響應(yīng)面法優(yōu)化山楂多糖和山藥多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究

楊欣宇 高賽 劉寅初 高曉煒 馮隨 高曉光

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.07.006

引文格式：楊欣宇，高賽，劉寅初，等.響應(yīng)面法優(yōu)化山楂多糖和山藥多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究.中國調(diào)味品，2024，49（7）：38-44，59.

YANG X Y， GAO S， LIU Y C， et al.Optimization of extraction process of polysaccharides from hawthorn and yam by response surface methodology and study on their antioxidant activities.China Condiment，2024，49（7）：38-44，59.

摘要：該研究優(yōu)化超聲波輔助熱水提取山楂多糖和山藥多糖的工藝，并研究其單糖組成和抗氧化活性。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以超聲時間、料液比和浸提溫度為因素，以多糖提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法建立模型并分析。研究發(fā)現(xiàn)山楂多糖提取工藝的最佳參數(shù)為超聲時間28 min、料液比1∶24.8（g/mL）、浸提溫度71.5 ℃、浸提時間120 min，在此條件下，提取率為49.09%；山藥多糖提取工藝的最佳參數(shù)為超聲時間42 min、料液比1∶30（g/mL）、浸提溫度70.0 ℃、浸提時間180 min，在此條件下，提取率為12.81%。通過離子色譜法確定了山楂多糖和山藥多糖的單糖組成和比例。由體外抗氧化試驗可知，山楂多糖對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基的清除率分別為80.58%、97.61%、68.4%，表現(xiàn)出較強的自由基清除能力。

關(guān)鍵詞：山楂多糖；山藥多糖；單糖；超聲波；自由基；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.1????? 文獻標(biāo)志碼：A????? 文章編號：1000-9973（2024）07-0038-07

Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Hawthorn and Yam by

Response Surface Methodology and Study on Their Antioxidant Activities

YANG Xin-yu1， GAO Sai1， LIU Yin-chu1， GAO Xiao-wei4， FENG Sui2，3， GAO Xiao-guang1*

（1.College of Food and Biology， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018，

China; 2.Hebei Double Pigeon Foodstuffs Co.， Ltd.， Shijiazhuang 050021， China; 3.Shijiazhuang

Pig Industry Technology Research Institute， Shijiazhuang 050021， China; 4.Langfang

Shengwei Foodstuffs Co.， Ltd.， Langfang 065600， China）

Abstract： In this study， the process of ultrasound-assisted hot water extraction of hawthorn polysaccharides and yam polysaccharides is optimized， and their monosaccharide composition and antioxidant activity are investigated. On the basis of single factor test， with ultrasonic time， solid-liquid ratio and extraction temperature as the factors and polysaccharide extraction yield as the response value， the model is established and analyzed by response surface method. It is found that the optimal parameters of extraction process of polysaccharides from hawthorn are? ultrasonic time of 28 min， solid-liquid ratio of 1∶24.8（g/mL）， extraction temperature of 71.5 ℃ and extraction time of 120 min， under these conditions， the extraction yield is 49.09%. The optimal parameters of extraction process of polysaccharides from yam are ultrasonic time of 42 min， solid-liquid ratio of 1∶30 （g/mL）， extraction temperature of 70.0 ℃ and extraction time of 180 min， under these conditions， the extraction yield is 12.81%. The monosaccharide composition and proportion of polysaccharides from hawthorn and yam are determined by ion chromatography. In vitro antioxidant test shows that the scavenging rates of hawthorn polysaccharides on DPPH free radicals， ABTS free radicals and hydroxyl free radicals are 80.58%， 97.61%， 68.4% respectively， showing stronger free radical scavenging capacity.

Key words： hawthorn polysaccharides; yam polysaccharides; monosaccharides; ultrasound; free radicals; antioxidant activity

收稿日期：2023-12-12

基金項目：河北省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金

作者簡介：楊欣宇（1999—），女，碩士，研究方向：畜產(chǎn)科學(xué)。

*通信作者：高曉光（1984—），男，副教授，博士，研究方向：畜產(chǎn)科學(xué)。

山楂是一種藥食同源、歷史悠久的核果類水果，核硬皮薄，主要分布在中國北方地區(qū)。山楂果肉、果核和葉片中含有豐富的多糖、有機酸和維生素等功能性成分，具有較高的營養(yǎng)價值。山藥也被稱作薯蕷，是薯蕷科薯蕷屬藤本植物，作為藥食同源植物，富含多糖、黃酮和皂苷等活性成分，具有健脾、養(yǎng)肺和提高免疫力的作用。多糖是由多個單糖以不同比例的α或β糖苷鍵組成的聚合物，參與組成植物細胞壁，在自然界中廣泛存在，對生物體的生命活動有著重要意義。植物多糖具有抗氧化、促進胃腸功能、保護肝臟和抑制腫瘤細胞生長等生理活性，副作用小，得到越來越多研究者的關(guān)注，在生活中的許多領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。提取方法直接影響植物多糖的提取率。傳統(tǒng)熱提取方法成本低、操作方便，但色素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)易溶解，后續(xù)分離純化難度大。酶法提取效率高、條件溫和，但易受環(huán)境因素的影響。能耗低、耗時短的微波和超聲輔助提取方法容易引起多糖降解。本研究以山楂和山藥為研究對象，采用單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化山楂多糖和山藥多糖超聲波輔助熱水提取條件，檢測其體外抗氧化能力，促進山楂和山藥資源的充分合理利用，為提高山楂多糖和山藥多糖的生物活性提供了理論參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

1.1.1? 材料與試劑

試驗所用山楂產(chǎn)自山東省，山藥產(chǎn)自河北省保定市。

DPPH、硫酸亞鐵、葡萄糖、無水乙醇、苯酚：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸：廣州市華迪化工有限公司；正丁醇、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250：北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫、水楊酸、抗壞血酸：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2? 儀器與設(shè)備

FSJ302-5高速萬能粉碎機? 天津市泰斯特儀器有限公司；PS-40超聲波清洗機? 濟南瑞萊鉑智能科技有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋? 華熙昕瑞（青島）分析儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器? 上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10D冷凍干燥機? 四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司；UV-5800紫外分光光度計? 上海元析儀器有限公司。

1.2? 多糖的提取

1.2.1? 原料預(yù)處理

將山楂清洗、去核后切片，烘干粉碎，過120目篩。

將山藥清洗、去皮后切片，凍干粉碎，過120目篩。

1.2.2? 多糖提取工藝流程

山楂、山藥粉末→熱水提取→離心→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→醇沉→凍干→粗多糖。

1.3? 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=13.867 8x+0.028 6，R2=0.998。

多糖得率（%）=C×V×NM×103×100%。

式中：C為多糖樣品溶液的濃度（mg/mL）；V為定容體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為山楂或山藥樣品的質(zhì)量（g）。

1.4? 多糖蛋白質(zhì)含量的測定

使用Savage法重復(fù)脫蛋白8次，得到脫蛋白的粗多糖提取物，按照SN/T 3926—2014中的考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.71x+0.014，R2=0.998。式中：y為595 nm處的吸光度值，x為牛血清蛋白的濃度（mg/mL）。

1.5? 多糖單糖組分的測定

1.5.1? 多糖的水解

稱取一定量的多糖樣品，加入1 mL 2 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液，于120 ℃加熱2 h。用氮氣吹干，用甲醇溶液洗滌，再次吹干，反復(fù)3次，用超純水復(fù)溶即可獲得多糖水解液。

1.5.2? 色譜條件

采用Thermo ICS-5000+離子色譜儀測定單糖組成，液相色譜柱選用DionexTM CarboPacTM PA20離子色譜柱。

1.6? 單因素試驗

選取4個試驗因素浸提溫度、超聲時間、料液比和浸提時間，討論其對多糖提取率的影響，試驗參數(shù)見表1和表2。

1.7? 響應(yīng)面試驗

以多糖提取率作為響應(yīng)值，以超聲時間、料液比、浸提溫度為考察因素，利用響應(yīng)面法設(shè)計試驗，具體因素水平值見表3和表4。

1.8? 抗氧化活性分析

1.8.1? 多糖清除DPPH自由基能力測定

參考Yang等的方法，測定樣品在517 nm處的吸光度。

1.8.2? 多糖清除羥基自由基能力測定

參考陳灼娟等的方法，測定樣品在510 nm處的吸光度。

1.8.3? 多糖清除ABTS自由基能力測定

參考劉羽婷等的方法，測定樣品在734 nm處的吸光度。

1.9? 試驗數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用Design-Expert 11.1.1.0軟件進行響應(yīng)面分析，使用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用Origin 2019軟件繪圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 多糖的單糖組成

13種單糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的色譜圖見圖1，山楂多糖和山藥多糖水解液的色譜圖分別見圖2和圖3。根據(jù)出峰時間，定性分析單糖組成。山楂多糖的單糖組成及比例為巖藻糖∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶木糖∶半乳糖醛酸∶甘露糖醛酸為0.48∶2.77∶11.02∶3.57∶56.02∶1.11∶22.70∶2.33；山藥多糖的單糖組成及比例為半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖醛酸為0.26∶95.49∶4.25。其中，葡萄糖是山楂和山藥多糖中含量最高的單糖，分別占比56.02%和95.49%。

2.2? 單因素試驗

由圖4可知，當(dāng)浸提溫度從40 ℃升至80 ℃時，山楂多糖提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，與王楊等的研究中提取溫度對油茶籽多糖提取率的影響的變化趨勢一致。當(dāng)浸提溫度為70 ℃時，山楂多糖提取率達到最大值47.53%。溫度升高有利于多糖析出，溫度過高會造成多糖結(jié)構(gòu)降解，提取率大幅降低，故選擇超聲波輔助熱水提取山楂多糖的浸提溫度為70 ℃。當(dāng)浸提溫度從50 ℃升至70 ℃時，山藥多糖提取率持續(xù)上升，最高可達12.97%，浸提溫度持續(xù)上升，提取液中的淀粉糊化，多糖提取率和純度受到干擾，故選擇超聲波輔助熱水提取山藥多糖的浸提溫度為70 ℃。

由圖5可知，當(dāng)超聲時間從10 min延長至30 min時，山楂多糖提取率高達45.42%。隨著超聲時間的繼續(xù)增加，提取率顯著降低，長時間超聲處理破壞了多糖的分子結(jié)構(gòu)，故選擇超聲波輔助熱水提取山楂多糖的超聲時間為30 min。超聲屬于彈性機械波，有利于加強溶劑分子的運動，從而提高溶劑在溶質(zhì)中的傳播速度。當(dāng)超聲時間從10 min延長至50 min時，山藥多糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，40 min時山藥多糖提取率達到最大值，故選擇超聲波輔助熱水提取山藥多糖的超聲時間為40 min。

由圖6可知，當(dāng)料液比從1∶10 增至1∶25時，水的占比逐漸升高，氣泡與樣品間的界面面積也不斷增加，細胞壁中活性成分更容易釋放，因此，山楂多糖提取率逐漸增加，最大值為48.27%。繼續(xù)增加料液比到1∶30，料液比過大，影響后續(xù)工作效率，多糖提取率降低，故選擇超聲波輔助熱水提取山楂多糖的料液比為1∶30。當(dāng)料液比從1∶15增至1∶30時，山藥多糖提取率顯著升高，繼續(xù)增大料液比，山藥多糖提取率下降，與李杰等研究料液比對山楂葉多糖得率的影響單因素試驗中的變化趨勢一致。過多的溶劑致使后續(xù)旋蒸等操作困難，工作量增加，故選擇超聲波輔助熱水提取山藥多糖的料液比為1∶30。

由圖7可知，當(dāng)浸提時間從60 min增至120 min時，山楂多糖提取率顯著升高，120 min后隨著浸提時間的延長，山楂多糖提取率沒有顯著變化，這與門志雯等研究的提取時間對山楂多糖得率的影響的變化規(guī)律一致。長時間高溫會影響多糖活性，故選擇超聲波輔助熱水提取山楂多糖的浸提時間為120 min。當(dāng)浸提時間從90 min增至180 min時，山藥多糖提取率持續(xù)上升，高達12.96%。隨著浸提時間的繼續(xù)延長，山藥多糖提取率變化不大，多糖得率趨近穩(wěn)定，大部分多糖已經(jīng)溶出，浸提時間的延長對多糖提取率的影響不顯著，故選擇超聲波輔助熱水提取山藥多糖的浸提時間為180 min。

2.3? 山楂多糖響應(yīng)面試驗

山楂多糖響應(yīng)面試驗結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

通過回歸擬合，獲得山楂多糖提取率（Y）與自變量（超聲時間、料液比、浸提溫度）的二次多項式回歸方程：Y=48.6－0.502 8A－0.409 1B+1.30C+0.493 6AB－0.284 6AC+1.45BC－2.05A2－2.84B2－4.14C2?；貧w模型的P＜0.01，失擬項的P=0.278 8＞0.05，無顯著性影響，該模型與試驗結(jié)果的擬合程度較好。影響山楂多糖提取率的因素有超聲時間、料液比和浸提溫度，其中浸提溫度（C）的影響最大，超聲時間（A）的影響次之，料液比（B）的影響最小。

由表6和圖8可知，AB、AC和BC之間的交互作用對山楂多糖提取工藝的影響不顯著（P＞0.05）。

通過求解回歸方程，獲得超聲波輔助熱水提取山楂多糖的最佳條件為超聲時間28.26 min、料液比1∶24.77（g/mL）、浸提溫度71.54 ℃，此條件下山楂多糖提取率理論預(yù)測值為48.81%。在此條件下進行3次驗證試驗，得到山楂多糖提取率的平均值為49.09%，與理論預(yù)測值相差0.28%，表明回歸模型具有參考價值。

2.4? 山藥多糖響應(yīng)面試驗

山藥多糖響應(yīng)面試驗結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。

通過回歸擬合，獲得山藥多糖提取率（Y′）與自變量（超聲時間、料液比、浸提溫度）的二次多項式回歸方程：Y′=12.9+0.101 8A′+0.476 0B′+0.346 0C′－0.102 5A′B′－0.341 0A′C′－0.273 5B′C′－1.06A′2－0.842 9B′2－1.35C′2。回歸模型的P＜0.01，失擬項（P=0.719 0）不顯著，該模型與試驗結(jié)果的擬合程度較好，具有統(tǒng)計學(xué)意義。影響山藥多糖提取率的因素有超聲時間、料液比和浸提溫度，其中超聲時間（A′）>料液比（B′）＞浸提溫度（C′）。

由表8和圖9可知，A′B′、A′C′和B′C′之間的交互作用對山藥多糖提取工藝的影響不顯著（P＞0.05）。

通過求解回歸方程，獲得超聲輔助熱水提取山藥多糖的最佳條件為超聲時間42.60 min、料液比1∶30.49（g/mL）、浸提溫度70.18 ℃，此條件下山藥多糖提取率的理論預(yù)測值為12.98%。經(jīng)驗證，山藥多糖提取率的平均值為12.81%，與理論預(yù)測值相差0.17%，表明回歸模型有效、可靠。

2.5? 抗氧化活性

自由基清除能力是評估抗氧化性最常用的方法。試驗過程中，DPPH自由基與抗氧化物快速、靈敏地相互作用；多糖與ABTS自由基發(fā)生反應(yīng)，致使藍色絡(luò)合物的顏色變澄清；H2O2作為活潑的氧化過程的中間產(chǎn)物，象征著樣品對活性氧的清除能力。在特定波長下測量以評估多糖的抗氧化能力。

研究結(jié)果表明，在特定范圍內(nèi)，多糖濃度與其自由基清除能力之間存在良好的線性關(guān)系，由圖10～圖12可知，多糖濃度越大，清除3種自由基的能力越強。當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時，山楂多糖和山藥多糖對DPPH自由基的清除率分別為80.58%和60.23%，對ABTS自由基的清除率分別為97.61%和66.64%，對羥基自由基的清除率分別為68.4%和50.46%。該研究證明了多糖濃度與抗氧化活性之間的顯著關(guān)系，山楂多糖和山藥多糖的抗氧化能力都很強，山楂多糖的抗氧化能力顯著優(yōu)于山藥多糖，在天然抗氧化劑的開發(fā)利用中具有潛在價值。

3? 結(jié)論

采用單因素試驗和響應(yīng)面法確定超聲波輔助熱水提取多糖的最佳工藝參數(shù)，山楂多糖最佳提取參數(shù)為超聲時間28 min、料液比1∶24.8（g/mL）、浸提溫度71.5 ℃、浸提時間120 min，此條件下提取率為49.09%。山藥多糖最佳提取參數(shù)為超聲時間42 min、料液比1∶30 （g/mL）、浸提溫度70.0 ℃、浸提時間180 min，此條件下提取率為12.81%，與理論預(yù)測值無顯著性差異（P＞0.05），模型有效可行。山楂多糖的單糖組成及比例為巖藻糖∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶木糖∶半乳糖醛酸∶甘露糖醛酸為0.48∶2.77∶11.02∶3.57∶56.02∶1.11∶22.70∶2.33；山藥多糖的單糖組成及比例為半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖醛酸為0.26∶95.49∶4.25。研究表明，山楂多糖具有更強的自由基清除能力。本文獲得了超聲波輔助熱水提取多糖的最佳工藝，且證實山楂多糖和山藥多糖具有較強的抗氧化活性，為山楂多糖和山藥多糖的工業(yè)化提取提供了理論依據(jù)，）為多糖生物活性研究提供了參考。

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