響應(yīng)面法優(yōu)化辣椒紅酸湯的配方及接種發(fā)酵工藝

李青洲 袁野 鄧語(yǔ) 李云成 孟凡冰 王俏 焦曉磊

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.011

引文格式：李青洲，袁野，鄧語(yǔ)，等.響應(yīng)面法優(yōu)化辣椒紅酸湯的配方及接種發(fā)酵工藝.中國(guó)調(diào)味品，2024，49（7）：73-78.

LI Q Z， YUAN Y， DENG Y， et al. Optimization of formula and inoculation fermentation process of chili red sour soup by response surface methodology.China Condiment，2024，49（7）：73-78.

摘要：以鮮辣椒為主要原料制作辣椒紅酸湯，以總酸含量和感官評(píng)分為考察指標(biāo)，優(yōu)化了辣椒紅酸湯的原輔料配方，即植物乳桿菌與腸膜明串珠菌的比例為1∶2，大蒜添加量為7%，食鹽添加量為6%，生姜添加量為3%。在此基礎(chǔ)上，對(duì)辣椒紅酸湯發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種添加量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定辣椒紅酸湯的最佳發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明，辣椒紅酸湯的最佳工藝條件為組合菌種接菌量4%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間15 d。在此工藝條件下辣椒紅酸湯的總酸含量達(dá)到8.31 g/kg，所得辣椒紅酸湯色澤紅艷，酸咸適中，感官評(píng)分最高，達(dá)8.68。

關(guān)鍵詞：辣椒紅酸湯；發(fā)酵工藝；總酸；感官評(píng)分；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：TS201.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A????? 文章編號(hào)：1000-9973（2024）07-0073-06

Optimization of Formula and Inoculation Fermentation Process of

Chili Red Sour Soup by Response Surface Methodology

LI Qing-zhou1， YUAN Ye2， DENG Yu3， LI Yun-cheng1， MENG Fan-bing1，

WANG Qiao4， JIAO Xiao-lei3*

（1.College of Food and Biological Engineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China; 2.Market

Supervision and Administration Bureau of Bozhou District， Zunyi City， Zunyi 563000， China; 3.Neijiang

Academy of Agricultural Sciences in Sichuan Province， Neijiang 641099， China; 4.Sichuan

Institute of Food Inspection， Chengdu 611731， China）

Abstract： With fresh chili as the main raw material， chili red sour soup is prepared. With total acid content and sensory score as the evaluation indexes， the formula of raw materials and auxiliary materials of chili red sour soup is optimized： the ratio of Lactobacillus plantarum to Leuconostoc mesenteroides is 1∶2， the addition amount of garlic is 7%， the addition amount of salt is 6% and the addition amount of ginger is 3%. On this basis， response surface optimization is conducted on fermentation temperature， fermentation time and the addition amount of bacterial strains to determine the optimal fermentation process conditions of chili red sour soup. The results indicate that the optimal process conditions are the inoculation amount of combined bacterial strains of 4%， the fermentation temperature of 28 ℃ and the fermentation time of 15 d. Under these process conditions， the total acid content of chili red sour soup reaches 8.31 g/kg， the obtained chili red sour soup has bright red color， moderate sourness and saltiness， and the sensory score is the highest of 8.68.

Key words： chili red sour soup; fermentation process; total acid; sensory score; response surface methodology

收稿日期：2023-12-03

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFN0014，2021YFN0033）；四川省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022NSFSC1764）

作者簡(jiǎn)介：李青洲（1995—），男，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：焦曉磊（1987—），男，助理研究員，碩士，研究方向：食品加工工程。

紅酸湯是貴州地區(qū)的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其傳統(tǒng)制作方法是由新鮮紅辣椒、番茄分別添加糯米飯、白酒、食鹽、大蒜等佐料發(fā)酵得到半成品辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯，然后將辣椒紅酸湯和番茄紅酸湯按一定比例混合后進(jìn)行二次發(fā)酵，最終得到紅酸湯產(chǎn)品。紅酸湯營(yíng)養(yǎng)豐富、色澤紅亮、酸甜適口，具有開(kāi)胃健脾、增強(qiáng)食欲的作用。以紅酸湯為調(diào)味料開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，如紅酸湯魚(yú)、紅酸湯火鍋、紅酸湯肥牛等，逐漸受到全國(guó)各地消費(fèi)者的青睞。

紅酸湯是典型的乳酸菌發(fā)酵食品，在生產(chǎn)中通常采用自然發(fā)酵的方式，受氣候、地域的影響較大，產(chǎn)品的品質(zhì)、風(fēng)味不統(tǒng)一，且自然發(fā)酵容易滋生腐敗微生物，產(chǎn)品的安全性得不到保障，也不利于工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。因此，采用人工接種發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)紅酸湯是未來(lái)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。

辣椒紅酸湯又稱糟辣椒，是紅酸湯重要的半成品，目前傳統(tǒng)紅酸湯生產(chǎn)的原料配方主要依靠經(jīng)驗(yàn)，不同生產(chǎn)者對(duì)配方的種類和比例規(guī)定不同，導(dǎo)致產(chǎn)品的品質(zhì)參差不齊。另外，由于辣椒中存在辣椒堿等抑菌活性物質(zhì)，使得辣椒紅酸湯的自然發(fā)酵周期較長(zhǎng)，且容易滋生雜菌，得到的產(chǎn)品品質(zhì)不夠穩(wěn)定。因此，探究辣椒紅酸湯的配方及接種發(fā)酵工藝對(duì)紅酸湯工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

新鮮紅辣椒、生姜、大蒜：購(gòu)自好樂(lè)購(gòu)超市（四川省成都市十陵店）；食用鹽：四川省鹽業(yè)總公司；白酒：北京紅星股份有限公司。植物乳桿菌BY2-2、腸膜明串珠菌RB2-1：由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

酚酞、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；95%乙醇（分析純）：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

1.2? 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

TGL-22S高速臺(tái)式離心機(jī)? 四川蜀科儀器有限公司；THZ-82恒溫振蕩器? 常州澳華儀器有限公司；HZQ-X300C恒溫培養(yǎng)箱? 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、PHS-2F型pH計(jì)? 上海元析儀器有限公司；1 000 mL發(fā)酵罐? 徐州奧輝玻璃制品有限公司；L621A料理機(jī)? 九陽(yáng)股份有限公司；JJ-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)? 蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.3? 試驗(yàn)方法

1.3.1? 培養(yǎng)基的配制

以1 000 mL計(jì)，配方成分為葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏粉5.0 g、酵母膏粉4.0 g、乙酸鈉3.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、磷酸二氫鉀2.0 g、吐溫-80 1.0 mL、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g。

1.3.2? 乳酸菌發(fā)酵液的制備

分別將植物乳桿菌BY2-2、腸膜明串珠菌RB2-1接種在MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，離心，收集菌體，用生理鹽水調(diào)整菌液在600 nm處的吸光度為0.5～0.7，備用。

1.3.3? 原料處理

分別將辣椒、大蒜、生姜清洗后切碎，再用料理機(jī)二次破碎，備用。

1.3.4? 感官評(píng)價(jià)

辣椒紅酸湯感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.3.5? 總酸含量的測(cè)定

參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》并略作改動(dòng)，取（5.0±0.1） g樣品（m）加超純水定容至50 mL，然后將樣液以8 000 r/min離心10 min，取離心且過(guò)濾后的樣液10 mL，加入90 mL超純水，將樣液稀釋10倍（F），向稀釋后的樣液中滴2滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L NaOH溶液（c）滴定至pH為8.2，待溶液顏色呈微紅色且30 s不褪色，記錄消耗NaOH的體積（V1），空白試驗(yàn)使用同體積的超純水代替樣液得到消耗NaOH的體積（V2），按式（1）計(jì)算總酸含量（以乳酸計(jì)，k=0.090）。

總酸含量（g/kg）=［c×（V1－V2）］×k×Fm×1 000。（1）

1.3.6? 辣椒紅酸湯配方工藝優(yōu)化

系統(tǒng)探究食鹽、大蒜、生姜、乳酸菌配比對(duì)辣椒紅酸湯發(fā)酵品質(zhì)的影響。食鹽按照5%、6%、7%、8%、9%添加至辣椒紅酸湯（300 g紅辣椒、3%按體積比1∶1混合的發(fā)酵菌液、5%生姜、5%大蒜）中、溫度28 ℃、發(fā)酵15 d。大蒜按照1%、3%、5%、7%、9%添加至辣椒紅酸湯（300 g紅辣椒、3%按體積比1∶1混合的發(fā)酵菌液、5%生姜、7%食鹽）中、溫度28 ℃、發(fā)酵15 d。生姜按照1%、3%、5%、7%、9%添加至辣椒紅酸湯（300 g紅辣椒、3%按體積比1∶1混合的發(fā)酵菌液、5%大蒜、7%食鹽）中、溫度28 ℃、發(fā)酵15 d。植物乳桿菌BY2-2與腸膜明串珠菌RB2-1按照體積比1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1混合，分別接種3%混合發(fā)酵菌液到辣椒紅酸湯（300 g紅辣椒、7%食鹽、5%生姜、5%大蒜）中、溫度28 ℃、發(fā)酵15 d。

1.3.7? 響應(yīng)面優(yōu)化辣椒紅酸湯發(fā)酵工藝

1.3.7.1? 單因素試驗(yàn)

a.發(fā)酵溫度對(duì)辣椒紅酸湯發(fā)酵品質(zhì)的影響

在試驗(yàn)得出的辣椒紅酸湯最佳配方的基礎(chǔ)上，研究不同發(fā)酵溫度（24，26，28，30，32 ℃）、接菌量3%、發(fā)酵15 d對(duì)辣椒紅酸湯發(fā)酵品質(zhì)的影響。

b.發(fā)酵時(shí)間對(duì)辣椒紅酸湯發(fā)酵品質(zhì)的影響

在試驗(yàn)得出的辣椒紅酸湯最佳配方的基礎(chǔ)上，研究不同發(fā)酵時(shí)間（9，11，13，15，17 d）、接菌量3%、發(fā)酵溫度28 ℃對(duì)辣椒紅酸湯發(fā)酵品質(zhì)的影響。

c.接菌量對(duì)辣椒紅酸湯發(fā)酵品質(zhì)的影響

在試驗(yàn)得出的辣椒紅酸湯最佳配方的基礎(chǔ)上，研究不同接菌量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵15 d對(duì)辣椒紅酸湯發(fā)酵品質(zhì)的影響。

1.3.7.2? 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接菌量為因素，以總酸含量和感官評(píng)分為響應(yīng)值設(shè)計(jì)辣椒紅酸湯三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.4? 數(shù)據(jù)處理與分析

所有樣品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析和圖表均使用Excel 2019軟件完成。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 辣椒紅酸湯配方優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

總酸是判斷發(fā)酵食品品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，總酸含量的高低直接影響產(chǎn)品的口感。感官評(píng)價(jià)廣泛應(yīng)用在食品工藝優(yōu)化中，是產(chǎn)品色、香、味綜合評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。在單因素試驗(yàn)中，使用不同配比的發(fā)酵菌種BY2-2與RB2-1發(fā)酵辣椒紅酸湯后，總酸含量和感官評(píng)分差異明顯（見(jiàn)圖1中a），當(dāng)BY2-2與RB2-1的配比為1∶1和1∶2時(shí)，總酸含量較高，當(dāng)BY2-2與RB2-1的配比為1∶2時(shí)感官評(píng)分最高，因此選擇BY2-2與RB2-1的配比為1∶2作為辣椒紅酸湯的混合發(fā)酵菌。

大蒜是一種常用的食品配料，大蒜素和S-烯丙基-L-半胱氨酸是大蒜中主要的活性物質(zhì)。經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵的大蒜不但可以降低大蒜自帶的刺激性辣味，而且有利于大蒜中活性物質(zhì)的生成。大蒜添加量對(duì)辣椒紅酸湯總酸含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖1中b，一定含量的大蒜對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力沒(méi)有明顯的抑制或促進(jìn)作用。當(dāng)大蒜添加量小于7%時(shí)，大蒜發(fā)酵的香味不夠濃郁，當(dāng)大蒜添加量大于7%時(shí)感官評(píng)分下降，因此選擇大蒜添加量為7%。

食鹽是食品加工過(guò)程中不可缺少的原料，一定濃度的食鹽不僅具有防腐、增鮮等作用，而且可以提升發(fā)酵食品的感官和風(fēng)味品質(zhì)。食鹽添加量對(duì)辣椒紅酸湯總酸含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖1中c，當(dāng)食鹽添加量大于6%時(shí)，辣椒紅酸湯的總酸含量迅速下降，這可能是由于高鹽濃度抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵緩慢。高鹽濃度雖然在色澤和質(zhì)地上賦予紅酸湯較好的感官，但是感官評(píng)價(jià)中權(quán)重較高的滋味和香味評(píng)價(jià)較差，綜合總酸含量和感官評(píng)分，選擇食鹽添加量為6%最適宜。

生姜中含有多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，因此生姜的加入使辣椒紅酸湯的風(fēng)味更豐富。生姜添加量對(duì)辣椒紅酸湯總酸含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖1中d，當(dāng)生姜添加量大于5%時(shí)，總酸含量和感官評(píng)分迅速下降。生姜添加量過(guò)高時(shí)，辣椒紅酸湯的顏色變暗，質(zhì)地較粗糙，滋味和香味上姜味過(guò)濃，削弱了辣椒紅酸湯的酸辣味道，因此選擇生姜添加量為3%。

2.2? 辣椒紅酸湯發(fā)酵工藝的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

發(fā)酵時(shí)間對(duì)辣椒紅酸湯總酸含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖2中a，總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，前期發(fā)酵時(shí)間不足，產(chǎn)品酸度過(guò)淡、不夠濃郁，使得整體感官評(píng)分不高，發(fā)酵第15天時(shí)，總酸含量和感官評(píng)分均達(dá)到最高。隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)品中酸過(guò)度積累，從而影響最終產(chǎn)品發(fā)酵的進(jìn)行。

發(fā)酵溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)和酶活性有重要影響。在發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵溫度的升高，乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌種的過(guò)程更快，發(fā)酵樣品的pH值下降，乳酸和游離氨基酸濃度均有所增加，但是當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)乳酸菌生長(zhǎng)的溫度范圍時(shí)則不利于發(fā)酵的進(jìn)行。發(fā)酵溫度對(duì)辣椒紅酸湯總酸含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖2中b，總酸含量與感官評(píng)分的變化趨勢(shì)基本一致，發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，總酸含量和感官評(píng)分均達(dá)到峰值。

乳酸菌接菌量對(duì)辣椒紅酸湯總酸含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖2中c，接菌量不同，辣椒紅酸湯產(chǎn)品所產(chǎn)生的總酸含量呈不規(guī)則變化，感官評(píng)分隨著接菌量的增加而增加，在接菌量大于4%時(shí)感官評(píng)分明顯下降。在接菌量較低時(shí)，由于乳酸菌底數(shù)少，發(fā)酵較慢，總酸含量低，接菌量為5%時(shí)，由于接菌量過(guò)大，底物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以維持乳酸菌生長(zhǎng)需求，抑制了乳酸菌的發(fā)酵。

2.3? 發(fā)酵工藝的響應(yīng)面分析

2.3.1? Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在糟辣椒發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接菌量三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，以總酸含量、感官評(píng)分為指標(biāo)，由Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2? 擬合模型的建立及方差分析

通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)17個(gè)響應(yīng)面試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，分別建立以總酸含量、感官評(píng)分為指標(biāo)的多元二項(xiàng)式回歸方程：總酸含量=15.41-0.61A+0.13B+0.6C-0.42AB+0.025AC+0.21BC-3.28A2-1.24B2-2.04C2。感官評(píng)分=8.56-0.013A+0.065B+0.18C-0.30AB+0.027AC+0.089BC-1.06A2-0.74B2-0.82C2。

對(duì)方程進(jìn)行方差分析，各變量分析結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

由表3和表4可知，總酸含量、感官評(píng)分回歸模型均極顯著（P<0.000 1），失擬項(xiàng)均不顯著（P>0.05），說(shuō)明回歸方程具有一定的可靠性；同時(shí)模型相關(guān)系數(shù)分別為總酸含量R2=0.976 9、感官評(píng)分R2=0.967 8，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)分別為總酸含量RAdj2=0.953 4、感官評(píng)分RAdj2=0.949 2，表明模型的擬合度高。根據(jù)F值的大小，對(duì)辣椒紅酸湯總酸含量的影響從大到小為發(fā)酵時(shí)間>接菌量>發(fā)酵溫度；對(duì)感官評(píng)分的影響從大到小為接菌量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度。

2.3.3? 總酸與各因素交互作用分析

通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件模擬得到的三維響應(yīng)面和等高線圖見(jiàn)圖3～圖5，可以進(jìn)一步描述各因素之間相互作用對(duì)辣椒紅酸湯總酸含量的影響，隨著發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和接菌量的增加，總酸含量先升高后降低。根據(jù)響應(yīng)面原理分析，響應(yīng)面彎曲弧度越大、等高線圖呈橢圓形說(shuō)明兩因素的交互作用越明顯，對(duì)總酸含量的影響越顯著。

由圖3～圖5可知，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用顯著，發(fā)酵溫度和接菌量、發(fā)酵時(shí)間和接菌量的交互作用不顯著。

2.3.4? 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

由響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間12.947 d、發(fā)酵溫度27.819 ℃、接菌量3.789%，該條件下總酸含量為8.417 g/kg，感官評(píng)分為8.741。按照實(shí)際操作的可行性，將優(yōu)化工藝調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間13 d、發(fā)酵溫度28 ℃、接菌量4%，因總酸含量和感官評(píng)分都保留小數(shù)點(diǎn)后兩位，因此將預(yù)測(cè)總酸含量調(diào)整為8.42 g/kg，將預(yù)測(cè)感官評(píng)分調(diào)整為8.74。根據(jù)優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到驗(yàn)證總酸含量和驗(yàn)證感官評(píng)分，分析實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的差異，見(jiàn)表5。

由表5可知，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間平均偏差均小于5%，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相近，說(shuō)明建立的模型擬合度好，優(yōu)化后的工藝條件有極高的可信度。

3? 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化辣椒紅酸湯發(fā)酵配方，確定最佳配方：發(fā)酵菌液BY2-2與RB2-1的比例為1∶2，食鹽添加量為6%，大蒜添加量為7%，生姜添加量為3%。在確定了辣椒紅酸湯的最佳配方后，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化辣椒紅酸湯發(fā)酵工藝，最優(yōu)發(fā)酵工藝為接菌量4%，在28 ℃條件下發(fā)酵15 d，在此工藝條件下，辣椒紅酸湯的總酸含量最高達(dá)8.31 g/kg，感官評(píng)分最高，達(dá)8.68，表明該數(shù)據(jù)模型的擬合程度較好，為后續(xù)紅酸湯相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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