鴨源新城疫病毒的分離與鑒定

胡曉苗 戴銀 張丹俊

摘要[目的]分離并鑒定鴨源新城疫病毒。[方法]從安徽地區(qū)鴨病料中分離新城疫病毒，測定其雞胚半數(shù)感染量（EID50）、雞胚平均致死時間（MDT）和1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）。[結(jié)果]2株新城疫病毒均為強毒。通過RT-PCR技術(shù)對這2株鴨新城疫病毒的F基因進行序列測定與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F基因裂解位點為112RRQKRF117，符合NDV強毒株裂解位點氨基酸序列。F基因遺傳進化樹分析發(fā)現(xiàn)，AH1株屬于基因Ⅶ型，而AH2株屬于基因Ⅵ型，來源于鴿源病毒。[結(jié)論]水禽新城疫病毒（NDV）的感染來源復(fù)雜，應(yīng)避免將不同種類的家禽混合飼養(yǎng)。

關(guān)鍵詞鴨；新城疫病毒；分離；鑒定；F基因

中圖分類號S855文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）22-0073-02

Abstract[Objective] To separate and identify newcastle disease virus （NDV） from duck. [Method] NDV were separated from diseased duck samples from Anhui Province and their EID50， MDT and ICPI were determined. [Result] Two strains of NDV were virulent. F gene of two strains of NDV were sequenced by RTPCR， and the results showed that the cleavage site of F gene of the viruses was 112RRQKRF117， which was accorded with the amino acid sequences of cleavage site of highlypathogenic strain of NDV. The genetic evolutionary tree analysis of F gene showed that AH1 belonged to genotype Ⅶ， but AH2 belonged to genotype Ⅵ， which was from pigeon sources. [Conclusion] The infection sources of NDV from water birds were complex， so the mixed breeding of different varieties of fowls should be avoided.

Key wordsDuck；NDV；Separation；Identification；F gene

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以感染禽類為主的一種急性、烈性傳染病，近年來鴨、鵝等水禽感染NDV并發(fā)病的病例越來越多，也越來越嚴重，給我國的水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟損失[1-4]。該病沒有明顯的流行季節(jié)，一年四季均可發(fā)生，發(fā)生該病后，日齡稍大的患病水禽并未在短時間內(nèi)大批死亡。如果有細菌等混合感染（主要是大腸桿菌病和傳染性漿膜炎），會使死亡率升高。筆者對臨床上2個疑似鴨ND病例進行了病毒分離與鑒定。

1材料和方法

1.1病料來源

2016年10月，臨床診治過程中接診到2例發(fā)病蛋鴨，臨床和解剖情況均相似。鴨群精神表現(xiàn)尚可，采食量略有下降，產(chǎn)蛋鴨的主要變化為產(chǎn)蛋率下降明顯，有軟殼蛋、畸形蛋、沙殼蛋，少數(shù)出現(xiàn)臨床癥狀。有臨床癥狀的病鴨發(fā)病初期拉白色稀糞，兩腿無力，蹲伏地面或癱瘓，其后糞便呈水樣、暗紅色或墨綠色；食欲減退、少食或拒食，飲欲增加，有的病鴨呼吸道發(fā)出“呼?！甭?，出現(xiàn)張口呼吸、甩頭、咳嗽等呼吸道癥狀。使用頭孢類、丁胺卡那霉素等多種抗生素治療，效果不明顯。剖檢病死鴨沒有典型的病理變化，可見肝臟充血、出血，盲腸扁桃體出血，腸道黏膜出血，氣管內(nèi)黏稠分泌物。采集發(fā)病鴨的氣管、肝臟、腦、脾臟、胰腺等病料，用于分離與鑒定。

1.2試劑

SPF種蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，由安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)臨床診斷中心孵化至9～11日齡；NDV標準陽性血清、禽流感病毒（H5、H7、H9亞型）標準陽性血清、減蛋綜合征（EDS）陽性血清，均購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；RNA提取試劑TRIzol，購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP、Taq-DNA，均購自大連TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自GeneMark公司；特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預(yù)計擴增產(chǎn)物大小約900 bp；青霉素10 000 U/mL，鏈霉素10 mg/mL，慶大霉素和卡那霉素均為250 μg/mL。

1.3病毒分離與血清學鑒定

將采集的鴨病料按1∶5的比例加入四抗（青霉素、鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素）溶液，在組織研磨器中研磨，制備組織勻漿。反復(fù)凍融3次，將勻漿轉(zhuǎn)移到滅菌的離心管中，置于臺式高速離心機中10 000 r/min離心5 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另一滅菌離心管中，用等體積的四抗溶液稀釋，再置于臺式高速離心機中10 000 r/min離心5 min，吸取上清液，接種10日齡SPF雞胚0.2 mL/個，各3個。收集24 h后死亡的雞胚尿囊液，通過血凝試驗（HA）測定其血凝效價，HA檢測結(jié)果呈陰性的胚液繼續(xù)傳代，每代都檢測HA結(jié)果，到第3代若收獲的尿囊液仍為陰性，則應(yīng)棄去。HA陽性的尿囊液分別用禽流感病毒的H5、H7、H9亞型標準陽性血清、ND標準陽性血清以及EDS陽性血清進行血凝抑制試驗（HI）[5]。

1.4病毒毒力指標的測定

用滅菌生理鹽水分別連續(xù)10倍（從10-4到10-9）遞增稀釋分離毒株，每個稀釋度接種5枚10日齡SPF雞胚，37 ℃孵育5 d，記錄雞胚的死亡情況，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，收集其余雞胚的尿囊液，通過紅細胞凝集試驗（HA）檢測尿囊液效價，若HA的效價大于等于4判為陽性。采用Reed-Muench方法計算各毒株的雞胚半數(shù)感染量（EID50），按照文獻[6]的方法計算病毒的雞胚平均致死時間（MDT）；根據(jù)測定的不同毒株的EID50和MDT，選擇不同毒力的代表毒株測定1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI），將純化的病毒用滅菌生理鹽水稀釋10倍，腦內(nèi)接種1日齡SPF雛雞，攻毒劑量為0.05 mL/只，每個毒株接種10只，按文獻[6]的方法計算病毒的ICPI。

1.5病毒F基因的擴增與序列測定

參照GenBank中發(fā)表的鴨新城疫病毒F基因序列，應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計1對引物，用于擴增F基因，預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為900 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物P1為5′-CGTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA-3′，下游引物P2為5′-CAGGTAGGTRGCACGCATATTATT-3′（R=G/A）。按照試劑盒說明書抽提病毒RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用PCR擴增分離病毒的F基因，PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)Gel Extrac-lion Mini Kit試劑盒回收純化后送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

1.6病毒F基因序列分析

采用DNAStar 4.0版本中的EditSeq和MegAlign進行病毒F基因序列分析，分析多肽裂解位點氨基酸序列；使用NCBI網(wǎng)站提供的BLAST程序，與 GenBank 上發(fā)表的NDV基因組序列進行同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析，使用MEGA 5.0分析軟件進行系統(tǒng)進化樹的繪制和遺傳進化分析。

2結(jié)果與分析

2.1病毒分離與鑒定

從發(fā)病鴨中分離有血凝性的病毒，接種病毒的雞胚48 h就開始出現(xiàn)死亡。該病毒能被新城疫陽性血清中和，血凝抑制效價在25以上，對禽流感（H7、H5、H9亞型）和EDS陽性血清呈陰性，確定分離病毒為NDV。

2.2病毒毒力測定

由表1可知，2株病毒的3個毒力指標（EID50、MDT和ICPI）按照毒力判斷標準均符合強毒力的特點，表明2株分離的新城疫病毒株為強毒株。

2.3病毒F基因的RT-PCR擴增

利用設(shè)計的引物對2株鴨NDV尿囊液提取的RNA進行RT-PCR擴增，得到1條大小約900 bp的特異性擴增條帶，與預(yù)期設(shè)計的擴增片段大小相符（圖1）。

2.4F蛋白裂解位點分析

2株病毒AH1和AH2多肽裂解位點氨基酸組成為112RRQKRF117，具有NDV強毒株的典型分子特征，表明2株分離的新城疫毒株為強毒株，與MDT、ICPI等毒力指標的測定結(jié)果相符。

2.5F基因系統(tǒng)進化樹分析

從圖2可以看出，AH1和AH2均與LaSota、F48E9、V4等傳統(tǒng)毒株的的遺傳距離較遠，AH1與近年來流行毒株的基因型一致，為Class Ⅱ 系列中的Ⅶ型；AH2與鴿源毒株的遺傳距離較近。

3結(jié)論

（1）傳統(tǒng)觀點認為，新城疫病毒對雞的致病性較高，對鴨、鵝等水禽雖然感染但不發(fā)病，無明顯的臨床癥狀和剖檢變化。但是，近年來NDV對于水禽表現(xiàn)出較高的致病性。該試驗中分離的2株病毒的MDT分別為51.6和49.8 h（強毒株的MDT為40～60 h），ICPI分別為1.72和1.69（強毒株的ICPI≥1.6）；測序結(jié)果表明，分離的2株鴨NDV裂解位點區(qū)的氨基酸序列均為112R-R-Q-K-R-F117，與強毒株相應(yīng)的氨基酸序列相符合。因此，判定這2株鴨源NDV分離株均為強毒株。

（2）由于AH1和AH2均與LaSota、F48E9、V4等傳統(tǒng)毒株的的遺傳距離較遠，傳統(tǒng)疫苗難以有效保護免疫鴨免受NDV的感染；由于AH1與近年來流行毒株的基因型同為Class Ⅱ 系列中的Ⅶ型，因此可用新城疫（ND）的Ⅶ型疫苗進行免疫。AH2為Class Ⅱ 系列中的Ⅵ型，來源于鴿源病毒，說明水禽NDV的感染來源復(fù)雜，因此應(yīng)避免將不同種類的家禽混合飼養(yǎng)，以減少NDV的中間傳播。

參考文獻

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