雙低油菜籽不同添加水平對牦?？漳c和盲腸食糜消化酶活性的影響

范小紅， 郝力壯， 劉書杰， 柴沙駝， 牛建章，張曉衛(wèi)， 王 迅， 孫 璐， 趙索南， 張成圖， 李吉業(yè)

（1.省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，青海西寧 810016；2.青海高原牦牛研究中心，青海西寧 810016；3.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧，810016；4.海北州畜牧獸醫(yī)科學研究所,青海海晏 810200；5.西寧市畜牧獸醫(yī)站，青海西寧 810016；6.青海省大通種牛場，青海大通縣，810102）

雙低油菜籽不同添加水平對牦?？漳c和盲腸食糜消化酶活性的影響

范小紅1，2，3*， 郝力壯1，2，3*， 劉書杰1，2，3*， 柴沙駝1，2，3， 牛建章1，2，3，張曉衛(wèi)1，2，3， 王 迅1，2，3， 孫 璐1，2，3， 趙索南4， 張成圖5， 李吉業(yè)6

（1.省部共建三江源生態(tài)與高原農牧業(yè)國家重點實驗室，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，青海西寧 810016；2.青海高原牦牛研究中心，青海西寧 810016；3.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧，810016；4.海北州畜牧獸醫(yī)科學研究所,青海海晏 810200；5.西寧市畜牧獸醫(yī)站，青海西寧 810016；6.青海省大通種牛場，青海大通縣，810102）

為揭示牦牛日糧中雙低油菜籽不同添加量對其空腸和盲腸食糜消化酶活性的影響及各酶活性間的關系，試驗采用年齡、性別和體況基本一致的生長期健康閹牦牛18頭，隨機分為3組，分別飼喂添加油菜籽為21.75%（H組）、10%（M組）和0%（L組）的精飼料日糧，每個處理組6個重復，每個重復單頭飼喂。試驗結果表明：（1）不同油菜籽添加量對空腸食糜淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）和羧甲基纖維素酶（CLS）活性無顯著性影響（P＞0.05），胰蛋白酶（TRS）活性H組顯著高于M組和L組（P＜0.05），H組較M組及L組分別高51.30%、45.08%；（2）不同油菜籽添加量盲腸食糜消化酶活性H組的AMS和CLS活性顯著高于M組和L組 （P＜0.05），AMS活性分別較M組和L組高75.26%、72.22%，CLS活性分別較M組和L組高68.73%、52.48%；（3）由相關性可知，空腸食糜消化酶活性中，AMS與CLS活性極顯著正相關（P ＜ 0.01）；盲腸食糜消化酶活性中，AMS、LPS、TRS、CLS 間均呈極顯著正相關（P ＜ 0.01）。

油菜籽；牦牛；食糜酶活；淀粉酶；脂肪酶；纖維素酶

牦牛是高寒草地重要的生態(tài)組成部分，因牦 牛對寒冷、氧氣缺乏、草料匱乏等惡劣環(huán)境的適應能力較強而成為高寒牧區(qū)中不可替代的生產生活資料和支柱產業(yè)（郭憲，2009）。反芻動物日糧中添加油脂既可以解決反芻家畜能量和蛋白質缺乏，提高日糧能量濃度和動物生產性能，調控畜產品品質，又可降低甲烷排放和改善肉質品質。Delbecch等（2001）在奶牛日糧中添加4.8%保護性雙低油菜籽發(fā)現(xiàn)，乳中飽和脂肪酸（C8-C16）及油酸（C18∶1）均顯著減少；Wiesen 等（1990）研究油菜籽添加水平分別為0%、7%和14%的三種日糧發(fā)現(xiàn)，高油菜籽添加水平使得乳中不飽和脂肪酸（C18∶1 和 C18∶2） 顯著升高；Mckinnon 等（1977）用雙低油菜籽粕含量為4%～30%的日糧對犢牛進行飼喂試驗，表明雙低油菜籽粕添加量為21.7%時，犢牛的日增重及消化率最高。然而也有試驗表明，菜籽粕添加過量會對試驗動物產生不利影響，林莉（2010）采用體外產氣法研究日糧中添加油菜籽對牦牛瘤胃發(fā)酵的影響發(fā)現(xiàn)，0%、5%、10%、15%、20%、25%的油菜籽添加水平對干物質降解率、48 h產氣量有負影響。目前關于脂類營養(yǎng)物質對牦牛消化道酶活性的營養(yǎng)調控研究較少。劉慧麗（2017）研究油菜籽不同添加量對牦牛瘤胃食糜和十二指腸食糜中消化酶活性的影響，由此，本試驗研究油菜籽不同添加量對牦?？漳c食糜和盲腸食糜中消化酶活性的影響以及各不同酶活性之間的相關性，旨在補充牦牛全消化道食糜中消化酶活性參數(shù)，為脂類在牦牛補飼飼養(yǎng)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點 試驗在青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與生態(tài)國家重點實驗室培育基地，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室進行。試驗基地位于 E101.75°，N36.69°，平均海拔 2275 m，年平均氣溫較低，屬于高原高山寒溫性氣候；試驗期間，基地內平均溫度3.8℃，最高6.5℃，最低可達-10℃，相對濕度保持在68%以上。

1.2 試驗日糧 參考胡令浩（1999）《牦牛營養(yǎng)研究論文集》和《肉牛飼養(yǎng)標準》（NY/T 815—2004）（2004），以150 kg牦牛日增重500 g所需的能量和蛋白質為基礎設計牦牛日糧配方 （已提交專利申請，編號：KHP161110881.4）。以青海地區(qū)常用的玉米、小麥麩、玉米麩、油菜籽等主要原料為精料，以顆粒料形式進行飼喂，燕麥青干草為粗料，按精粗比 7∶3 飼喂，其中高（H）、中（M）和低（L）三個處理組精料中油菜籽的添加量分別為21.75%、10%和0%。

1.3 試驗設計和飼養(yǎng)管理 試驗選取18頭健康、體況相近、體重為（127.62±16.93）kg 的 3 歲青海閹牦牛，隨機分為3個處理組，進行全舍飼試驗，每個處理組6個重復，每個重復單頭飼喂。預飼期40 d，正式期180 d。每天分兩次進行飼喂（08∶00 和 18∶00），日采食量定量 4 kg，先粗料后精料，自由飲水。牛舍的消毒程序按正規(guī)牛場的標準進行，每天打掃一次衛(wèi)生，每周消毒一次。每天注意觀察試驗牛的精神狀態(tài)，如果發(fā)現(xiàn)病牛，及時進行治療。

1.4 樣品采集 飼喂試驗結束后全部屠宰，屠宰過程參考袁建新（1997）的方法。取每個處理空腸和盲腸部分食糜，裝于50 mL離心管中，對樣品進行匯總，液氮保存。用于測定空腸和盲腸中淀粉酶（AMS）、胰蛋白酶（TRS）、脂肪酶（LPS）和羧甲基纖維素酶（CLS）活性。

1.5 測定指標及方法 AMS、TRS、LPS活性的測定參考陳鼎（2008）的方法進行，CLS活性的測定采用南京建成生化工程研究所生產的試劑盒 （貨號：A137）進行測定。

1.5.1 AMS的測定 AMS能水解淀粉生成葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物濃度已知并且過量的情況下，加入碘液與未水解的淀粉結合生成藍色復合物，根據(jù)藍色的深淺可推算出水解的淀粉酶量，從而計算出AMS的活力。將每毫克蛋白質在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為一個酶活力單位。

1.5.2 LPS的測定 37℃條件下，每克蛋白質在本反應體系中與底物反應1 min，每消耗1 μmol底物為一個酶活力單位。甘油三脂和水制成的乳膠，因其膠束對入射光的吸收及散射而具有乳濁性狀，膠束中的甘油三脂在LPS的作用下水解使膠束分裂，濁度或光散射因此降低，降低的速率與LPS活力有關。

1.5.3 TRS的測定 pH 8.0，37℃條件下，每毫克蛋白質含有的TRS每分鐘使吸光度變化0.003即為一個酶活力單位。TRS催化水解底物精氨酸乙酯的酯鏈，使其在253 nm處吸光度值升高，根據(jù)吸光度的變化計算出酶的活力。

1.5.4 CLS的測定 每毫克蛋白質每分鐘催化產生1 μg葡萄糖定義為一個酶活力單位。采用3.5-二硝基水楊酸法測定纖維素酶催化纖維素降解產生還原糖的含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行初步處理。通過SPSS19.0的ANOVA過程進行單因素方差分析檢測主要效果的統(tǒng)計學顯著性，由Duncan’s進行多重比較，P＜0.05作為差異顯著的判斷標準，酶活性之間的相關系數(shù)用Spearman分析。

2 結果與分析

2.1 雙低油菜籽不同添加量對牦?？漳c食糜消化酶活性的影響 由表1可知，H組的TRS活性顯著高于M組和L組 （P＜0.05），H組較M組及L組分別高51.30%和45.08%，三個處理組的空腸食糜 AMS、LPS和 CLS活性差異均不顯著 （P＞0.05），而M組的AMS、LPS和CLS活性均高于H組和L組；AMS較H組和L組分別高 9.58%、25.75%，LPS較 H組和 L組分別高0.93%、53.63%，CLS較 H組和 L組分別高 1.78%、42.21%。因此，從空腸食糜酶活性顯著分析來看，M組為較適宜添加量。

表1 雙低油菜籽不同添加量對牦?？漳c食糜消化酶活的影響 U/mL

2.2 雙低油菜籽不同添加量對牦牛盲腸食糜酶活的影響 由表2可知，H組的AMS和CLS活性顯著高于M組和L組（P＜0.05），AMS活性分別較M組和L組高75.26%、72.22%，CLS活性分別較M組和L組高68.73%、52.48%；而三個處理組LPS和TRS活性均差異不顯著（P＞0.05），且M組活性較H組和L組的活性低，AMS活性分別較H組和L組低57.03%、0.78%，CLS活性分別較H組和L組低25.79%、13.61%。

表2 雙低油菜籽不同添加量對牦牛盲腸食糜消化酶活的影響U/mL

2.3 食糜消化酶活性的相關性 由表3、表4可知，空腸食糜消化酶活性中，AMS與CLS活性極顯著正相關（P＜0.01），與LPS、TRS活性沒有顯著相關性（P ＞ 0.05），CLS、LPS、TRS 之間亦無顯著相關性 （P＞0.05）。盲腸食糜消化酶活性中，AMS與、LPS、TRS、CLS 均呈極顯著正相關 （P ＜ 0.01），LPS與LPS、CLS也呈極顯著正相關（P＜0.01）。

表4 盲腸食糜中酶活性之間的相關性

表3 空腸食糜中酶活性之間的相關性

3 討論

3.1 雙低油菜籽不同添加水平對食糜消化酶活性的影響 反芻動物的消化器官發(fā)育及消化酶的分泌與活性可直接影響日糧在消化道內的消化，且動物對日糧中營養(yǎng)物質消化、吸收和利用的程度可由消化酶的分布情況及活力水平間接反映出來。動物體內消化道酶主要有AMS、TRS、LPS等，可以補充動物體內內源性消化道酶的不足。

AMS活性在不同部位各不相同，AMS對淀粉在消化道的消化起著十分重要的作用，Keys等（1974）報道，日糧養(yǎng)分在消化道各部位的消化率有很大差異。本試驗結果表明，不同雙低油菜籽添加水平空腸AMS活性差異不顯著 （P＞0.05），但M組的AMS活性最高；盲腸AMS活性H組顯著高于M組和L組（P＜0.05），且不同處理水平AMS活性盲腸高于空腸。劉月琴（2004）研究日糧類型對小尾寒羊小腸消化酶活性影響時發(fā)現(xiàn)，空腸內容物中AMS活性最高；孫娟等（2015）研究表明，AMS活性在十二指腸中最低，空腸中最高，與本試驗結果不同。這可能由于添加雙低油菜籽使得盲腸段 pH最接近AMS活性最佳 pH （6.9），AMS活性最高；而空腸段pH或偏高或偏低，從而AMS活性較差。

不同雙低油菜籽添加水平對LPS活性有一定影響，但對于不同部位影響不同。反芻動物采食的脂肪在瘤胃內被分解為甘油和脂肪酸，絕大部分脂肪酸被氫化后進入后消化道。本試驗結果表明，不同雙低油菜籽處理水平空腸和盲腸中LPS活性均差異不顯著（P＞0.05），但隨著不同油菜籽添加量逐漸增加，空腸和盲腸食糜LPS活性依次升高，且空腸LPS活性較盲腸高。Brannon（1990）研究表明，日糧中的油脂增加LPS活性增加，與本試驗結果一致，說明LPS活性會隨日糧中甘油三酯增加而升高；劉月琴（2004）也發(fā)現(xiàn)，空腸中LPS活性較高，與本試驗結果一致。此外，Romo等（2000）指出，促胰液素、游離脂肪酸等也能增加LPS的活性。

TRS的來源主要是胰腺的分泌，各種酶活性均與不同部位有密切的關系，所以不同部位采集的腸道內容物中酶的活性均不同?？漳c是日糧中營養(yǎng)物質主要的消化位點，揚子江（2009）試驗結果表明，羔羊出生時空腸內TRS活性較高。本試驗結果表明，空腸H組的TRS活性顯著高于M組和L組（P＜0.05）；盲腸中TRS活性差異不顯著（P＞0.05）；但空腸與盲腸H組的TRS活性均較M組與L組高，M組的TRS活性則最低。這可能是由于反芻動物的胰腺反應很難預測，Johannes等（2011）研究表明，在反芻動物中營養(yǎng)物質和激素之間存在復雜的相互作用。張海濤（2009）指出，可能是由于機體自身分泌的TRS、肽酶和脫氨酶可分解蛋白質。

反芻動物對纖維物質的降解主要靠瘤胃微生物分泌的纖維物質降解酶，其中羧甲基纖維素酶活性能反映瘤胃對纖維物質的降解能力。本試驗結果表明，不同添加水平下的空腸CLS活性差異不顯著，盲腸CLS活性H組顯著高于M組和L組（P＜0.05），隨著雙低油菜籽添加水平的增加，空腸CLS活性呈先升后降的趨勢，推測21.75%的油菜籽會抑制纖維分解菌的活性；盲腸CLS活性則呈先降后升趨勢，可能是由于消化道后段，其抑制纖維分解菌的能力下降。研究表明，當脂肪超過干物質的2%～3%或不飽和度增加就會抑制纖維分解菌的活動；CLS的活性大小與纖維分解菌的數(shù)量直接相關（曹秀青等，2011；王貞貞，2008）；CLS活性還與動物種類，油脂添加類型有關 （張寧，2008）。此外，消化道酶的活性還受溫度、pH、激活劑和抑制劑等多種因素的影響，每一種酶都有與其相適應的環(huán)境和條件。3.2 食糜消化酶活性的相關性 空腸食糜中，AMS與CLS活性極顯著正相關（P＜0.01）；盲腸食糜消化酶活性中，AMS、LPS、TRS、CLS 活性均呈極顯著正相關（P ＜ 0.01）。 Moharrery等（2014）研究表明，TRS活性和AMS活性之間呈正相關，與本試驗結果不一致，可能是由于胰腺外分泌含有AMS和TRS，根據(jù)酶的“平行”分泌，空腸食糜酶活性之間的相互關系是非常復雜的，因為蛋白質水解失活以外的因素，也被假設是通過小腸期間胰腺酶活性選擇性變化的原因。

4 結論

日糧精粗比為7∶3時，精料補充料中添加10%油菜籽，空腸AMS和CLS活性較其他兩組高，添加21.75%油菜籽時，LPS和TRS活性較高。日糧中添加油菜籽后，空腸AMS與CLS活性極顯著正相關；盲腸 AMS 與、LPS、TRS、CLS 均呈極顯著正相關。因此，在牦牛補飼飼養(yǎng)中，建議可適量添加熟化油菜籽以提高消化酶活性，有關具體添加量，有待進一步研究。

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The experiment was conducted to study the effect of different additions of canola rapeseed on the activity of digestive enzymes in jejunum and cecal chyme and the relationship among the activities of each enzyme.A total of 18 healthy castrated yaks with the same age，gender and body condition were randomly divided into 3 groups and fed with rapeseed for 21.75% （H）， 10% （M）and 0% （L） of the concentrate feed，six treatments were repeated for each treatment group，and each repeat was fed alone.The results showed that：（1）There was no significant effect of different rapeseed additions on the activities of amylase （AMS），lipase （LPS）and cellulase （CLS） in jejunum （P ＞ 0.05）.The trypsin （TRS） activity in H group was significantly higher 51.30%，45.08%than that in M group and L group.（2）The activities of AMS and CLS in H group were significantly higher than those in M and L groups （P ＜ 0.05）.The AMS activity in H group was higher 75.26%and 72.22%than that of M group and L group，CLS activity was higher 68.73%and 52.48%than that in M group and L group.（3）There was a significant positive correlation between AMS and CLS activities in the digestive enzyme activity of jejunum chyme（P ＜ 0.01）；and there was a significant positive correlation between AMS，LPS，TRS and CLS in the digestive enzyme activity of cecal chyme （P ＜ 0.01）.

rapeseed；yak；chymotrypsin；amylase；lipase；cellulase

S816.7

A

1004-3314（2017）18-0015-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171804

國家自然科學基金（31660673）；國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500504-4）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973項目）（2012CB722906）；國家國際科技合作專項項目（2015DFG31870）；青海省重大科技平臺建設項目（2013-Z-Y03）

*通訊作者