時(shí),由圖3和圖4還可知,先加入堿性蛋白酶后加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品的還原糖含量要高于同樣條件下先加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L后加入堿性蛋白酶的樣品。

    2.3 氨基氮含量測(cè)定

    圖5 先加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L后加堿性蛋白酶氨基氮含量

    圖6 先加堿性蛋白酶后加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L氨基氮含量

    由圖5和圖6可知,增加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的加入量對(duì)氨基氮含量并無顯著差異影響。而堿性蛋白酶對(duì)大豆粕酶解液氨基氮含量存在顯著性差異。堿性蛋白酶從5%增加到10%時(shí),氨基氮含量有明顯的增加,而從10%增加到15%時(shí)增加不明顯,和水解度基本保持一致。由圖5和圖6可知,先加入堿性蛋白酶后加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品比先加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L后加入堿性蛋白酶的樣品氨基氮含量更高。

    2.4 游離氨基酸的測(cè)定

    從檢測(cè)出的17種氨基酸中挑選出相對(duì)含量較高的4種氨基酸,見表2。

    表2 游離氨基酸含量測(cè)定表 mg/100 g

    由表2可知,樣品中的氨基酸含量隨著堿性蛋白酶的增加而增多,且10%較5%增加明顯,15%較10%氨基酸含量增加不明顯。進(jìn)一步驗(yàn)證了加入底物濃度10%的堿性蛋白酶時(shí)酶解液中的蛋白質(zhì)可能已經(jīng)被完全分解成氨基酸。因此,繼續(xù)加入堿性蛋白酶氨基酸含量并沒有顯著的增加。其中先加入底物濃度10%的堿性蛋白酶后加入底物濃度15%的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品中游離氨基酸總量達(dá)到了最大值1433.14 mg/g,精氨酸382.93 mg/g,丙氨酸149.34 mg/g,谷氨酸160.13 mg/g,天冬氨酸97.91 mg/g均達(dá)到了最大值。

    2.5 褐變程度測(cè)定

    表3 褐變程度測(cè)定表

    420 nm和294 nm處的吸光值越高,顏色越深。由表3可知,隨著堿性蛋白酶和復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的增加,吸光值隨之增大。通過對(duì)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),酶解液的水解度和還原糖濃度對(duì)其美拉德反應(yīng)液褐變程度的影響都具有顯著性。且相比較而言還原糖濃度對(duì)美拉德反應(yīng)液褐變程度的影響更顯著。同時(shí),先加入堿性蛋白酶后加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品比先加入復(fù)合植物水解酶Viscozyme L后加入堿性蛋白酶樣品的褐變程度更深。先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品,420 nm處吸光值達(dá)到0.175,294 nm處吸光值達(dá)到0.246。

    2.6 色差值測(cè)定

    表4 樣品色差值測(cè)定表

    由表4可知,隨著堿性蛋白酶和復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的增多,美拉德反應(yīng)液的總色差越大,樣品顏色越暗,飽和度越大。通過對(duì)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),酶解液中的還原糖濃度和水解度都對(duì)美拉德反應(yīng)液的顏色具有顯著性影響。且還原糖濃度對(duì)反應(yīng)液顏色的顯著性略微比水解度的顯著性高。先加堿性蛋白酶后加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品略微比先加復(fù)合植物水解酶Viscozyme L后加堿性蛋白酶的樣品的顏色深。先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度糖酶樣品的總色差值達(dá)到68.03836,飽和度達(dá)到56.255。反應(yīng)液顏色相對(duì)不是很深,且比較飽和,同褐變程度測(cè)定的結(jié)果基本一致。

    2.7 揮發(fā)性成分分析

    表5 美拉德反應(yīng)液揮發(fā)性化合物成分(mg/m L)

    續(xù) 表

    對(duì)美拉德反應(yīng)液的香氣成分進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品檢測(cè)出來的香氣成分最多且含量相對(duì)較高。共檢測(cè)出37種香氣成分,其中4種烴類化合物(2.3%)、7種醇類化合物(20.63%)、6種酯類化合物(15.66%)、3種醛類化合物(8.61%)、5種酮類化合物(7.25%)、5種芳香族類化合物(6.03%)、1種吡嗪類化合物(1.42%)、2種呋喃類化合物(1.1%)、2種吡啶類化合物(1.15%)和2種腈類化合物(1.16%)。酯類物質(zhì)對(duì)酶解液整體的風(fēng)味具有重要的協(xié)調(diào)作用,賦予酶解液更有層次的香氣。醛類化合物是氨基酸和糖類物質(zhì)strecker降解后產(chǎn)生的斯特雷克爾醛,經(jīng)由轉(zhuǎn)胺、脫羧基反應(yīng)產(chǎn)生的。另外,呋喃、吡嗪類化合物通常具有強(qiáng)烈的肉香風(fēng)味和燒烤風(fēng)味。

    2.8 感官評(píng)定

    感官評(píng)定是在各感官評(píng)定員無顯著性差異的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,將18個(gè)樣品進(jìn)行了感官評(píng)定,然后選取了其中7種感官評(píng)定較好的樣品,具體結(jié)果見圖7。

    圖7 7種樣品的感官評(píng)定結(jié)果

    由圖7感官評(píng)定結(jié)果可知,隨著復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的不斷增加,酶解液中的還原糖含量不斷增加,導(dǎo)致美拉德反應(yīng)液的焦甜味也隨之提升。同時(shí),酶解液中的游離氨基酸越多,美拉德反應(yīng)液的醇厚感和持續(xù)性也更好。綜合各因素,感官評(píng)定員對(duì)先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品有最高的評(píng)價(jià)。其表現(xiàn)出了更強(qiáng)的鮮味、肉香味,雖然其持續(xù)性和醇厚感并不突出,但它的苦味明顯弱于其他樣品,擁有較好的呈味效果。因此綜合考慮,先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L樣品的感官評(píng)價(jià)要優(yōu)于其他樣品。

    3 結(jié)論

    實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大豆粕酶解液的水解度、還原糖含量、氨基氮含量、游離氨基酸含量等指標(biāo)的測(cè)定,確定了大豆粕的最佳酶解順序,即先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L,此時(shí)酶解效果最佳,水解度為11.64%,還原糖含量為0.674 mg/mL,氨基氮含量為1.553 mg/mL,游離氨基酸總量達(dá)到1433.14 mg/g,其中精氨酸382.93 mg/g,丙氨酸149.34 mg/g,谷氨酸160.13 mg/g,天冬氨酸97.91 mg/g,均達(dá)到了最高值。

    通過GC-MS法對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行香氣成分分析,其中先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L樣品的香氣成分更為豐富,共檢測(cè)出37種香氣成分,其中醛類、醇類、酮類、呋喃類、吡啶類等對(duì)產(chǎn)物的肉香味生成具有重要的作用。同時(shí)樣品的總色差值達(dá)到68.03836,飽和度達(dá)到56.255,其在420 nm處吸光值達(dá)到0.175,在294 nm處吸光值達(dá)到0.246。通過對(duì)各樣品進(jìn)行感官評(píng)定分析,同樣先加入10%底物濃度的堿性蛋白酶后加入15%底物濃度的復(fù)合植物水解酶Viscozyme L的樣品得到了最好的感官評(píng)價(jià),其肉香味和鮮味更為突出。

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    Research on Savory Flavoring Prepared by Maillard Reaction Based on Soybean Meal Hydrolysate

    ZHENG Jia-lun,LI Chen,LU Li-xia,XIONG Xiao-hui
    (College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 201611,China)

    The soybean meal is used as raw material to prepare savory flavoring by enzymolysis and Maillard reaction.The effects of alkaline protease and complex photolytic enzyme Viscozyme L on the property of enzymatic hydrolysate are investigated.The amino acid composition and aroma components of the product are analyzed by HPLC and GC-MS.The results show that the enzymolysis efficiency of Viscozyme L is the best when the concentration of alkaline protease is 10%and the concentration of substrate is 15%.The hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate is 11.64%,the content of reducing sugar is 0.674 mg/m L,the content of amino nitrogen is 1.553 mg/m L,and the total amount of free amino acid is 1433.14 mg/g.Volatile compounds such as decanal,2-decanone and 2-hexylfuran are detected from Maillard reaction liquid,and they have an important effect on meat flavor formation.

    soybean meal;enzymatic hydrolysate;Maillard reaction

    TS264.3

    A

    10.3969/j.issn.1000-9973.2017.10.002

    1000-9973(2017)10-0004-07

    2017-04-15

    江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(BK20150950);國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31501529)

    鄭家倫(1992-),男,碩士,研究方向:咸味香精。

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