磷脂酶D的制備及催化磷脂酰膽堿合成磷脂酰絲氨酸

錢 娟，龐 洋，王 昕

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816)

油脂化學(xué)

磷脂酶D的制備及催化磷脂酰膽堿合成磷脂酰絲氨酸

錢 娟，龐 洋，王 昕

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211816)

選用穗色鏈霉菌(Streptomycesracemochromogenes)作為磷脂酶 D 的生產(chǎn)菌株進行了酶的制備及條件優(yōu)化，并在兩相體系中進行了酶催化磷脂酰膽堿合成磷脂酰絲氨酸的研究。結(jié)果表明，最適的產(chǎn)酶條件為葡萄糖 10 g/L、酵母粉5 g/L、魚粉蛋白胨 5 g/L、司班-60 10 g/L、氯化鈣 3 g/L，接種量 1%、培養(yǎng)基初始 pH 7.0、培養(yǎng)溫度 30.℃，在最適產(chǎn)酶條件下酶活達到2 967 U/L，是優(yōu)化前 的2.12 倍；最適的催化工藝條件為有機相二氯甲烷、反應(yīng)溫度35.℃、pH 5.5、酶用量1.15 U/mL、鈣離子濃度10 mmol/L，在該催化工藝條件下反應(yīng)10 h后磷脂酰膽堿的生成率達94%。

穗色鏈霉菌；磷脂酶D；磷脂酰絲氨酸；兩相催化

Abstract：Streptomycesracemochromogeneswas used as the producing strain to prepare phospholipase D and the preparation conditions were optimized.The synthesis of phosphatidylserine from phosphatidylcholine catalyzed by phospholipase D in biphasic catalysis system was studied.The results showed that the optimal conditions for enzyme production were obtained as follows：glucose 10 g/L,yeast extract 5 g/L,fishmeal peptone 5 g/L,Span-60 10 g/L,calcium chlodride 3 g/L,inoculation amount 1%,initial pH of medium 7.0 and cultural temperature 30.℃.Under these conditions,the enzyme activity reached 2 967 U/L,which was 2.12 times of that before optimization.The optimal catalytic process conditions were obtained as follows：dichloromethane as organic phase,reaction temperature 35.℃,pH 5.5,enzyme dosage 1.15 U/mL,Ca2+concentration 10 mmol/L.Under these conditions,the yield of phosphatidylcholine reached 94%.

Keywords：Streptomycesracemochromogenes; phospholipase D; phosphatidylserine; biphasic catalysis

磷脂酰絲氨酸(PS)是一種磷脂，具有很好的健腦功效[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)來源于鏈霉菌的磷脂酶D(PLD)表現(xiàn)出較好的水解和轉(zhuǎn)磷酯化活性[2]，基于PLD所具有的轉(zhuǎn)?；磻?yīng)能力，以大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂(主要成分為磷脂酰膽堿，PC)和L-絲氨酸為底物，以酶法合成磷脂酰絲氨酸(PS)的方法已經(jīng)被廣泛研究。由于底物磷脂酰膽堿為脂溶性物質(zhì)，L-絲氨酸為水溶性物質(zhì)，因此在催化反應(yīng)中一般采用雙向體系來進行。

Juneja等[3]研究表明在乙酸乙酯和醋酸鹽緩沖液雙向體系中，PLD催化合成PS的產(chǎn)率可達98%。Birichevskaya等[4]在雙向體系中PS產(chǎn)率達到81%。Sakai等[5]使用均質(zhì)體系催化合成PS，優(yōu)化后PS的生成率達到46.7%。胡飛[6]使用均相體系，在溶劑體系(2-甲基四氫呋喃/γ-戊內(nèi)酯)中，經(jīng)過條件優(yōu)化后，PS產(chǎn)率達到81%。朱南南[7]利用兩相反應(yīng)體系，有機溶劑為乙醚，PS收率達58.4%。韓海霞[8]利用鏈霉菌CA-1為生產(chǎn)菌株制備PLD，以乙醚-醋酸鹽緩沖液為雙向體系，PS生成率達到67.8%。

本文利用穗色鏈霉菌制備PLD，通過優(yōu)化酶制備和轉(zhuǎn)磷酯化反應(yīng)體系條件，從蛋黃磷脂出發(fā)富集磷脂酰絲氨酸[9]，提高了稀有磷脂的產(chǎn)率，為進一步擴大培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株及試劑

穗色鏈霉菌(Streptomycesracemochromogenes)4.331，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)。蛋黃磷脂(含75%磷脂酰膽堿)，購自北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司；L-絲氨酸，購自阿拉丁試劑；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂25 g/L，pH自然。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)

將經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化的穗色鏈霉菌孢子刮于0.9%的無菌生理鹽水中，制成孢子懸浮液，吸取1 mL 孢子懸浮液于50 mL種子培養(yǎng)基中，200 r/min、30.℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。將種子液以1%的接種量接于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在200 r/min、30.℃條件下培養(yǎng)48 h后，離心棄細胞，取發(fā)酵液上清測定PLD的酶活為1 400 U/L。以初始培養(yǎng)基為對照，每組3組平行，規(guī)定對照條件下的酶活為100%，對產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化。

1.2.2 初始催化體系

在2 mL水相為0.2 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH為5.5)中，加入0.575 U/mL酶液，L-絲氨酸同時溶解于醋酸鹽緩沖液中，磷脂酰膽堿溶解于2 mL二氯甲烷中，磷脂酰膽堿與L-絲氨酸的摩爾比1∶20，反應(yīng)溫度30.℃。在初始催化體系的基礎(chǔ)上，優(yōu)化催化工藝。

1.2.3 酶活的測定

在初始催化體系條件下測定PLD的酶活。

1.2.4 磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸的測定

采用Agilent 1260高效液相色譜儀測定磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸。色譜條件：色譜柱為ZORBAX RX-SIL Columns(4.6 mm×250 mm)；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(體積比85∶15∶0.45∶0.05)為流動相A，以正己烷-異丙醇-流動相A(體積比20∶48∶32)為流動相B，按表1進行梯度洗脫；柱溫為39.℃，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測(參考條件：漂移管溫度65.℃，載氣流量2.0 mL/min)

表1 HPLC梯度洗脫

1.2.5 PS轉(zhuǎn)化率和PS生成率的計算

PS轉(zhuǎn)化率=PS產(chǎn)量/PC消耗量×100%

PS生成率=PS產(chǎn)量/PC初始添加量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 穗色鏈霉菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

碳源是構(gòu)成細胞成分的重要因素，是細胞內(nèi)貯藏物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的骨架，也是微生物生長的主要能量來源[10]。分別以5 g/L葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉作為培養(yǎng)基中碳源，研究不同碳源對產(chǎn)酶的影響，得出產(chǎn)酶情況如圖1所示。

注：A.葡萄糖；B.果糖；C.蔗糖；D.甘油；E.可溶性淀粉。

由圖1可知，葡萄糖作為碳源時，酶活最大，可能是由于葡萄糖為單糖，發(fā)酵時菌絲易于吸收分解，促進菌體快速生長，使產(chǎn)酶量增加，酶活較大；可溶性淀粉次之，甘油和果糖作為碳源時，則不利于產(chǎn)酶。根據(jù)酶活大小，選擇葡萄糖作為最佳碳源。

以優(yōu)化出的葡萄糖作為碳源，其他培養(yǎng)基成份不變，以空白作對照，考察不同的葡萄糖質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 葡萄糖質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，葡萄糖質(zhì)量濃度從5 g/L逐漸增加至10 g/L時，發(fā)酵液中的酶活隨葡萄糖質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，葡萄糖質(zhì)量濃度再增大，酶活下降。因此，葡萄糖最適質(zhì)量濃度為10 g/L。

2.1.2 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

氮源供應(yīng)微生物生長所需，也是細胞合成含氮化合物的主要來源，實驗室常用的有機氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等，無機氮源主要包括銨鹽、硝酸鹽等[11-13]。研究了不同氮源對產(chǎn)酶的影響，氮源質(zhì)量濃度均為10 g/L，復(fù)合氮源均分，總質(zhì)量濃度也為10 g/L，結(jié)果如圖3所示。

注：A.蛋白胨+酵母粉；B.蛋白胨+酵母粉+(NH4)2SO4；C.酵母粉；D.蛋白胨；E.聚蛋白胨；F.魚粉蛋白胨；G.牛肉膏；H.玉米漿；I.(NH4)2SO4；J.魚粉蛋白胨+酵母粉。

圖3不同氮源對產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，當(dāng)?shù)礊橛袡C氮源時，酶活較高；而添加無機氮源時，對培養(yǎng)基pH影響較大，繼而影響酶活。培養(yǎng)基中添加魚粉蛋白胨和酵母粉的復(fù)合氮源時，酶活最高，達到了對照組的2倍?？赡苁菑?fù)合氮源中氨基酸、生長因子等成分配比更適合菌絲生長，產(chǎn)酶量大，發(fā)酵液中酶活大，因此選擇魚粉蛋白胨5 g/L、酵母粉5 g/L作為最佳氮源。

2.1.3 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響

表面活性劑可作用于菌體細胞膜，改善細胞膜的通透性，加速胞外酶的釋放。PLD是一種胞外酶，在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣├碚撋峡梢源龠M酶的釋放[14]?？疾炝藢嶒炇页Ｓ玫膸追N表面活性劑對酶活的影響，每種表面活性劑均添加10 g/L，結(jié)果如圖4所示。

注：A.對照；B.司班-60；C.SDS；D.吐溫20；E.吐溫60；F.吐溫80；G.TritonX-100。

圖4表面活性劑對產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，司班-60，吐溫80，吐溫60等非離子型表面活性劑可以一定程度促進PLD的釋放。而吐溫20對細胞的產(chǎn)酶沒有明顯的提高作用，TritonX-100和SDS的加入不利于菌體生長和酶的生產(chǎn)。因此，在培養(yǎng)基中添加10 g/L司班-60以提高酶的釋放。

2.1.4 鈣離子對產(chǎn)酶的影響

微生物生長繁殖和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的過程中，需要某些微量元素作為其生理活性物質(zhì)的組成物質(zhì)或調(diào)節(jié)物，離子可能會對編碼蛋白酶的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，也會影響胞外酶的酶活[8]。其中，已經(jīng)有文獻報道鈣離子能促進鏈霉菌的產(chǎn)酶，但是機理尚不明確?？赡苁且驗殁}離子是某些酶的輔因子，能影響酶的活性和穩(wěn)定性，有助于鏈霉菌孢子的形成[15]。為研究鈣離子對實驗菌株產(chǎn)酶影響，向培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度氯化鈣，以不加氯化鈣的培養(yǎng)基為對照，結(jié)果如圖5所示。

圖5 鈣離子對產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，氯化鈣為3 g/L時，酶活達到最大值，是對照組的1.69倍，當(dāng)氯化鈣質(zhì)量濃度大于3 g/L 時，酶活開始下降。因此在一定范圍內(nèi)，鈣離子對實驗菌株產(chǎn)酶有促進作用，可能是鈣離子參與PLD的合成，改變酶蛋白的折疊結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)細胞膜流動性，促進PLD分泌到細胞外，使產(chǎn)酶量增加。

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

pH可以影響菌體生長，對酶的活性產(chǎn)生重要的影響繼而改變生物的代謝途徑。研究了不同培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖6所示。不同培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖6 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響

圖7 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，當(dāng)pH從4.0到7.0時，酶活逐漸升高，pH再增大時，酶活開始下降；pH為4.0時，抑制菌體生長，菌體濃度很低，產(chǎn)酶少，大于4.0時，菌體濃度和酶活逐漸增大，推測酸性條件抑制酶的活性，中性偏堿性條件下，酶活也呈下降趨勢，因此選擇最佳培養(yǎng)基初始pH 7.0。

由圖7可知，培養(yǎng)溫度在20～30.℃之間，酶活上升，培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高時，酶活開始下降，說明高溫影響菌體的產(chǎn)酶。根據(jù)酶活大小，選擇最佳培養(yǎng)溫度為30.℃。

經(jīng)過優(yōu)化，最終得到的穗色鏈霉菌產(chǎn)PLD的最適發(fā)酵條件為葡萄糖10 g/L、酵母粉5 g/L，魚粉蛋白胨5 g/L、司班-60 10 g/L、氯化鈣3 g/L，培養(yǎng)基初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度30.℃。在最適發(fā)酵條件下，酶活達到2 967 U/L，是優(yōu)化前的2.12倍。

2.2 PLD催化磷脂酰膽堿合成磷脂酰絲氨酸工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 有機溶劑的選擇

磷脂酰膽堿溶解在有機相中，適宜的有機溶劑可以增大底物的溶解度，提高傳質(zhì)速率，且能夠?qū)γ傅奶烊粯?gòu)象產(chǎn)生正影響[16]。因此，考察了反應(yīng)4 h后幾種常見的有機溶劑對PLD催化生產(chǎn)PS的影響，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，二氯甲烷和醋酸丁酯為有機相時，轉(zhuǎn)化率相對較高，甲苯為有機相時，轉(zhuǎn)化率最小，而在乙酸乙酯中則沒有檢測到產(chǎn)物的生成，可能是溶劑的極性影響介質(zhì)的介電常數(shù)，介電常數(shù)影響酶的催化能力，導(dǎo)致酶活力的差異。綜上，選擇二氯甲烷和醋酸丁酯作為進一步研究對象，考察PLD對這兩種有機溶劑的耐受性。

表2 有機溶劑對PLD催化生產(chǎn)PS的影響

以不經(jīng)過任何處理的酶液作為陽性對照；以在室溫搖床上進行200 r/min振蕩處理4、8、12、24 h的酶液作為陰性對照，目的是排除溫度對酶活的影響；以分別與兩種有機溶劑按體積比1∶1混合，在室溫搖床上200 r/min振蕩處理4、8、12、24 h的酶液作為實驗組。取3組酶液進行催化反應(yīng)，反應(yīng)時間4 h，結(jié)果如圖8、圖9所示。

圖8 PLD對二氯甲烷耐受性

圖9 PLD對醋酸丁酯耐受性

由圖8和圖9可知，室溫情況下，酶的活性基本不受影響，二氯甲烷對酶的活性也基本沒有影響，而經(jīng)過醋酸丁酯處理的酶液用于反應(yīng)則對酶活有明顯的抑制作用，且在醋酸丁酯中處理時間越長，對酶活的抑制作用越明顯，因此推測在含有醋酸丁酯的生物催化體系中，溶劑的性質(zhì)影響了酶的活性，這可能是醋酸丁酯降低了酶分子的柔性，繼而影響了酶的催化活性。綜上，選擇二氯甲烷作為雙向體系的有機溶劑。

2.2.2 酶用量的選擇

采用雙相反應(yīng)體系，有限的界面面積限制了酶的用量，一定范圍內(nèi)增大酶用量會提高產(chǎn)品的產(chǎn)率，但是過量的酶會造成酶量飽和，因此考察體系最大酶用量。反應(yīng)10 h后酶用量對PLD催化生產(chǎn)PS的影響如表3所示。

表3 酶用量對PLD催化生產(chǎn)PS的影響

由表3可知，PS轉(zhuǎn)化率隨酶用量增加而增大，當(dāng)酶用量為1.15 U/mL，幾乎達到飽和，即為最適酶用量。

2.2.3 金屬離子的選擇

在反應(yīng)體系中添加合適的金屬離子，可能會影響酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而對酶活產(chǎn)生積極的影響。有文章報道鈣離子能增大PLD的催化轉(zhuǎn)酯活性，如Simkhada等[17]報道的產(chǎn)自菌株Streptomycesolivochromogenes的PLD528及Mander等[18]報道產(chǎn)自Streptomycestendae的PLDSt都受鈣離子影響。為探討金屬離子對酶活的影響機制，研究了幾種常見的金屬離子對酶活的影響。金屬離子濃度均為10 mmol/L，以不加金屬離子的為對照。反應(yīng)4 h后金屬離子對PLD催化生產(chǎn)PS的影響如圖10所示。

圖10 金屬離子對PLD催化生產(chǎn)PS的影響

由圖10可知，鈣離子對PLD對酶的促進作用最大，加入鈣離子后，PS產(chǎn)量是對照組的1.4倍；錳、鉀、鈷離子對酶的轉(zhuǎn)酯活性有一定積極影響，鎳離子對酶活影響不大，鎂、鋅、銅、鐵離子對轉(zhuǎn)酯活性有抑制作用，但抑制效果均不明顯，可能是金屬離子影響酶的二級結(jié)構(gòu)，影響酶的穩(wěn)定性，不利于酶與底物結(jié)合。

2.2.4 反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度的選擇

每一種酶都有它的最適pH，pH偏低或偏高都會使酶活性部位的基團離子化發(fā)生變化而降低酶的活力，考察反應(yīng)10 h后pH對PLD催化生產(chǎn)PS的影響，結(jié)果如圖11所示。反應(yīng)溫度的變化使底物磷脂在兩相體系中分配系數(shù)產(chǎn)生變化，繼而改變底物在兩相中的分布狀態(tài)，反應(yīng)溫度的變化也會影響酶蛋白的結(jié)構(gòu)，過高的反應(yīng)溫度會改變活性部位的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致催化活性的降低，甚至使酶失活，考察反應(yīng)10 h后反應(yīng)溫度對PLD催化生產(chǎn)PS的影響，結(jié)果如圖12所示。

圖11 pH對PLD催化生產(chǎn)PS的影響

圖12 反應(yīng)溫度對PLD催化生產(chǎn)PS的影響

由圖11可知，PS產(chǎn)量隨pH的增加而先升高后降低，在pH為5.5時達到最大值，因此可以確定PLD催化生產(chǎn)PS的最佳pH為5.5。

由圖12可知，PS產(chǎn)量隨反應(yīng)溫度的升高而先升高后降低，35.℃時酶的催化活性最高，因此選擇35.℃作為最適反應(yīng)溫度。

經(jīng)過對反應(yīng)體系的優(yōu)化，得出的催化最適溫度和pH分別為35.℃和5.5；使用有機相為二氯甲烷；最適酶用量為1.15 U/mL，鈣離子濃度為10 mmol/L。在最適催化工藝條件下，10 h后PS生成率可達到94%。

3 結(jié) 論

通過對產(chǎn)酶條件的優(yōu)化和催化工藝條件的優(yōu)化，得到最適產(chǎn)酶條件為葡萄糖10 g/L、酵母粉5 g/L、魚粉蛋白胨5 g/L、司班-60 10 g/L、氯化鈣3 g/L，接種量1%、培養(yǎng)基初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度30.℃。在最適產(chǎn)酶條件下，酶活達到2 967 U/L，是優(yōu)化前的2.12倍。最適催化工藝條件為使用二氯甲烷作為有機相、酶用量1.15 U/mL、鈣離子濃度10 mmol/L、反應(yīng)溫度35.℃和pH 5.5。在最適催化工藝條件下，反應(yīng)10 h后PS生成率達94%。實驗極大地提高了PS的生成率，為進一步擴大培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能。

[1] KIDD P M.Attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD) in children：rationale for its integrative management[J].Altern Med Rev,2000,5(5):402-428.

[2] SONG J K，HAN J J，RHEE J S.Phospholipases：occurrence and production in microorganisms，assay for high throughput screening，and gene discovery from natural and man-made diversity[J].J Am Oil Chem Soc，2005，82(10):691-705.

[3] JUNEJA L R,KAZUOKA T,GOTO N,et al.Conversion of phosphatidylcholine to phosphatidyserine by various phosphalipases D in the presence ofL- orD-serine[J].Biochim Biophys Acta,1989,1003(3):277-283.

[4] BIRICHEVSKAYA L L,KISEL M A.Use of phosphalipases D fromStreptomycesnetropsisfor the biocatalytic synthesis of phosphatidyserine[J].Vestsi Nats Akad Navuk Belarusi,Ser Navuk,2008(3):86-90.

[5] SAKAI M,EBINA R,YAMATOYA H,et al.Method for producing phosphalipid：US20050170476A1[P].2005-02-24.

[6] 胡飛.磷脂酶 D 制備及其催化合成磷脂酰絲氨酸研究[D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué),2013.

[7] 朱南南.磷脂酶D催化磷脂酰基轉(zhuǎn)移合成磷脂酰絲氨酸反應(yīng)的研究[D].西安：西北工業(yè)大學(xué),2005.

[8] 韓海霞.磷脂酶D的制備及其在磷脂酰絲氨酸合成中的應(yīng)用[D].江蘇 無錫：江南大學(xué)，2014.

[9] HATANAKA T，NEGISHI T，KUBOTA-AKIZAWA M，et al.Study on thermostability of phospholipase D fromStrep-tomycessp.[J].Biochim Biophys Acta，2002，1598(2):156-164.

[10] 許建和.生物催化工程[M].上海：華東理工大學(xué)出版社，2008：69-72.

[11] 曹軍衛(wèi)，馬輝文.微生物工程[M].北京：科學(xué)工業(yè)出版社，2002：80-121.

[12] 肖冬光.微生物工程原理[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2004：37-40,61-71,200-207.

[13] 程殿林.微生物工程技術(shù)原理[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：18-21,58-61,92,114-121.

[14] 郭浩.磷脂酶D高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化 [D].西安：西北大學(xué),2007.

[15] SHINONAGA M A,KAWAMURA Y,SHIMBO K,et al.Continuous production of phospholipase D byStreptomyceslydicusD-121 immobilized with corss-linked chitosan beads[J].J Ferment Bioeng,1996,81(4):310-314.

[16] 王興國，裘愛泳，陶文沂,等.磷脂酶 D 催化反應(yīng)中的有機溶劑效應(yīng)[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,1995,3(4):212-220.

[17] SIMKHADA J R，LEE H J，JANG S Y，et al.A novel alkalo- and thermostable phospholipase D fromStreptomycesolivochromogen[J].Biotechnol Lett，2009，31(3):429-435.

[18] MANDER P，SIMKHADA J R，CHO S S，et al.A novel Ca2+-dependent phospholipase D fromStreptomycestendae，possessing only hydrolytic activity[J].Arch Pharm Res，2009，32：1461-1467.

PreparationofphospholipaseDandcatalyticsynthesisofphosphatidylserinefromphosphatidylcholine

QIAN Juan,PANG Yang,WANG Xin

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211816,China)

TQ033;TS202.3

A

1003-7969(2017)09-0066-06

2016-11-24；

2017-05-05

錢 娟(1991)，女，碩士研究生，研究方向為微生物酶催化(E-mail)18260037163@163.com。

王 昕，講師，博士(E-mail)xinwang1988@njtech.edu。