適宜母豬配合飼料發(fā)酵的菌種篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

適宜母豬配合飼料發(fā)酵的菌種篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，徐海燕，谷 巍*

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

本試驗對適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌進行了篩選，并對最適發(fā)酵菌種的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。結果表明：適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌為BLCC2-0015和BLCC2-0092，發(fā)酵48 h時，pH最低分別達到4.12和4.25，活菌數(shù)分別達到60×108和81×108，總酸含量分別為22.56 mg/g和23.50 mg/g；適宜乳酸菌BLCC2-0015生料發(fā)酵的條件為：溫度 28 ～ 42 ℃，料水比 5∶2、5∶3 或 5∶4；其中最優(yōu)的條件為：溫度 28 ～ 32 ℃，料水比 5∶3 或 5∶4，活菌數(shù)最高達96×108，pH 最低為 3.92。 適宜乳酸菌 BLCC2-0092 生料發(fā)酵的條件為：溫度 28 ～ 32 ℃，料水比 5∶2、5∶3 或 5∶4；其中最優(yōu)的條件為：溫度28℃，料水比5∶4和溫度32℃、料水比5∶3或5∶4，活菌數(shù)可達到109CFU/g以上。

乳酸菌；發(fā)酵飼料；活菌數(shù)；pH；總酸

微生物發(fā)酵飼料是一種利用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等有益微生物對一種或多種飼料原料進行厭氧或好氧發(fā)酵，從而提高飼料原料營養(yǎng)物質的利用率，消除抗營養(yǎng)因子，同時有益微生物大量繁殖、富集，功能性初級、次級代謝產物大量生成（馬傳興等，2014；林標生等，2013）。乳酸菌是應用最早、最廣泛的益生菌，其是一類可利用碳水化合物發(fā)酵產生大量乳酸細菌的總稱，通常為厭氧或者兼性厭氧菌，耐酸，在pH為4.5以下時仍可生長，因此被廣泛應用于乳制品等發(fā)酵食品中（李曉暉，2002）。乳酸菌發(fā)酵飼料可以降低仔豬胃內的酸度，增加仔豬的采食量，從而提高其生產性能（楊璐等，2014）；其代謝產物和活菌液對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都有很強的抑菌效果，并且pH越低，抑菌作用越強（王曉偉等，2015）；此外，乳酸菌發(fā)酵飼料作為功能性飼料，其還具有氣味香、適口性好、飼喂便捷、消化率高、功效穩(wěn)定等優(yōu)勢，具有良好的生產和應用價值，其在飼料領域的應用具有較大潛力。

本試驗旨在研究適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌的篩選，并對篩選得到的兩株乳酸菌發(fā)酵配合飼料的工藝進行優(yōu)化，為乳酸菌發(fā)酵配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵基料和菌株 玉米-豆粕型配合飼料由山東泰安普瑞納飼料有限公司提供。

6 株 乳 酸 菌 菌 株 ：BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0114均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨 10 g/L、牛肉膏 8 g/L、酵母膏 4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸錳0.3 g/L、檸檬酸銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 1 ml/L，pH 6.0，121 ℃滅菌 20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌發(fā)酵液的制備 將4℃條件下保存的乳酸菌斜面活化，轉接到裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h備用。

1.2.2 乳酸菌的篩選 稱取一定量的基料按料水比 1∶0.4 （g∶mL）配制好，裝袋（100 g/袋），每個樣品設3個平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳酸菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對照，壓實后于37℃培養(yǎng)箱進行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48 h和72 h取樣，測定pH、活菌數(shù)和總酸含量。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵條件的優(yōu)化 發(fā)酵過程中菌種含量、營養(yǎng)成分變化復雜，由于發(fā)酵過程是各菌共同作用結果，其中又主要以乳酸菌為主，因此最終選定以總菌含量和pH變化為指標考察發(fā)酵效果（孫合美等，2014）。將篩選得到的乳酸桿菌發(fā)酵哺乳母豬配合飼料，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，2%接種量， 發(fā)酵時間：24、48、72 h； 初始料水比：5∶2、5∶3和5∶4；發(fā)酵溫度為常溫（夜間溫度為21℃，白天溫度 21～ 23℃），28、32、37、42℃， 測定發(fā)酵料pH、乳酸菌活菌數(shù)，研究不同初始料水比和發(fā)酵溫度對飼料品質的影響。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 樣品pH測定 取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

1.3.2 乳酸菌活菌數(shù)的測定 準確稱取發(fā)酵飼料10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當稀釋度的樣品分別至MRS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37℃和30℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計算樣品中乳酸菌數(shù)量，結果用CFU/g表示。

1.3.3 總酸含量的測定 采用酸堿滴定法測定樣品中總酸含量。參照國標GB/T 12456-2008，即根據(jù)酸堿中和原理，用堿液滴定試液中的酸，以酚酞為指示劑確定滴定終點，按堿液的消耗量計算樣品中的總酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進行初步處理后，采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA進行方差分析，LSD法進行組間多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌對發(fā)酵飼料品質的影響 由表1可知，除24 h時BLCC2-0038發(fā)酵pH較高外，其余均在5以下，均顯著低于對照組（P＜0.05），其中以BLCC2-0015最低；48 h和72 h時，各組pH均有所下降，以BLCC2-0015和BLCC2-0092較低，BLCC2-0015在發(fā)酵48 h時達到最低，僅為4.12。

活菌數(shù)方面：各菌株發(fā)酵活菌數(shù)均在109水平，各取樣時間點均以BLCC2-0015和BLCC2-0092活菌數(shù)較高，其中BLCC2-0092發(fā)酵48 h活菌數(shù)達到 81×108CFU/g。

總酸含量方面：各菌株發(fā)酵料總酸含量隨發(fā)酵時間延長均逐漸升高，BLCC2-0015和BLCC2-0092的總酸含量一直處于較高水平，均顯著高于其他組 （P＜0.05），其中以72 h-BLCC2-0015最高，為 24.84 mg/g。

綜合pH、活菌數(shù)和總酸含量，適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌優(yōu)選BLCC2-0015和BLCC2-0092。

2.2 適宜配合飼料發(fā)酵的乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 乳酸菌BLCC2-0015發(fā)酵工藝優(yōu)化 由表2可知，常溫21～23℃，料水比5∶2發(fā)酵48 h時活菌數(shù)僅在107水平；料水比5∶3發(fā)酵24h時，活菌數(shù)在108水平，到48 h及以后達到109水平；料水比5∶4時，活菌數(shù)在109水平。48 h pH和活菌數(shù)均顯著低于其他組（P＜0.05）。結合pH結果，說明常溫下乳酸菌生長較慢，至少48 h以后才發(fā)酵起來。

溫度 28 ℃和 32 ℃時， 料水比 5∶2、5∶3 和 5∶4時，活菌數(shù)均在109水平，幾乎均高于其他溫度同等條件下的幾十億（忽略個別計數(shù)誤差），32℃最高達到96×108CFU/g；pH呈降低趨勢，32℃時最低達到3.92，說明這兩個溫度下乳酸菌均生長良好，且料水比為 5∶3 和 5∶4 時優(yōu)于 5∶2。

表1 乳酸菌對發(fā)酵飼料品質的影響

表2 乳酸菌BLCC2-0015發(fā)酵工藝優(yōu)化

溫度 37 ℃和 42 ℃，料水比 5∶2、5∶3 和 5∶4 條件下，活菌數(shù)也均在109水平，稍低于28℃和32℃時的活菌數(shù)，pH均在5及以下，說明這兩個溫度下乳酸菌均生長良好。

結合計數(shù)結果及pH的結果得出，適宜乳酸菌BLCC2-0015生料發(fā)酵的條件為：溫度28～42℃，料水比 5∶2、5∶3 或 5∶4； 其中最優(yōu)的條件為：溫度28 ～ 32 ℃，料水比 5∶3或 5∶4，活菌數(shù)最高達 96×108CFU/g，pH 最低為 3.92。

2.2.2 乳酸菌BLCC2-0092發(fā)酵工藝優(yōu)化 由表3 可知，常溫 22 ～ 24 ℃，料水比 5∶2、5∶3 和 5∶4時，活菌數(shù)都在109水平，pH呈現(xiàn)降低的趨勢；28℃時，除個別計數(shù)誤差外，活菌數(shù)在109水平或以上，pH隨料水比升高而降低，料水比5∶4時，活菌數(shù)達到或接近1010水平；32℃，料水比5∶2時，活菌數(shù)在 109水平，5∶3 和 5∶4 時均在 1010水平，pH也在同等條件下低于其他組；37℃和42℃，料水比 5∶2、5∶3 和 5∶4 條件下， 活菌數(shù)均在 109水平，pH也呈降低趨勢，到72 h時，活菌數(shù)基本低于對照組，pH也與對照組相當，說明這兩個溫度下發(fā)酵不理想。

結合計數(shù)結果及pH的結果得出，適宜乳酸菌BLCC2-0092生料發(fā)酵的條件為：溫度28～32℃，料水比 5∶2、5∶3 或 5∶4； 其中最優(yōu)的條件為： 溫度28 ℃，料水比 5∶4 和溫度 32 ℃，料水比 5∶3 或 5∶4，活菌數(shù)可達到109CFU/g以上。

3 結論與討論

飼料原料經(jīng)過微生物發(fā)酵后可產生動物極易吸收的有益微生物菌體蛋白、酶類、生物活性小肽、氨基酸、有機酸和活性益生菌等（陸文清等，2008），形成營養(yǎng)豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料，能有效促進動物對各種營養(yǎng)物質的吸收和利用（李維炯等，2008）。乳酸菌產生的酸性代謝產物可使腸道環(huán)境偏酸性，而一般消化酶的最適pH均偏酸性，有機酸的產生還可加強腸道的蠕動和分泌，因此有利于各養(yǎng)分的消化吸收。

本試驗對適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌進行了篩選，并對最適發(fā)酵菌種發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。結果表明，適宜哺乳母豬配合飼料發(fā)酵的乳酸菌為BLCC2-0015和BLCC2-0092，發(fā)酵48 h時，pH最低分別為4.12和4.25；活菌數(shù)分別達到60×108CFU/g 和 81×108CFU/g； 總酸含量分別為22.56 mg/g和23.50 mg/g。適宜乳酸菌BLCC2-0015生料發(fā)酵的條件為：溫度28～42℃，料水比5∶2、5∶3 或 5∶4；其中最優(yōu)的條件為：溫度 28 ～ 32 ℃，料水比 5∶3 或 5∶4， 活菌數(shù)最高達 96×108CFU/g，pH最低為3.92。適宜乳酸菌BLCC2-0092生料發(fā)酵的條件為：溫度 28 ～ 32 ℃，料水比 5∶2、5∶3 或5∶4；其中最優(yōu)的條件為：溫度 28 ℃，料水比 5∶4和溫度32℃，料水比5∶3或5∶4，活菌數(shù)可達到109CFU/g以上。

表3 乳酸菌BLCC2-0092菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化

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The Lactobacillus suitable for the compound feed fermentation of lactating sow was screened and the optimal fermentation strains and its fermentation conditions were optimized.The results showed that the Lactobacillus BLCC2-0015 and BLCC2-0092 were suitable for basic feed fermentation and the feed pH of 48 h-BLCC2-0015 and BLCC2-0092 reached the minimum of 4.12 and 4.25，the viable count reached 60×108and 81×108，the total acid content reached 22.56 mg/g and 23.50 mg/g.The suitable conditions for the fermentation of BLCC2-0015 were feed-water ratio of 5∶3 or 5∶4，the fermentation temperature of 28 ～ 32 ℃ for 48 h，under these conditions the viable count reached 96×108and the pH was 3.92；The suitable conditions for the fermentation of BLCC2-0092 were feed-water ratio of 5∶4，the fermentation temperature of 28 ℃ for 48 h and feed-water ratio of 5∶3 or 5∶4，the fermentation temperature of 32 ℃ for 48 h，under these conditions the viable count reached 109CFU/g.

Lactobacillus；fermentation feed；viable count of bacteria；pH；total acid content

S816.6

A

1004-3314（2017）18-0011-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171803

泰安市科技發(fā)展計劃（201540701）

*通訊作者