肝刺激因子促進(jìn)過氧化氫誘導(dǎo)的肝星形細(xì)胞凋亡

艾偉倫，董凌月，安威

（首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系肝臟保護(hù)與再生北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

肝纖維化（liver fibrosis）是肝臟受損后，膠原等細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積的病理過程[1]。肝星形細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝臟內(nèi)的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其活化是肝纖維化進(jìn)程中細(xì)胞外基質(zhì)最主要的來源。HSC活化并進(jìn)而轉(zhuǎn)分化為肌成纖維樣細(xì)胞[2]的特征包括細(xì)胞的增殖、趨化、凋亡抑制和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[3]。研究顯示促進(jìn)活化型HSC凋亡能夠減少活化型HSC的數(shù)量，從而最終減輕肝臟纖維化[2]。因此認(rèn)識(shí)其活化特征并探尋參與其中的關(guān)鍵分子是研究肝纖維化細(xì)胞學(xué)機(jī)制的關(guān)鍵。肝刺激因子（hepatic stimulator substance，HSS）是從肝部分切除術(shù)后初斷乳的大鼠再生肝中提取的一種生物活性蛋白[4]，能夠刺激肝臟再生，并保護(hù)肝臟免受毒物損傷[5]。HSS與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，例如，在非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic steatohepatitis，NASH）模型中，肝細(xì)胞的凋亡伴隨著HSS表達(dá)的降低，這提示HSS與肝細(xì)胞凋亡存在密切的關(guān)系[6]。此外，HSS能夠減少肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的損傷，抑制肝細(xì)胞凋亡[7]。除肝細(xì)胞外，HSS還在HSC中表達(dá)[8]。然而，HSS與HSC的凋亡之間的相關(guān)性仍然不明。因此本實(shí)驗(yàn)建立HSS過表達(dá)HSC細(xì)胞模型后，利用過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）構(gòu)建活化型HSC的凋亡模型[9]，以此探究HSS對(duì)活化型HSC凋亡的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和主要試劑

人肝星形細(xì)胞LX-2細(xì)胞系，其表型為活化型HSC（本實(shí)驗(yàn)室保存）。DMEM（Dulbecco’s modifi ed Eagle medium）、Opti-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Gibco公司）。胰蛋白酶和蛋白酶抑制劑（美國sigma公司）。細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）。pcDNA3.0質(zhì)粒（InvitrogenTM）（美國Thermo Fisher 公司）。pcDNA3.0-HSS質(zhì)粒系本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[7]。轉(zhuǎn)染試劑（FuGENE? HD）（美國Promega公司）。兔抗HSS/ALR多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體和山羊抗兔IgG抗體（美國proteintech公司）。Caspase-Glo? 3/7 Assay試劑盒（美國Promega公司）。Hoechst 33342熒光染料、DAPI（4’,6-diamidino-2-phenylindole）熒光染料、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）（上海碧云天生物技術(shù)公司）。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

LX-2細(xì)胞系培養(yǎng)于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，使用含有10%FBS的DMEM。培養(yǎng)過程中，3d換液一次，待融合至80%～90%進(jìn)行傳代。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的LX-2細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于六孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)22h至融合達(dá)90%，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。取4支無菌Eppendorf管，分別加入Opti-MEM培養(yǎng)基100μl。然后向其中2支分別加入2μg pcDNA3.0-HSS和pcDNA3.0質(zhì)粒，渦旋混勻，室溫靜置5min；剩余兩只分別加入6μl轉(zhuǎn)染試劑，渦旋混勻，室溫靜置5min。分別將各組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫靜置20min。吸棄培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液，并用PBS輕柔洗去剩余培養(yǎng)基。將上述轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒混合液加入培養(yǎng)板中，并添加含有10% FBS的DMEM至每孔液體終體積2ml。轉(zhuǎn)染18h，棄去含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)3d。轉(zhuǎn)染后的兩組細(xì)胞，分別命名為HSS-Tr組（HSS過表達(dá)組）和Vector-Tr（質(zhì)粒對(duì)照組）。轉(zhuǎn)染完畢后，PBS輕柔洗去培養(yǎng)板中培養(yǎng)基2次，隨后每孔加入含有2.5μmol/L H2O2和10% FBS的DMEM 1ml，培養(yǎng)細(xì)胞20min厚，收集細(xì)胞，進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

3 Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率

細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕柔清洗培養(yǎng)板中剩余培養(yǎng)基2次。每孔加入4℃預(yù)冷的新鮮加入蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液100μl。使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞收集至Eppendorf管中，冰上裂解30min，每隔10min渦旋30s，共3次。4℃、12000r/min離心10min后收集上清液，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，制備樣本，99℃變性5min，立即置于冰上，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳后利用電轉(zhuǎn)印的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至0.22μm PVDF膜上，步驟詳見本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文章[10]。將膜放入15ml含有5%脫脂奶粉的1×TBST中，室溫?fù)u床封閉1h。按照1∶2500的稀釋比例將兔抗HSS/ALR多克隆抗體或兔抗GAPDH多克隆抗體加入到0.5%脫脂奶粉中，配制第一抗體工作液。PVDF膜浸于第一抗體工作液中4℃搖床過夜。1×TBST漂洗10min，重復(fù)3次。按照1∶4000的稀釋比例將山羊抗兔IgG抗體加入到0.5%脫脂奶粉中，配制第二抗體工作液。PVDF膜浸于第二抗體工作液中，室溫?fù)u床孵育1h，1×TBST漂洗10min，重復(fù)4次，使用化學(xué)發(fā)光儀（C-DiGit? Blot Scanner, 美國Li-Cor公司）顯影。顯影后的數(shù)字化圖片，通過軟件Image J進(jìn)行強(qiáng)度分析，從而獲得HSS和GAPDH（內(nèi)參）表達(dá)量的數(shù)據(jù)。最終通過比較二者表達(dá)量，從而獲得定量結(jié)果。

4 Hoechst 33342染色

按照文獻(xiàn)所述進(jìn)行操作[11]，具體步驟如下：充分棄去H2O2處理后細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用PBS輕柔洗去培養(yǎng)基2次，充分棄去后每孔加入10μg/ml Hoechst 33342，37℃培養(yǎng)箱中染色30min。用PBS輕柔洗去染色液2次，充分棄去后每孔加入1ml PBS。應(yīng)用熒光顯微鏡（FW4000，德國Leica公司）觀察和拍攝圖片，每個(gè)樣本隨機(jī)拍攝6個(gè)視野。注意拍攝圖片時(shí)，應(yīng)保證曝光度和對(duì)比度保持一致。隨后使用Image J軟件計(jì)算每張圖片（相同放大倍數(shù)下）總細(xì)胞數(shù)和Hoechst陽性細(xì)胞數(shù)。

5 TUNEL細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

按1×104個(gè)細(xì)胞的比例將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24h。H2O2處理細(xì)胞后，充分棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30min，隨后0.5%Triton X-100室溫孵育5min；PBS洗滌3次，每次5min。按1∶9的比例避光混合TdT酶和熒光標(biāo)記液，配制TUNEL檢測(cè)液。充分棄去各孔PBS，每孔加入TUNEL檢測(cè)液50μl，37℃孵育60min后加入DAPI復(fù)染5min。PBS洗滌細(xì)胞3次。熒光顯微鏡觀察和拍攝圖片每個(gè)樣本隨機(jī)拍攝6個(gè)視野。拍攝圖片時(shí)，保證曝光度和對(duì)比度保持一致。隨后使用Image J軟件計(jì)算每張圖片（相同放大倍數(shù)下）TUNEL細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)。

6 Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)

將H2O2處理后的細(xì)胞用PBS洗滌3次后，收集細(xì)胞于Eppendorf管中。室溫，800r/min離心5min，收集細(xì)胞。用1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，室溫800r/min離心5min，充分棄去上清后加入195μl 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞沉淀。加入5μl Annexin VFITC和5μl PI避光染色25min。流式細(xì)胞分析儀（D3130，ACEA Biosciences公司）分析檢測(cè)。

7 Caspase 3/7活性檢測(cè)

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，步驟如下：按1×104個(gè)細(xì)胞的比例將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24h。H2O2處理細(xì)胞后，充分棄去培養(yǎng)基，使用PBS輕柔洗去培養(yǎng)基2次，每孔加入100μl caspase 3/7活性檢測(cè)液和100μl DMEM，振蕩混勻，37℃反應(yīng)30min后，800r/min離心5min，收集上清液至不透光塑料檢測(cè)板中，使用96孔板熒光檢查儀（Glo-MaxTM，Promega公司）測(cè)定熒光素酶活性。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 16.0.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，兩組間比較采用Student’t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05被認(rèn)為有顯著性差異。各個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

結(jié) 果

Western blot檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA-HSS的LX-2細(xì)胞（HSS-Tr組）內(nèi)HSS水平顯著高于轉(zhuǎn)染空載體的LX-2細(xì)胞（Vector-Tr組）（圖1），說明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，過表達(dá)HSS的LX-2細(xì)胞模型構(gòu)建成功，可用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

圖1 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。A，代表性Western blot結(jié)果；B，Western blot檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； *P＜0.05（n=3）Fig. 1 Transfection efficiency was conf i rmed by Western blotting. A, representative results of Western blot.; B, statistical analysis of Western blot results.*P＜0.05 (n=3)

為明確HSS對(duì)H2O2誘導(dǎo)HSC凋亡的作用，應(yīng)用Hoechst 33342染色檢測(cè)了過表達(dá)HSS對(duì)H2O2誘導(dǎo)HSC凋亡的影響。將細(xì)胞分成4組，實(shí)驗(yàn)組的Vector-Tr和HSS-Tr細(xì)胞分別給予2.5μmol/L H2O2刺激20min；對(duì)照組為Vector-Tr和HSS-Tr細(xì)胞分別添加等體積雙蒸水處理20min。加入Hoechst 33342染液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSS-Tr組（過表達(dá)HSS）的H2O2處理細(xì)胞中Hoechst 33342染色陽性細(xì)胞百分比（38.13%±4.15%）顯著高于Vector-Tr組（轉(zhuǎn)染空載體）的H2O2處理細(xì)胞中Hoechst 33342染色陽性細(xì)胞百分比（28.35%±1.83%）（圖2）。

圖2 HSS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響的Hoechst 33342染色檢測(cè)。A， Hoechst 33342染色，箭頭示Hoechst 33342陽性細(xì)胞；比例尺，50μm；B， Hoechst 33342染色陽性細(xì)胞百分比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；共進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組細(xì)胞隨機(jī)拍照6個(gè)視野；*P＜0.05Fig. 2 Hoechst 33342 stain to evaluate the effect of HSS on cell apoptosis induced by hydrogen peroxide. A, representative images of Hoechst 33342 stain. White arrows pointed at Hoechst 33342-positive cells; scale bar, 50μm;. B, statistical analysis of Hoechst 33342 positive cells. Graph represented the average of 3 independent repeats. Each group had 6 randomly selected fields; *P＜0.05

為進(jìn)一步驗(yàn)證Hoechst染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用紅色熒光標(biāo)記的TUNEL染色液檢測(cè)了H2O2刺激后各組細(xì)胞的凋亡情況。熒光顯微鏡觀察TUNEL染色和DAPI復(fù)染的細(xì)胞顯示，與Vector-Tr組H2O2處理細(xì)胞相比，HSS-Tr組H2O2處理細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞顯著性增多（圖3）。

圖3 HSS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響的TUNEL染色檢測(cè)。A，TUNEL染色，DAPI復(fù)染，箭頭示TUNEL染色陽性細(xì)胞；比例尺，50μm；B，TUNEL染色陽性細(xì)胞百分比的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；共進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每組細(xì)胞隨機(jī)拍照6個(gè)視野；*P＜0.05Fig. 3 TUNEL staining to show the effect of HSS on cell apoptosis induced by hydrogen peroxide. A, representative images of TUNEL staining. White arrows pointed at TUNEL-positive cells; scale bar, 50μm;. B, statistical analysis of TUNEL positive cells. Graph represented the average of 3 independent repeats. Each group had 6 randomly selected fields; *P＜0.05

進(jìn)一步應(yīng)用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示， H2O2刺激后，與Vector-Tr組細(xì)胞相比，過表達(dá)HSS的LX-2細(xì)胞晚期凋亡（Annexin V和PI雙陽性）數(shù)目顯著性增加；與此對(duì)應(yīng)，正常細(xì)胞（Annexin V陰性PI陽性）數(shù)目則顯著性減少，而早期凋亡細(xì)胞（Annexin V陽性PI陰性）無明顯差異（圖4）。

圖4 HSS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響的Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。A，細(xì)胞凋亡的Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)分析代表性結(jié)果；B，凋亡細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*P＜0.05（n=3）Fig. 4 Annexin V-FITC/PI stain measured by flow cytometry exhibited the influence of HSS on cell apoptosis induced by hydrogen peroxide. A,representative images of Annexin V-FITC/PI stain detected by flow cytometry; B, statistical analysis of apoptosis. Graph represented the average of 3 independent repeats; *P＜0.05 (n=3)

為了明確HSS是否通過影響調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子caspase3/7而促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，利用Caspase-Glo? 3/7 Assay試劑盒分析了細(xì)胞內(nèi)caspase 3和caspase 7活性。在H2O2刺激后，Vector-Tr組和HSS-Tr組細(xì)胞中caspase 3/7活性均顯著性升高，HSS-Tr組細(xì)胞升高更為顯著（圖5）。

圖5 HSS對(duì)caspase3/7活性影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*P＜0.05（n=3）Fig. 5 Statistical analysis for the effect of HSS on cell caspase3/7 activity.*P＜0.05 (n=3)

討 論

活化型HSC數(shù)目的減少是改善肝纖維化最具特點(diǎn)的特征之一[3]。減少活化型HSC的數(shù)目，可減少膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[3,12]。活化型HSC的減少可以通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道，活化的HSC能夠表達(dá)一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)的受體，例如TNF receptor 1（TNFR1），p75NTR和 TRAIL受體[13]。此外，靜脈注射聚乙二醇化TRAIL能夠促進(jìn)活化型HSC的凋亡，減少四氯化碳所致的肝纖維化[14]。這均說明，活化型HSC的凋亡在改善肝纖維化的過程中具有重要的意義。

然而，對(duì)于HSC的凋亡的研究還十分有限。我們有必要找尋其他的活性蛋白促進(jìn)活化型HSC的凋亡，為治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。已證實(shí)HSS在HSC中表達(dá)，而且23 kD形式主要表達(dá)在線粒體的膜間隙[15]。在肝細(xì)胞中，HSS扮演者守護(hù)者的角色。但是，其在肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的作用和功能仍不明了。在大鼠HSC細(xì)胞系HSC-T6中， HSS能夠減少α-SMA在mRNA水平的表達(dá)，減少膠原的分泌[8]，但目前尚缺少對(duì)HSS效應(yīng)的機(jī)制研究。由于LX-2細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染效率[16]，因此，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中，采取了相同的研究方法，向LX-2細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-HSS，pcDNA3.0-vector質(zhì)粒。Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)HSS的LX-2細(xì)胞模型的建立成功。

細(xì)胞程序性死亡過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)能導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的累積。H2O2誘導(dǎo)HSC凋亡的模型，已經(jīng)廣泛運(yùn)用在細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究之中[9]。我們利用這一模型，證實(shí)在活化型HSC中，H2O2能夠上調(diào)caspase 3和caspase 7的活性，增加活化型HSC的凋亡。Caspase 3和caspase 7是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，能夠抑制DNA的修復(fù)作用，同時(shí)啟動(dòng)DNA的降解[17]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，在H2O2誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞凋亡的模型中，HSS能夠增加caspase 3/7活性，促進(jìn)LX-2細(xì)胞的凋亡。此外，利用Annexin V-FITC和PI共染實(shí)驗(yàn)，通過流式細(xì)胞儀分析，可以區(qū)分早期細(xì)胞凋亡和晚期細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HSS能夠增加晚期細(xì)胞凋亡的數(shù)量，即Annexin V（+）PI（+）數(shù)目顯著性增多。此外，Hoechst 33342細(xì)胞凋亡檢測(cè)和TUNEL染色均證實(shí)了相同的結(jié)果。然而，HSS通過何種途徑增加LX-2細(xì)胞的凋亡，仍然不明。值得一提的是，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的持續(xù)開放，促使線粒體膜電位的下降，導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[18,19]。由于23 kD的HSS定位在線粒體的膜間隙，因此，HSS可能通過影響線粒體的膜通透性或者影響線粒體膜電位，從而激活細(xì)胞程序性死亡。