苦杏仁多酚氧化酶的分離純化及部分特性分析

申 輝，張清安,張馨允，史芳芳,范學(xué)輝

(1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安710119；2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510641)

綜合利用

苦杏仁多酚氧化酶的分離純化及部分特性分析

申 輝1,2，張清安1,張馨允1，史芳芳1,范學(xué)輝1

(1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安710119；2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510641)

以苦杏仁為原料，采用(NH4)2SO4分級(jí)沉淀法對(duì)苦杏仁多酚氧化酶進(jìn)行初步分離后經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析進(jìn)一步純化，冷凍干燥后即得苦杏仁多酚氧化酶純品；通過(guò)凝膠電泳和熱分析試驗(yàn)測(cè)定多酚氧化酶的相對(duì)分子質(zhì)量和變性溫度。結(jié)果表明：經(jīng)分離純化后苦杏仁多酚氧化酶的純化倍數(shù)為49.03倍，該酶可能存在同工酶且相對(duì)分子質(zhì)量分別約為21.9 kD和23.2 kD；苦杏仁多酚氧化酶變性溫度為60.03.℃。為苦杏仁加工過(guò)程中的酶促褐變控制提供部分理論參數(shù)。

苦杏仁；多酚氧化酶；分離；酶活；褐變

Abstract：With apricot kernels as raw material,the (NH4)2SO4fractional precipitation and Sephadex G-75 gel chromatography were employed to precipitate and purify the polyphenol oxidase from apricot kernel respectively,and the pure polyphenol oxidase was obtained after freeze drying.In addition,the relative molecular weight and denatured temperature of the purified polyphenol oxidase were also determined by the electrophoresis experiment and thermal analysis.The results showed that the purification fold of the polyphenol oxidase was 49.03 times after isolation and purification,and the relative molecular weights of its isozyme were about 21.9 kD and 23.2 kD respectively,and its denatured temperature was 60.03.℃.The research results could provide some theoretical parameters for the control of enzymatic browning in the processing of apricot kernel.

Keywords：apricot kernel; polyphenol oxidase; isolation; enzyme activity; browning

杏(ArmeniacavulgarisLam.)，薔薇科杏屬植物，落葉喬木，地生，主要分布于我國(guó)北方地區(qū)。杏仁是杏的種子，含有豐富的蛋白質(zhì)、油脂、糖、苦杏仁苷、維生素和微量元素等多種成分[1]，按照苦杏仁苷含量的不同可分為甜杏仁和苦杏仁。甜杏仁常作為食品加工業(yè)的原輔料或者直接食用?？嘈尤手泻胸S富的不飽和脂肪酸、人體必需氨基酸和苦杏仁苷，可作為良好的營(yíng)養(yǎng)保健食品和藥用植物資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。近幾年，圍繞杏仁蛋白[2]、杏仁油[3]、苦杏仁苷[4]、杏仁皮[5-6]等方面的研究呈上升趨勢(shì)，這對(duì)于提高苦杏仁附加值、促進(jìn)杏仁產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。然而，在苦杏仁的加工過(guò)程中，由于其成分復(fù)雜及加工貯藏工藝的限制，常會(huì)發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)變化導(dǎo)致品質(zhì)下降，從而降低了苦杏仁制品的商業(yè)價(jià)值。這是因?yàn)樵诩庸み^(guò)程中苦杏仁組織結(jié)構(gòu)遭到破壞與氧氣接觸，酚酶催化氧化酚類物質(zhì)生成醌，而后醌類物質(zhì)通過(guò)聚合作用生成有色物質(zhì)，從而導(dǎo)致苦杏仁品質(zhì)下降，即酶促褐變反應(yīng)是引起苦杏仁加工品質(zhì)降低的重要原因，其主要酶則是多酚氧化酶(PPO)。因此，了解苦杏仁PPO的相關(guān)理化性質(zhì)對(duì)于有效控制苦杏仁酶促褐變具有重要意義，但目前有關(guān)這方面的研究較少。

本文結(jié)合酶分離純化常用的(NH4)2SO4分級(jí)沉淀法和凝膠柱層析法[7-9]對(duì)苦杏仁PPO進(jìn)行分離和純化，并測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量和變性溫度，以期為基于酶活性進(jìn)行苦杏仁酶促褐變控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

苦杏仁，購(gòu)于西北藥材市場(chǎng)，挑選形態(tài)飽滿、無(wú)破損、無(wú)病蟲(chóng)害的苦杏仁備用；無(wú)水乙醇、丙酮、(NH4)2SO4、KH2PO4、NaOH、聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)等試劑或藥品均為分析純；牛血清蛋白，上海伯奧生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Sephadex G-75，Pharmacia公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì)；JA2003N型電子天平；2-16PK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Alphal-4型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Marin Christ公司；KQ3200B超聲波清洗器；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵；MDF-U5410超低溫冰箱，日本Sanyo公司；Q1000DSC+LNCS+FACS Q600SDT熱分析系統(tǒng)，美國(guó)TA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

稱取適量苦杏仁，按質(zhì)量比100∶1加入聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)作為酚類物質(zhì)的去除劑，充分粉碎后快速取出，加入經(jīng)-28.℃預(yù)冷的丙酮至完全浸沒(méi)，在4.℃條件下靜置2 h，然后用預(yù)冷過(guò)的丙酮反復(fù)抽濾除油，直至成為白色粉末，即得經(jīng)丙酮去油后的苦杏仁粉樣品(丙酮粉)，置于低溫下保存[10-12]。

1.2.2 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀

磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L pH 6.50)的制備：稱取KH2PO46.80 g，加入0.10 mol/L的NaOH溶液152 mL，然后用蒸餾水定容至1 000 mL，經(jīng)pH計(jì)校準(zhǔn)后即得磷酸鹽緩沖液。

稱取一定量丙酮粉，與磷酸鹽緩沖液按料液比1∶5混勻，5 000 r/min離心10 min。取上清液并加入(NH4)2SO4鹽析，按質(zhì)量體積比區(qū)間0～1∶15、1∶15～2∶15、2∶15～3∶15、3∶15～4∶15、4∶15～5∶15、5∶15～6∶15進(jìn)行分級(jí)沉淀，每個(gè)樣品均置于4.℃下鹽析2 h。經(jīng)9 000 r/min離心10 min后收集沉淀，在-28.℃下冷凍后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，收集凍干品即得苦杏仁PPO粗提物。通過(guò)測(cè)定酶活性，找出苦杏仁PPO沉淀最集中的區(qū)間，以提高(NH4)2SO4鹽析的效果。由于不同飽和度下的(NH4)2SO4分級(jí)沉淀法操作相對(duì)煩瑣，故在此轉(zhuǎn)化為質(zhì)量體積比區(qū)間進(jìn)行鹽析沉淀。

1.2.3 酶活性和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定

將上述凍干的苦杏仁PPO粉末用磷酸鹽緩沖液制備成溶液，在25.℃條件下向比色皿中加入濃度為0.2 mol/L的鄰苯二酚溶液2 mL，然后加適當(dāng)濃度的苦杏仁PPO溶液1 mL，立即搖勻后于410 nm波長(zhǎng)下開(kāi)始測(cè)量[10]，每隔6 s記錄一次吸光度，連續(xù)測(cè)定3 min，以最初近似直線的部分計(jì)算酶活性。由于沉淀中不僅存在雜蛋白，也可能存在非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)，均影響著酶的純度。在此，引入比活力和酶活力的定義[13]，通過(guò)計(jì)算后比較各個(gè)區(qū)間內(nèi)沉淀的比活力和酶活力，以選擇PPO純度最高的比例區(qū)間。

比活力定義為：在試驗(yàn)條件下，每毫克蛋白質(zhì)1 min 內(nèi)引起吸光度隨時(shí)間增加0.01為一個(gè)比活力單位。

酶活力定義為：在試驗(yàn)條件下，每毫克沉淀1 min 內(nèi)引起吸光度隨時(shí)間增加0.01為一個(gè)酶活力單位。

比活力可以反應(yīng)單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中PPO的占比，比活力越大說(shuō)明雜蛋白越少，PPO純度越高；酶活力反應(yīng)單位沉淀內(nèi)的PPO含量，酶活力越大說(shuō)明沉淀中雜蛋白和非蛋白類雜質(zhì)越少，PPO純度越高。通過(guò)計(jì)算，找出比活力和酶活力均較高的區(qū)間，以此作為(NH4)2SO4分離純化苦杏仁PPO的依據(jù)。

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)G-250 比色法測(cè)定可溶性蛋白含量。以0、200、400、600、800、1 000 μg/mL牛血清蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，410 nm波長(zhǎng)下的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程：y=0.000 4x-0.001 1(R2=0.999 2)，通過(guò)此方程計(jì)算樣品溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.2.4 Sephadex G-75凝膠柱層析

經(jīng)(NH4)2SO4分級(jí)沉淀后，找出最佳的質(zhì)量體積比區(qū)間，收集該區(qū)間內(nèi)的沉淀，經(jīng)冷凍干燥后配制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的苦杏仁PPO溶液，取2 mL 上樣于經(jīng)磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L pH 6.50)平衡的Sephadex G-75凝膠柱(1.5 cm×75 cm)進(jìn)行柱層析分離純化，用0.4 mL/min的磷酸鹽緩沖液洗脫，每管收集3 mL。柱層析結(jié)束后測(cè)定每管洗脫液酶活性及280 nm下的吸光度(A280)，收集蛋白質(zhì)吸收峰與酶活性峰重疊的洗脫液。

1.2.5 電泳法測(cè)定苦杏仁PPO的相對(duì)分子質(zhì)量

經(jīng)1.2.4收集蛋白質(zhì)吸收峰與PPO活性峰重疊的洗脫液后，向洗脫液中加入適量的(NH4)2SO4沉淀PPO，收集沉淀經(jīng)冷凍干燥后即得PPO粉末，然后進(jìn)行SDS-PAGE垂直板電泳試驗(yàn)。采用5%的濃縮膠和12%的分離膠，上樣質(zhì)量濃度為2 mg/mL，每孔上樣量15 μL，樣品在濃縮膠和分離膠中遷移時(shí)的電壓分別為100 V和120 V，以檢測(cè)苦杏仁PPO的分離純化效果并測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.6 熱分析法測(cè)定苦杏仁PPO的有關(guān)特性

取適量1.2.5中制得的PPO粉末進(jìn)行差示掃描量熱(DSC)試驗(yàn)和熱重分析(TGA)試驗(yàn)，以測(cè)定苦杏仁PPO的有關(guān)熱力學(xué)特性。

2 結(jié)果與討論

2.1 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀結(jié)果

(NH4)2SO4分級(jí)沉淀結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀結(jié)果

由表1可知，蛋白質(zhì)的析出主要集中于1∶15～4∶15區(qū)間內(nèi)；比活力較高的沉淀主要集中于0～3∶15 區(qū)間內(nèi)；而在0～1∶15 區(qū)間內(nèi)，雖然比活力較高，但酶活力較低，說(shuō)明沉淀中非蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量較高，蛋白質(zhì)純度低；在3∶15～4∶15區(qū)間內(nèi)，沉淀最多，沉淀中蛋白質(zhì)含量也最高，但比活力和酶活力均較低。綜合考慮上述結(jié)果，收集1∶15～3∶15區(qū)間內(nèi)的沉淀進(jìn)行柱層析試驗(yàn)，對(duì)苦杏仁PPO進(jìn)一步分離純化。

基于上述結(jié)論，稱取30 g丙酮粉，加入150 mL磷酸鹽緩沖液浸泡，置于4.℃下靜置2 h后，5 000 r/min 離心10 min，收集上清液。把上清液分為第一、二組，分別按質(zhì)量體積比1∶15、6∶15加入(NH4)2SO4，攪勻后置于4.℃下鹽析2 h，9 000 r/min 離心10 min，收集沉淀。取第一組上清液15 mL，加2 g(NH4)2SO4進(jìn)一步鹽析，4.℃下靜置2 h后9 000 r/min離心即得所需沉淀。沉淀于-28.℃下冷凍后置于冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，得凍干品即粗酶粉。通過(guò)測(cè)定每組樣品的蛋白質(zhì)含量和酶活性，可計(jì)算得(NH4)2SO4分級(jí)沉淀法對(duì)苦杏仁PPO的初步分離純化效果，結(jié)果如表2所示。

表2 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀法對(duì)苦杏仁PPO的初步分離純化結(jié)果

由表2可知，1∶15～3∶15區(qū)間內(nèi)集中了91.14%的PPO，因此收集該區(qū)間內(nèi)的沉淀進(jìn)行Sephadex G-75 凝膠柱層析分離試驗(yàn)；通過(guò)(NH4)2SO4分級(jí)沉淀，可對(duì)雜蛋白進(jìn)行初步分離，使苦杏仁PPO的純化倍數(shù)達(dá)到10.30倍。

2.2 凝膠柱層析試驗(yàn)結(jié)果

以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，以280 nm(蛋白質(zhì)吸收峰)下的吸光度A280及酶活力為縱坐標(biāo)，繪制洗脫圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 苦杏仁PPO的Sephadex G-75洗脫曲線

由圖1可以看出，第一個(gè)蛋白質(zhì)吸收峰對(duì)應(yīng)有較高的酶活，第二個(gè)蛋白質(zhì)吸收峰無(wú)酶活，說(shuō)明第一個(gè)吸收峰(蛋白質(zhì)峰與酶活性峰重疊部分)為苦杏仁PPO的洗脫峰。收集第4～10號(hào)管內(nèi)洗脫液，經(jīng)(NH4)2SO4鹽析，冷凍干燥后即得苦杏仁PPO純品，測(cè)定其比活力為288.27，計(jì)算得純化倍數(shù)高達(dá)49.03倍，說(shuō)明用此方法分離純化苦杏仁PPO是可行的。

2.3 苦杏仁PPO相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

采用SDS-PAGE凝膠電泳試驗(yàn)測(cè)定苦杏仁PPO的相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析后一部分雜蛋白被分離，且試驗(yàn)結(jié)果顯示存在2條明顯的酶帶，推測(cè)可能存在苦杏仁PPO同工酶，計(jì)算得其相對(duì)分子質(zhì)量約為21.9 kD和23.2 kD。這與朱繼英等[9]報(bào)道的雙孢蘑菇PPO相對(duì)分子質(zhì)量約為25.5 kD和胡婉峰等[14]報(bào)道的蓮藕PPO相對(duì)分子質(zhì)量約為21.0 kD接近。

注：編號(hào)1、2、3、4、5分別表示0～6∶15區(qū)間內(nèi)的沉淀、1∶15～3∶15區(qū)間內(nèi)的沉淀、1∶15～3∶15區(qū)間內(nèi)的沉淀(重復(fù)試驗(yàn))、柱層析后的PPO、柱層析后的PPO(重復(fù)試驗(yàn))。標(biāo)準(zhǔn)蛋白及相對(duì)分子質(zhì)量分別為：a為兔磷酸化酶B，97.4 kD；b為牛血清白蛋白，66.2 kD；c為兔肌動(dòng)蛋白，43.0 kD；d為牛碳酸酐酶，31.0 kD；e為胰蛋白酶抑制劑，20.1 kD。

圖2苦杏仁PPO電泳圖

2.4 熱性質(zhì)分析

2.4.1 DSC試驗(yàn)

DSC主要用來(lái)研究蛋白質(zhì)的熱變性，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)在升溫過(guò)程中的能量變化，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)的相關(guān)特性進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 苦杏仁PPO的DSC圖

由圖3可以看出，苦杏仁PPO的熱變性溫度(Td)為60.03.℃，焓變(ΔH)為50.50 J/g。Td值反映PPO的熱穩(wěn)定性，ΔH是指引起PPO變性所需要的熱量。因此，理論上當(dāng)把溫度升高到60.03.℃以上，同時(shí)給予充分的加熱時(shí)間，便可使苦杏仁PPO失活，從而抑制苦杏仁酶促褐變的發(fā)生。在實(shí)際加工生產(chǎn)中，對(duì)苦杏仁原料的烘干溫度是高于60.03.℃的，而在后續(xù)加工過(guò)程中仍會(huì)發(fā)生酶促褐變，這可能是由于PPO處于苦杏仁未遭到破壞時(shí)的復(fù)雜體系中，與苦杏仁內(nèi)的其他成分在結(jié)構(gòu)上發(fā)生交聯(lián)，從而導(dǎo)致酶活難以失去。因此，如何優(yōu)化加工條件，最大限度抑制苦杏仁酶促褐變，還需進(jìn)一步研究。

2.4.2 TGA試驗(yàn)

TGA是測(cè)量樣品質(zhì)量隨溫度變化的一種常用的熱分析方法，可以反應(yīng)樣品的水分含量、水化程度、物質(zhì)組成、分解溫度等信息[15]。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 苦杏仁PPO的TGA圖

由圖4可以看出，隨著溫度的升高，苦杏仁PPO的質(zhì)量損失過(guò)程可分為3個(gè)階段：第一個(gè)階段是當(dāng)溫度升高至200.℃時(shí)，自由水分的蒸發(fā)和PPO高級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞的過(guò)程；第二個(gè)是熱分解階段，在此過(guò)程中，苦杏仁PPO中的結(jié)合水開(kāi)始失去，羥基基團(tuán)遭到破壞；第三個(gè)是其他雜質(zhì)發(fā)生分解的過(guò)程。蛋白質(zhì)的TGA曲線與蛋白質(zhì)水分含量、分子間作用力及聚集態(tài)有關(guān)?？嘈尤蔖PO質(zhì)量損失的前兩個(gè)階段可能與其自身結(jié)構(gòu)的破壞過(guò)程有關(guān)，首先是第一階段中高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，這個(gè)過(guò)程伴隨著酶的變性失活與自由水的散失；當(dāng)溫度升高到400.℃左右時(shí)，結(jié)合水開(kāi)始失去，高級(jí)結(jié)構(gòu)及化學(xué)基團(tuán)遭到更加嚴(yán)重的破壞，同時(shí)肽鍵可能發(fā)生斷裂，進(jìn)而影響酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)。酶活性究竟與哪些化學(xué)基團(tuán)有關(guān)以及存在于酶結(jié)構(gòu)中的哪個(gè)部位還需要深入研究探討。

3 結(jié) 論

采用(NH4)2SO4分級(jí)沉淀法對(duì)苦杏仁PPO進(jìn)行初步分離純化，收集質(zhì)量體積比1∶15～3∶15區(qū)間內(nèi)的沉淀凍干，通過(guò)測(cè)定酶活性可知此步的純化倍數(shù)為10.30倍；然后經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析試驗(yàn)，對(duì)PPO進(jìn)一步分離純化，去除雜蛋白，計(jì)算得純化倍數(shù)為49.03倍，說(shuō)明此方法分離純化苦杏仁PPO的效果較好。通過(guò)凝膠電泳試驗(yàn)可知苦杏仁PPO可能存在同工酶，相對(duì)分子質(zhì)量約為21.9 kD和23.2 kD；通過(guò)熱分析試驗(yàn)得苦杏仁PPO的熱變性溫度為60.03.℃，加熱過(guò)程中PPO質(zhì)量的損失可能與其結(jié)構(gòu)破壞的順序有關(guān)。

通過(guò)對(duì)苦杏仁PPO的相關(guān)特性進(jìn)行分析，尋求最佳的褐變控制方法，并對(duì)去皮工藝進(jìn)行改進(jìn)。因苦杏仁PPO純品的熱變性溫度為60.03.℃，因此可以把去皮、烘干等工序的溫度控制在熱變性溫度以上，以降低酶活；但溫度不宜過(guò)高，以避免非酶褐變的發(fā)生。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)合理控制加工條件，盡可能在抑制酶促褐變的同時(shí)，降低高溫對(duì)苦杏仁其他成分的影響，最大限度地保護(hù)其原有品質(zhì)。

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Isolation,purificationandpropertiesofpolyphenoloxidasefromapricotkernel

SHEN Hui1,2,ZHANG Qing’an1,ZHANG Xinyun1,SHI Fangfang1,FAN Xuehui1

(1.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China; 2.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510641,China)

TS201.1;TQ646

A

1003-7969(2017)09-0136-05

2016-12-24；

2017-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31101324)；陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JM3097)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(GK201602005)

申 輝 (1989)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸み^(guò)程控制(E-mail)shsnnu@163.com。

張清安，副教授(E-mail)qinganzhang@snnu.edu.cn。