高寒草地土壤細(xì)菌對(duì)放牧梯度的響應(yīng)

趙輕舟　余志晟

摘要放牧作為影響土壤微生物群落的重要因素，對(duì)土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)、活動(dòng)、生存具有重要的影響。青藏高原地區(qū)放牧是主要的草地利用方式，而放牧條件改變引起的生境變化成為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性變化的關(guān)鍵因子。目前關(guān)于放牧對(duì)草地土壤微生物多樣性影響的結(jié)論并不統(tǒng)一。采用Hiseq高通量測(cè)序?qū)Ψ拍撂荻认挛鞑馗咴湫透吆莸赝寥兰?xì)菌群落進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：不同放牧梯度下土壤細(xì)菌的物種多樣性在中度放牧下最高，而均勻度沒有顯著變化。其優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度隨放牧強(qiáng)度表現(xiàn)出顯著差異，其中Pseudonocardia、Sporosarcina、Thermomonas相較于中-弱放牧梯度在強(qiáng)放牧強(qiáng)度下相對(duì)豐度增大，而Rhodoplanes、Microlunatus在強(qiáng)放牧作用下相對(duì)豐度表現(xiàn)為減小。門水平上細(xì)菌類群間相關(guān)性隨放牧梯度而變化，且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和位置在不同放牧強(qiáng)度下顯示出顯著差異。

關(guān)鍵詞微生物多樣性；草地土壤；人工放牧

中圖分類號(hào)S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）22-0078-05

AbstractAs the key factors to soil microbial community，grazing influents the growth，activities and survival of soil bacteria significantly.Grazing is the premier land use pattern of Tibetan Plateau and the habitat condition transform caused by livestock grazing in Tibet turns into the key factor influent grassland soil bacteria structure and diversity.Previous researchs about the response of soil bacteria diversity to grazing were various in different grassland.The diversity and composition of the alpine grassland soil bacteria was investigated in the dual gradient of grazing with Hiseq highthroughput sequencing.The results were demonstrated as the followed：The moderate grazing increased the species richness in moderate intensity contrast to high and low grazing

intensity while the evenness of soil bacteria showed no significant change with grazing gradient.The relative abundance of dominant species showed discrepancy with various grazing intensity.Pseudonocardia，Sporosarcina，Thermomonas increased while Rhodoplanes，Microlunatus decreased in high grazed gradient than moderatlow grazed gradient.The correlation of primary phyla change with various grazing intensity and the structure and composition of soil bacteria also demonstrated the dissimilarities among heavy，moderate and low grazed gradient.

Key wordsMicrobial diversity；Grassland soil；Artificial grazing

青藏高原被稱為地球“第三極”，是世界上最高的高原地區(qū)（位于海平面4 000 m以上），具有低溫、干旱及強(qiáng)日照等特點(diǎn)，其草地生態(tài)系統(tǒng)由于當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件及地球化學(xué)分布情況而變得較為脆弱和敏感，各驅(qū)動(dòng)因子對(duì)其土壤微生物影響尤為強(qiáng)烈[1]。

放牧作為草地主要人為利用方式，在西藏展開普遍，并且西藏地區(qū)存在大量無系統(tǒng)放牧，包含連續(xù)放牧、固定放牧，導(dǎo)致放牧過程中牲畜對(duì)草地、土壤影響加劇。進(jìn)入21世紀(jì)，西藏地區(qū)草地由于放牧作用導(dǎo)致退化日益嚴(yán)重，其中地處藏北的那曲地區(qū)和藏西的阿里地區(qū)草地退化情況而變得較為嚴(yán)重，退化面積分別達(dá)到51.28%和43.15%[2]。

土壤微生物對(duì)草地的放牧擾動(dòng)十分敏感，放牧的啃食、踐踏、排泄等作用引起的生境變化對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性產(chǎn)生顯著響應(yīng)[3-4]。

人工放牧作為最為典型的人為干擾因素，得到廣泛的研究，高寒、干旱區(qū)域?qū)τ谒趾头拍磷饔玫捻憫?yīng)尤為顯著。然而當(dāng)前各研究關(guān)于土壤微生物對(duì)放牧響應(yīng)的結(jié)果并不統(tǒng)一。放牧對(duì)草地土壤的影響可分為短期和長(zhǎng)期效應(yīng)，不同放牧?xí)r間尺度下微生物群落變化差異較大。這是由于在短期尺度上，放牧的刺激增加了植物分泌物以及食草動(dòng)物的糞尿排泄，輸入的糞尿可增加微生物的呼吸、礦化作用與微生物量[5]；在長(zhǎng)期尺度上，放牧通過改變植物群落組成與凈初級(jí)生產(chǎn)力影響對(duì)土壤碳的輸入[6]。而特定空間尺度下放牧作用的研究較為缺乏。

基于以上背景，筆者研究了西藏高原典型高寒草地土壤細(xì)菌群落對(duì)由地上生物量與優(yōu)勢(shì)物種變化表征的放牧梯度的響應(yīng)，以探究在西藏地區(qū)這一干旱、寒冷、強(qiáng)日照環(huán)境下的小空間尺度下，人工放牧這一典型干擾因素引起的脅迫對(duì)高寒草地土壤細(xì)菌多樣性的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)樣地選擇試驗(yàn)樣地建立于西藏班戈觀測(cè)點(diǎn)。班戈觀測(cè)點(diǎn)位于西藏自治區(qū)那曲地區(qū)班戈縣普保鎮(zhèn)東北方向約10 km處（90°02′12″E、31°26′36″N，樣地平均海拔4 768 m），該觀測(cè)點(diǎn)地處南羌塘高原湖盆區(qū)域，屬于高原亞寒帶季風(fēng)半干旱氣候區(qū)，其土壤類型為寒冷鈣土（高山草原土）。研究區(qū)為高寒草原，以紫花針茅（Stipapurpurea）為建群種，伴生有弱小火絨草（Leontopodium pusillum），其余主要物種為青藏狗娃花（Heteropappus bowerii）、平臥軸藜（Axyrisprostrat）、中亞早熟禾（Poalitwinowiana）等雜類草，樣地植被群落蓋度較低。所選研究區(qū)為典型高寒草原草地，位于較為平緩的山坡之上，坡度約為5.5°。

1.2樣點(diǎn)設(shè)置與樣品采集

1.2.1放牧梯度。試驗(yàn)樣點(diǎn)設(shè)置于放牧與水分雙重梯度。于2014年8月進(jìn)行采樣，依照樣地地上植物生物量與地上植被優(yōu)勢(shì)物種的變化將樣地分別劃分為3個(gè)放牧梯度（HG、MG和 LG），放牧強(qiáng)度隨著與牧戶距離的增加逐漸顯著減小，同時(shí)各梯度的優(yōu)勢(shì)物種依次變化為紫花針茅、弱小火絨草和藏嵩草。

1.2.2土壤樣品采集。

各放牧梯度均取5個(gè)平行樣品，總樣點(diǎn)數(shù)設(shè)置為15個(gè)。試驗(yàn)于各重復(fù)樣點(diǎn)設(shè)置1 m×1 m樣方，每個(gè)樣方以3 cm直徑土鉆獲取樣方4角及中心的5個(gè)土壤樣品，每份土壤樣品鉆取0～20 cm深度土壤后混勻。土壤樣品通過2 mm土篩篩取以去除根、草和沙石進(jìn)行前處理，以冰盒保藏進(jìn)行運(yùn)輸。隨后至試驗(yàn)分析前，在-80 ℃冰箱中貯存。

1.3土壤和植物的理化分析

1.3.1土壤含水量。

取 10 g 鮮土樣品置于鋁盒中稱重，精確至0.01 g。在烘箱中以105 ℃將土壤烘烤12 h至恒重，移入干燥器冷卻至室溫，依據(jù)失水的質(zhì)量與土壤質(zhì)量比值計(jì)算土壤含水量[5]。

1.3.2土壤總氮。每個(gè)樣品稱取大約10 g的風(fēng)干土，裝入100 mL的塑料方瓶中，加入50 mL 2 mol/L KCl 溶液于塑料方瓶中，將裝有土壤與KCl混合液的瓶子置于恒溫振蕩器中振蕩 1 h。將振蕩后的溶液用濾紙過濾，最后得到的上清液用流動(dòng)分析儀測(cè)定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。

1.3.3土壤有機(jī)碳含量（TOC）。

TOC 含量用重鉻酸鉀-硫酸氧化方法分析（Nelson and Sommers 1982）。操作步驟如下： 將風(fēng)干土樣過0.50 mm篩孔篩取，稱取2.000 0 g（精確至0.000 1 g）土樣，置于500 mL的錐形瓶中，將10.00 mL重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液加入，輕輕搖動(dòng)，使土粒分散。隨后用量筒迅速將20 mL硫酸注入至土樣懸浮液中，小心搖晃錐形瓶，令土樣和試劑充分混勻，并較為劇烈地轉(zhuǎn)動(dòng)，前后搖動(dòng)共1 min。

將錐形瓶靜置于石棉板上30 min（室溫20 ℃以上），隨后加入200 mL水和3～4滴鄰菲啰啉指示劑，用硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以溶液由橙黃色經(jīng)由藍(lán)綠色至變?yōu)樽丶t色為終點(diǎn)。

1.3.4土壤總磷。

土樣風(fēng)干后過 2 mm 篩，采用高氯酸硫酸法測(cè)定土壤全磷[7]。操作步驟如下：稱量土壤樣品1 g（精確到0.000 1），并置于50 mL三角瓶?jī)?nèi)，以少量水濕潤(rùn)，加入濃H2SO48 mL，搖動(dòng)，放置過夜，加入70%～72%高氯酸（HClO4）溶液10滴搖勻。于瓶口處放置一漏斗，置于電爐上加熱消煮直至瓶?jī)?nèi)溶液開始轉(zhuǎn)白，繼續(xù)消煮20 min，全部消煮時(shí)間總計(jì)為60 min。

將冷卻后的消煮液用水洗至100 mL容量瓶中，用水少量多次沖冼。輕輕搖動(dòng)容量瓶，待液體完全冷卻后，以水定容，使用無磷濾紙和干燥漏斗將溶液濾入干燥的100 mL三角瓶中。吸取濾液2～10 mL至50 mL容量瓶中，用水稀釋至30 mL，加入二硝基酚指示劑2滴，使用稀氫氧化鈉（NaOH）溶液和稀硫酸（H2SO4）調(diào)節(jié)pH直至溶液呈微黃色。加入鉬銻抗顯色劑5 mL，搖動(dòng)混勻，用水定容至刻度線。在室溫高于15 ℃條件下放置30 min，于分光光度計(jì)上以700 nm波長(zhǎng)比色，讀取吸光度值[7]。

1.3.5地上植物生物量。將植物樣品置于烘箱中以70°C烘烤48 h，并稱量烘干后的植物質(zhì)量。

1.4DNA提取及高通量測(cè)序

使用 MoBioPowerSoil isolation kit （MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，USA）土壤試劑盒按照其操作說明提取土壤的基因組 DNA。使用 NanoDrop ND-1000UV-Vis 超微量分光光度計(jì)（NanoDrop Technologies，Wil mington，DE，USA） 對(duì) DNA 濃度進(jìn)行定量。用細(xì)菌通用引物對(duì)V4 區(qū)域細(xì)菌16S rRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物與下游引物分別為515F′ （5′-Fusion A-Barcode-CA linker-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′）和909R （5′-Fusion B-TC linker-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′） 。 序列在V4區(qū)域全部覆蓋且精度較高[8-9]。以25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，使用 ABI GeneAmp 9700 PCR 擴(kuò)增儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA），反應(yīng)條件為：95 ℃先變性 2 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán) 30 次；最后 72 ℃延伸 5 min。擴(kuò)增后的 PCR 產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳，在 80 V 恒壓，電泳 40 min 條件下驗(yàn)證 PCR 產(chǎn)物的正確性。將一個(gè)取樣點(diǎn) 3 個(gè)平行的PCR 產(chǎn)物等體積混合后用試劑盒純化（MP Biomedicals，CA，USA），并按照 Illu mina Hiseq 測(cè)序說明書構(gòu)建 PE 文庫，加接頭后用 Illu mina Hiseq 2000 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5測(cè)序數(shù)據(jù)分析測(cè)序原始數(shù)據(jù)先用 Trimmomatic 軟件進(jìn)行剪切和質(zhì)控（設(shè)置 50 bp 的窗口，從 5′端過濾掉 Q<20 的序列）。經(jīng)過質(zhì)控后的序列用 FLASH 軟件進(jìn)行雙端序列拼接（最小 overlap 的長(zhǎng)度設(shè)置為 10 bp，最大錯(cuò)配比設(shè)置為 0.2），拼接后的連續(xù)序列再次質(zhì)控以去除包含模糊堿基對(duì)及包含低質(zhì)量（Q<25）的序列。選擇樣品中最小序列數(shù)進(jìn)行抽平處理并后續(xù)分析。Mothur 軟件用來計(jì)算 α 多樣性指數(shù)：Chao 和 ACE 指數(shù)反映物種豐富度，Simpson 和 Shannon 指數(shù)反映物種多樣性。

同樣用 QIIME 作為軟件平臺(tái)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 R 中調(diào)用 Vegan 軟件包篩選出對(duì)群落分布有顯著影響（P<0.05）的環(huán)境因子，再將這些有顯著性影響的環(huán)境因子和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2結(jié)果與分析

2.1草地土壤放牧強(qiáng)度變化該試驗(yàn)設(shè)有放牧與水分雙重交互梯度，其中放牧梯度以地上植被覆蓋度及優(yōu)勢(shì)物種的轉(zhuǎn)變?yōu)閯澐忠罁?jù)，其放牧強(qiáng)度由地上植物生物量表征。結(jié)果表明HG、MG、LG梯度草地植物生物量依次增加，如圖1所示，即放牧強(qiáng)度由HG、MG、LG依次減小。

2.2土壤理化性質(zhì)

TOC是土壤最重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)之一，TOC含量的高低可影響土壤結(jié)構(gòu)，并且與土壤總氮、總磷等具有相關(guān)關(guān)系。該研究表明，西藏高寒草地土壤TOC隨地上生物量的增加而增加，即隨放牧強(qiáng)度的減小而增加（P<0.05）（圖2）。土壤總氮含量通?？捎脕砗饬客寥赖氐幕A(chǔ)肥力[10-11]。該研究表明，高寒草地土壤總氮含量的峰值出現(xiàn)在中度放牧梯度，而強(qiáng)放牧梯度與弱放牧梯度總氮含量則顯著降低（P<0.05）（圖3）。作為草地土壤中限制草地生產(chǎn)力、影響放牧牧草品質(zhì)的重要因素，土壤總磷含量同樣在弱放牧梯度相對(duì)于強(qiáng)放牧梯度更低（P<0.05）（圖4）。

2.3放牧對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

放牧梯度試驗(yàn)樣品進(jìn)行16S V4-V5區(qū)擴(kuò)增后，經(jīng)Hiseq高通量測(cè)序與QIIME OTU操作單元聚類操作和種屬鑒定，發(fā)現(xiàn)西藏高寒草地細(xì)菌類群較為豐富，且各梯度間門水平與屬水平上物種類似。各放牧梯度下土壤細(xì)菌門水平上的優(yōu)勢(shì)物種分別為：放線菌門Actinobacteria（44.61%）、變形菌門Proteobacteria（21.88%）、酸桿菌門Acidobacteria（12.73%）、綠彎菌門Chloroflexi（6.57%）、芽單胞菌門Gemmatimonadetes（4.67%）和浮霉菌門Planctomycetes（2.67%）；屬水平上優(yōu)勢(shì)物種分別為假諾卡氏菌屬Pseudonocardia（2.80%）、屬紅游動(dòng)菌屬Rhodoplanes（1.53%）、小月菌屬M(fèi)icrolunatus（1.20%）、氣微菌屬Aeromicrobium（1.30%）和Candidatus nitrososphaera （1.13%）屬，放牧對(duì)于土壤細(xì)菌群落α多樣性具有顯著作用。各樣品goods coverage測(cè)序深度指數(shù)均>98.5%。代表物種豐富度的ACE、chao1指數(shù)在強(qiáng)放牧作用下的HG梯度較低，在中度放牧作用下的MG 梯度升高，而在弱放牧作用下的LG重新降低（圖5）。代表物種群落均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則并未在各放牧梯度間表現(xiàn)出顯著的分異（圖6）。

對(duì)放牧梯度下OTU操作單元數(shù)據(jù)進(jìn)行Beta多樣性分析后，由PCA分析可知，強(qiáng)放牧作用下的HG梯度與中放牧作用下的MG梯度、弱放牧作用下的LG梯度產(chǎn)生一定分異（圖8）。

3討論

3.1放牧對(duì)草地地上植被和土壤理化性質(zhì)的影響

土壤TOC隨著放牧強(qiáng)度的增加而減小，這是由于隨著放牧強(qiáng)度的提高，放牧過程中牧畜的啃食與踩踏作用使得地上植物、枯落物及植物根際分泌物減少，使草地土壤獲得的有機(jī)質(zhì)逐漸減少。因而，土壤有機(jī)碳源由于凈初級(jí)生產(chǎn)力受到限制，土壤有機(jī)碳含量逐漸降低。土壤總氮在中度放牧梯度處于峰值，而重度、輕度放牧梯度則表現(xiàn)為谷值。土壤中氮素累積最主要的來源是土壤生物殘?bào)w的分解和土壤微生物的固定。放牧作用下，由于牧畜的踩踏作用，使氮元素的循環(huán)和轉(zhuǎn)化得到加強(qiáng)；同時(shí)地上植被受到牧畜啃食，草地植被覆蓋度下降，土壤溫度及水分相應(yīng)發(fā)生變化，低水分條件下氣體氮流失高于植物氮積聚，而高水分條件下表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。土壤總磷表現(xiàn)為強(qiáng)放牧梯度最高，這是由于土壤中總磷主要通過牧畜的排泄進(jìn)行補(bǔ)充，強(qiáng)放牧作用下牧畜排泄物為土壤增加了磷元素來源。

3.2放牧對(duì)草地土壤微生物的影響

作為西藏高寒草原最主要的土地利用方式，放牧決定了草地生產(chǎn)力和棲息物種的生命形式。有研究報(bào)道，地上植物生物量顯著減少以響應(yīng)草地放牧作用[4]。該研究以地上植物生物量作為放牧強(qiáng)度的表征。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落物種多樣性在中度放牧梯度下最高，而強(qiáng)放牧作用和弱放牧作用下的各梯度土壤細(xì)菌群落物種多樣性相對(duì)較低，這與Connell[12]的中度干擾理論（intermediate disturbance hypothesis）相一致，即干擾因素對(duì)于資源以及環(huán)境一致性的作用表現(xiàn)為非線性，在中等水平下的干擾可使物種多樣性增加，而超過閾值之后干擾又會(huì)使物種多樣性降低。這是由于中等放牧干擾下的草地，牧畜的啃食、踩踏、排泄等活動(dòng)促進(jìn)了草地土壤微生物的繁殖與生長(zhǎng)。此外，放牧作用可主要通過養(yǎng)分有效性和促進(jìn)植物再生影響干物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)和C、N儲(chǔ)存，進(jìn)而影響草地生態(tài)系統(tǒng)[13]，中度放牧可增加植物生產(chǎn)力（植物生物量+放牧引起的植物遷移量）[4]，并刺激氮元素的礦化、硝化、氨化[14]和潛在的反硝化作用[15]，使得物種多樣性增加。當(dāng)放牧強(qiáng)度繼續(xù)增加后，地上植物生物量、土壤營(yíng)養(yǎng)元素等性質(zhì)的異質(zhì)性將發(fā)生顯著的改變，導(dǎo)致土壤微生物的生存環(huán)境發(fā)生決定性改變，從而使得土壤細(xì)菌物種多樣性降低[16]。

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