3株乳桿菌表面疏水性及凝聚性研究

于小番　陳忠琴　黨欣桐

摘要[目的]探討干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和植物乳桿菌的表面疏水性以及凝聚性。[方法]采用MATH法測(cè)定3株乳桿菌的表面疏水率，自凝聚試驗(yàn)測(cè)定菌株的自凝聚率，共凝聚試驗(yàn)測(cè)定3株乳桿菌與致病菌的共凝聚率。[結(jié)果]3個(gè)菌株的渦旋時(shí)間與表面疏水性呈負(fù)相關(guān)，靜置時(shí)間與自凝聚作用呈正相關(guān)，且凝聚作用與致病菌的粘附和菌體自身特性有關(guān)。[結(jié)論]3株乳桿菌在腸道中均表現(xiàn)出良好的凝聚能力。

關(guān)鍵詞副干酪乳桿菌；干酪乳桿菌；植物乳桿菌；疏水性；凝聚性

中圖分類(lèi)號(hào)TS201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）22-0055-03

Abstract[Objective]To explore the surface hydrophobicity and coherency of Lactobacillus paracasei，Lactobacillus casei， Lactobacillus plantarum. [Method]The hydrophobic rates were determined by using MATH.Self condensation rates of bacterial strains were determined by self condensation test.Coagulation rates of Lactobacillus with pathogenic bacteria were determined by coagulation test. [Result]The vortex time of bacterial strains was negatively correlated with the surface hydrophobicity， and the static time was positively correlated with the self condensation， the condensation was related to the adhesion of pathogenic bacteria and the characteristics of bacteria. [Conclusion] Three stranis of Lactobacillus demonstrates good condensation ability in the gut.

Key wordsLactobacillus paracasei；Lactobacillus casei；Lactobacillus plantarum；Hydrophobicity；Coherency

益生菌自被發(fā)現(xiàn)和定義以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用于預(yù)防疾病和增強(qiáng)體質(zhì)等方面。乳酸桿菌是益生菌菌群的重要成員，被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵行業(yè)以及保健食品行業(yè)。作為一種對(duì)人體健康起到重要作用的活性益生菌，乳酸桿菌在改善胃腸道微環(huán)境，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面有顯著功效，因而日益受到人們的重視[1]。乳桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，其廣泛分布于含有碳水化合物的動(dòng)植物發(fā)酵產(chǎn)品中，也見(jiàn)于溫血?jiǎng)游锏目谇?、陰道和腸道內(nèi)。該屬細(xì)菌分解糖的能力強(qiáng)，分解蛋白質(zhì)類(lèi)的能力極低，乳桿菌耐酸，最適pH為5.5～5.8，甚至更低。

疏水性在膠體溶液的穩(wěn)定性中起著十分重要的作用[2]。細(xì)菌表面的疏水性能夠使其在極性水中表現(xiàn)出不穩(wěn)定狀態(tài)，從而引起一系列菌體排列的變化。菌株表面結(jié)構(gòu)的差異性導(dǎo)致其疏水性的不同[2-5]。

乳桿菌的表面結(jié)構(gòu)（如蛋白質(zhì)、代謝分子、DNA分子等）能夠?yàn)槠漯つけ砻娴恼掣侥芰μ峁└?jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，使其特異性粘附后在腸道中定殖[6]，然后通過(guò)空間占位抑制病原菌在腸道中定殖，并且通過(guò)搶奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及釋放抑菌物質(zhì)來(lái)降低致病菌的生存率，從而達(dá)到抑制病原菌的目的。此外，乳桿菌可以通過(guò)與致病菌的共凝聚作用，減少致病菌在腸道中的數(shù)量，改變腸道中的菌群結(jié)構(gòu)，改善腸道微環(huán)境。筆者通過(guò)對(duì)幾種乳桿菌的表面疏水性以及凝聚能力進(jìn)行研究，探求渦旋時(shí)間對(duì)表面疏水能力以及靜置時(shí)間對(duì)凝聚力的影響。此外，研究副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）與多種致病菌的共凝聚能力，來(lái)探究這幾種乳桿菌是否能加劇致病菌的凝聚從而起到抑制病菌的作用。

1材料與方法

1.1菌株復(fù)蘇與培養(yǎng)

將保存在-70 ℃冰箱中的乳桿菌菌種取出后置于37 ℃水浴箱中解凍。于超凈工作臺(tái)上吸取200 μL菌液接入10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h。取一環(huán)培養(yǎng)物劃線于MRS固體平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h，之后再取一環(huán)培養(yǎng)物劃線于MRS固體平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h。挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h。

將保存在-70 ℃冰箱中的副溶血性弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌菌種取出，置于37 ℃水浴箱中解凍。于超凈工作臺(tái)上吸取200 μL菌液接入10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h。

1.2繪制乳桿菌生長(zhǎng)曲線

在乳桿菌經(jīng)2次固體培養(yǎng)基劃菌接種于液體培養(yǎng)基后，測(cè)出此時(shí)菌液的OD值，此后每隔一段時(shí)間（0、2、3、4、6、8、11、13、14、15、17、18、19、21、23、25 h）測(cè)1次OD值，直至25 h，每個(gè)重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.3MATH法測(cè)定菌株表面疏水率

將培養(yǎng)好的乳桿菌菌液以3 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌2次，然后懸垂于生理鹽水中，調(diào)節(jié)菌液使之在600 nm波長(zhǎng)下的OD值為0.8～1.0，記為OD1。將菌液分成6份，每份2.4 mL，加入0.4 mL三氯甲烷，分別振蕩渦旋10、20、30、40、50、60 s，靜置20 min，以生理鹽水為空白對(duì)照，測(cè)得水相，重復(fù)3次，取平均值，記為OD2。

菌株表面疏水率（CSH）=（1-OD2/OD1）×100%

1.4菌株自凝聚率的測(cè)定將培養(yǎng)好的乳桿菌菌液以3 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌2次，然后懸垂于生理鹽水中，以生理鹽水為空白對(duì)照，調(diào)節(jié)菌液使之在600 nm波長(zhǎng)下OD值約為1.0，記為OD1。取5支型號(hào)一致的試管做好標(biāo)記，每支試管加入4 mL調(diào)整好濃度的菌懸液，分別室溫靜置1、2、3、4、5 h，然后各吸取1 mL上層溶液測(cè)得其吸光值，重復(fù)3次，取平均值，記為OD2。

菌株自凝聚率=（1-OD2/OD1）×100%

1.5菌株與致病菌共凝聚率的測(cè)定將培養(yǎng)好的乳桿菌及致病菌菌液以3 000 r/min離心10 min，收集菌體，用生理鹽水洗滌2次，然后懸垂于生理鹽水中，以生理鹽水為空白對(duì)照，調(diào)整受試菌株菌液濃度，使其在600 nm波長(zhǎng)下OD值約為0.4。分別取調(diào)好濃度的乳桿菌菌懸液2 mL于4支試管中，再分別加入2 mL 4種致病菌懸液相混合，以4 mL乳桿菌和相應(yīng)致病菌菌懸液作為對(duì)照組，振蕩渦旋3 min后37 ℃靜置2 h，然后吸取1 mL上層溶液測(cè)定吸光值，重復(fù)3次。

菌株共凝聚率=[（OD乳+OD菌）/2-OD混]/[（OD乳+OD菌）/2]×100%

式中，OD乳為乳酸菌菌懸液在600 nm處測(cè)得的OD值；OD菌為致病菌菌懸液在600 nm處測(cè)得的OD值；OD混為混合上層溶液在600 nm處測(cè)得的OD值。

2結(jié)果與分析

2.1生長(zhǎng)曲線分析3株乳桿菌的生長(zhǎng)情況如圖1所示。由圖1可知，3株乳桿菌均經(jīng)歷適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期3個(gè)階段，18～20 h活性最高，生長(zhǎng)狀況最穩(wěn)定。從生長(zhǎng)情況看，3株菌到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期的時(shí)間沒(méi)有明顯差別，而到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)植物乳桿菌的濃度要明顯低于其他2株菌。后續(xù)試驗(yàn)中選取生長(zhǎng)18 h的菌株。

2.2菌株的表面疏水率3株乳桿菌的表面疏水率如圖2所示。

由圖2可知，在渦旋初期，渦旋時(shí)間與疏水率呈正相關(guān)；20 s后，渦旋時(shí)間與副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌的疏水性都呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，且渦旋時(shí)間越長(zhǎng)，疏水作用越弱；至40 s后，疏水率趨于0。將3種菌株進(jìn)行比較，副干酪乳桿菌與干酪乳桿菌的疏水率相似，且疏水性?xún)?yōu)于植物乳桿菌。

2.3菌株的自凝聚率3株菌的自凝聚率如圖3所示，菌株在不同靜置時(shí)間下OD2值的變化如圖4所示。將圖3和圖4結(jié)合，可以更加直觀地看出，3個(gè)菌株的OD2值隨著靜置時(shí)間的增加均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，而菌液自凝聚率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。菌液自凝聚率的上升趨勢(shì)并不是一條直線，副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌初期上升較快，后期上升較慢，而植物乳桿菌初期上升較慢，后期上升較快。靜置4～5 h，菌液自凝聚率已逐漸趨于一致。當(dāng)靜置5 h后，副干酪乳桿菌的自動(dòng)聚集率基本不會(huì)發(fā)生顯著性變化，維持在30%左右。

試驗(yàn)過(guò)程中，菌液渦旋振蕩后很快開(kāi)始沉淀，上層溶液逐漸澄清，下層溶液逐漸渾濁，此現(xiàn)象與試驗(yàn)數(shù)據(jù)體現(xiàn)出來(lái)的結(jié)果一致。

2.4菌株與致病菌的共凝聚率

大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌均是體內(nèi)常見(jiàn)的致病菌，在人體腸道內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖容易引起各項(xiàng)生理、病理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，粘附在腸道的乳桿菌可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)粘附位點(diǎn)或空間位阻、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等來(lái)抑制致病菌的粘附作用。

由圖5可以看出，副干酪乳桿菌與4株致病菌的共凝聚率以副溶血性弧菌的混合液最高，達(dá)9.48%；其次是金黃色葡萄球菌的混合液，為4.06%；之后是大腸桿菌混合液，為3.18%；最低的是沙門(mén)氏菌的混合液，只有0.77%。結(jié)果表明，副干酪乳桿菌有促進(jìn)副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌在液態(tài)基質(zhì)中聚集的能力，但對(duì)沙門(mén)氏菌幾乎沒(méi)有效果。乳酸菌有促進(jìn)致病菌聚集的能力，可能會(huì)影響其對(duì)致病菌的抑制能力[7]，因此副干酪乳桿菌對(duì)副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌可能有一定的抑制能力。

從圖5可以看出，副干酪乳桿菌對(duì)副溶血性弧菌的共凝聚效果最好，而干酪乳桿菌以及植物乳桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制效果相較于其他3種致病菌好，且植物乳桿菌對(duì)沙門(mén)氏菌的共凝聚率達(dá)19.11%。

3討論

Savage[8]研究了22株乳桿菌生長(zhǎng)階段與粘附的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與指數(shù)期相比，絕大部分乳桿菌生長(zhǎng)到穩(wěn)定期后的粘附表現(xiàn)更好。該試驗(yàn)所用乳桿菌均為培養(yǎng)18 h的菌株。由于培養(yǎng)時(shí)間、溫度、pH、菌液濃度、Ca2+、糖和蛋白質(zhì)等因素會(huì)影響乳桿菌的表面疏水性和自動(dòng)聚集能力，因此除了選用合適的試驗(yàn)菌株外，試驗(yàn)過(guò)程中還應(yīng)保證培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為18 h，菌液濃度一致，所用設(shè)備一致，同時(shí)控制Ca2+、糖和蛋白質(zhì)等因素，避免造成差異影響試驗(yàn)結(jié)果和獲得生長(zhǎng)活性高且狀況好的菌株。

研究表明，大部分表面疏水性低的菌株，其粘附性也不高，所以細(xì)菌的表面疏水性會(huì)影響其在體內(nèi)的粘附能力。通過(guò)該試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如果渦旋時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，乳桿菌在腸道內(nèi)的

粘附能力可能會(huì)降低。試驗(yàn)結(jié)果表示，植物乳桿菌的粘附能力較干酪乳桿菌弱，這與林曉姿等[9]的研究成果一致。

研究表明，乳酸菌的自凝聚能力與其在體內(nèi)的粘附能力有密切關(guān)系[10]，因此靜置時(shí)間可能因影響菌株的自凝聚能力而影響其粘附能力。該研究表明，靜置時(shí)間與3株乳桿菌的自凝聚作用呈正相關(guān)。

乳桿菌促進(jìn)致病菌聚集的能力，可能會(huì)影響其對(duì)致病菌的抑制能力，因此副干酪乳桿菌對(duì)副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等致病菌可能有一定的抑制能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，3株乳桿菌對(duì)不同致病菌的共凝聚能力不同，這可能由于致病菌的自身特性決定了其對(duì)乳桿菌的不同凝聚能力。

綜上所述，時(shí)間是影響粘附性能的因素之一，粘附通過(guò)作用一定的時(shí)間達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。通過(guò)試驗(yàn)，再次驗(yàn)證了疏水性、自凝聚能力以及粘附性三者之間的正相關(guān)聯(lián)系規(guī)律的同一性和普遍性，為后續(xù)粘附性質(zhì)的研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，該研究所選用的幾種乳桿菌菌株的表面疏水性和自凝聚特性均較高于前人研究，表明菌株存在著一定的特異性，可通過(guò)對(duì)干酪乳桿菌表面性質(zhì)的測(cè)定，快速而高效地篩選出具有高粘附性質(zhì)的乳桿菌，為制備高粘附性干酪乳桿菌種及其相關(guān)應(yīng)用制劑做準(zhǔn)備。

45卷22期于小番等3株乳桿菌表面疏水性及凝聚性研究

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