反相高效液相色譜法測定Rancimat測量池水中的短鏈脂肪酸

李詠如，李 徐，陶勝男，章云霄，劉睿杰，金青哲，王興國

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫214122)

檢測分析

反相高效液相色譜法測定Rancimat測量池水中的短鏈脂肪酸

李詠如，李 徐，陶勝男，章云霄，劉睿杰，金青哲，王興國

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫214122)

采用反相高效液相色譜法測定Rancimat測量池水中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等短鏈脂肪酸含量，為探明Rancimat測量池水電導(dǎo)率的內(nèi)在組成變化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：高效液相色譜在流速1.0 mL/min、柱溫40.℃、紫外檢測波長210 nm、進(jìn)樣量10 μL、流動(dòng)相為磷酸鹽溶液(pH 2.8，0.05 mol/L)和甲醇組成的線性梯度洗脫條件下，能同時(shí)分離甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸，其保留時(shí)間分別為1.96、2.71、5.81、13.47、19.33、27.72 min。此方法的平均峰面積精密度為2.31%，平均回收率為96.88%；棕櫚油、大豆油和亞麻籽油氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所得水溶液中的短鏈脂肪酸主要為甲酸和乙酸。此法對(duì)深入分析優(yōu)化油脂氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)具有重要意義。

反相高效液相色譜法；短鏈脂肪酸；Rancimat測量池；水

Abstract：The contents of short-chain fatty acids including formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid,valeric acid and caproic acid were determined by reversed-phase high-performance liquid chromatography,and it could lay the foundation for the exploration of the internal composition changes mechanism of conductivity in Rancimat measuring cell water.The results showed that the optimal detection conditions were obtained as follows: flow rate 1.0 mL/min,column temperature 40.℃,UV detection wavelength 210 nm,injection volume 10 μL and linear gradient elution of mobile phase consisted of methanol and phosphate solution(pH 2.8,0.05 mol/L).Under these conditions,formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid,valeric acid and caproic acid could be separated simultaneously and the retention time was 1.96,2.71,5.81,13.47,19.33 min and 27.72 min,respectively.The average precision of peak area and average recovery rate of the method were 2.31% and 96.88% respectively.The short-chain fatty acids in palm oil,soybean oil and linseed oil in oxidation stability experiments were mainly formic acid and acetic acid.The method was of great significance for in-depth analysis and optimization of Rancimat evaluation experiment.

Keywords：reversed-phase high-performance liquid chromatography；short-chain fatty acid；Rancimat measuring cell; water

Rancimat氧化穩(wěn)定測試儀是在特定溫度下向定量油脂中通入空氣，油脂在熱、氧環(huán)境下加速氧化產(chǎn)生揮發(fā)性小分子如醛、酮、酸等，小分子物質(zhì)隨氣流進(jìn)入測量池，多數(shù)酸溶解在測量池水中，儀器依據(jù)水電導(dǎo)率變化判定油脂氧化程度。Rancimat氧化穩(wěn)定評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)因其操作簡便、測量快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[1]。然而近年來，市場上不斷出現(xiàn)富含不飽和脂肪酸、特殊營養(yǎng)成分的新型特種油品，氧化穩(wěn)定性能評(píng)價(jià)過程中常常出現(xiàn)電導(dǎo)曲線異常、測量結(jié)果重復(fù)性差等問題，而測量池中水的電導(dǎo)率是由溶解其中的短鏈脂肪酸決定的。

根據(jù)油脂自動(dòng)氧化理論，從脂肪酸自由基反應(yīng)開始，生成一級(jí)氧化產(chǎn)物氫過氧化物，后期氫過氧化物降解成醛，由醛和氧氣循環(huán)反應(yīng)不斷生成短鏈脂肪酸[2]。短鏈脂肪酸為油脂自動(dòng)氧化的二級(jí)產(chǎn)物，在儀器測量池中被蒸餾水吸收，導(dǎo)致蒸餾水電導(dǎo)率改變[3-4]。測定水中的短鏈脂肪酸常用高效液相色譜法[5-7]、離子色譜法[8-9]、氣相色譜法[4]、氣質(zhì)聯(lián)用[10]等方法，其中高效液相色譜法操作簡單、準(zhǔn)確率高、成本低，研究其在測定Rancimat測量池水中的短鏈脂肪酸應(yīng)用卻鮮有報(bào)道。

本文采用反相高效液相色譜法，分離測定了甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸6種短鏈脂肪酸在Rancimat測量池水中的含量，對(duì)深入分析優(yōu)化油脂氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸，分析純；甲醇，色譜純。

1525型高效液相色譜儀(配置紫外可見檢測器)、SunFireTMC18色譜柱(Φ4.6 mm×150 mm，5 μm)，美國Waters公司；實(shí)驗(yàn)用臺(tái)式pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；微量注射器(25 μL)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件的確定

分別稱取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸制成混合溶液。用0.05 mol/L的磷酸鹽溶液(pH 2.8)和甲醇為流動(dòng)相，考察不同甲醇含量對(duì)分離的影響，同時(shí)調(diào)節(jié)流動(dòng)相梯度變化程序，對(duì)混合短鏈脂肪酸進(jìn)行分離，分析得出最佳的分離方法。鑒于Rancimat測量池水中的短鏈脂肪酸濃度由低至高逐漸增加，為保證進(jìn)樣量和濃度配合，選取10 μL作為進(jìn)樣量。短鏈脂肪酸在190～220 nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)吸收，鑒于流動(dòng)相甲醇的紫外截止波長205 nm，選取210 nm作為檢測波長?；贑18色譜柱的允許溫度范圍以及磷酸鹽在流動(dòng)相中的溶解度，選取40.℃作為柱溫。

1.2.2 線性范圍和檢測限確定

分別稱取甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸0.2 g 用蒸餾水定容至50 mL，分別量取0.5、1、2、4、8、16 mL定容至50 mL，制得短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用所確定的色譜分析方法依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以液相色譜出峰的絕對(duì)面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到各種短鏈脂肪酸的線性范圍和檢測限。

1.2.3 方法精密度與準(zhǔn)確度

取水池吸收液樣品經(jīng)4.5 μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析，在相同操作條件下重復(fù)6次，計(jì)算檢測各短鏈脂肪酸的保留時(shí)間精密度和峰面積精密度。

對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，樣品中加入對(duì)應(yīng)量標(biāo)準(zhǔn)品，混勻后膜過濾進(jìn)樣，計(jì)算回收率，確定方法準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定，在流速1.0 mL/min條件下，按表1線性梯度洗脫分離效果最佳。測得短鏈脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

表1 最佳梯度洗脫程序

圖1短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

有機(jī)改性劑甲醇比例的升高，能加快短鏈脂肪酸尤其是碳鏈較長有機(jī)酸的洗脫并改善峰形。甲醇的加入減弱了有機(jī)酸的疏水端與固定相的作用，從而縮短保留時(shí)間。然而，流動(dòng)相中甲醇比例過高，會(huì)導(dǎo)致磷酸鹽的析出而堵塞儀器，因此選擇梯度洗脫終點(diǎn)為40%甲醇效果最佳。本實(shí)驗(yàn)由于儀器限制保持流速恒定在1.0 mL/min，在儀器條件允許的情況下，可適當(dāng)增加流速，進(jìn)一步縮短丁酸、戊酸、己酸的保留時(shí)間。由圖1可知，甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸的保留時(shí)間分別為1.96、2.71、5.81、13.47、19.33、27.72 min。

2.2 線性范圍和檢測限

配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照液相色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，6種短鏈脂肪酸在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好。檢測限為15.57～23.52 μg/mL。

表2 工作曲線、線性范圍和檢測限

注：表中y為絕對(duì)峰面積；x為質(zhì)量濃度，mg/L。

2.3 方法精密度與準(zhǔn)確度

采集樣品經(jīng)濾膜過濾后進(jìn)樣分析，在穩(wěn)定操作條件下重復(fù)6次，方法的保留時(shí)間精密度和峰面積精密度結(jié)果見表3?？刂萍訕?biāo)物體積不超過試樣溶液體積的1%，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。由表3、表4可知，方法的平均峰面積精密度為2.31%，平均回收率為96.88%，該方法有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

表3 方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 Rancimat測量池水試樣測定

采集3種油脂氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所得水溶液，在確定的最佳液相色譜條件下測定其短鏈脂肪酸組成及含量，結(jié)果如表5所示。由表5可知，溶解在水中的短鏈脂肪酸主要為甲酸和乙酸。

表5 Rancimat測量池水中短鏈脂肪酸組成及含量 mg/L

注：ND表示未檢出。

3 結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)確定了檢測Rancimat測量池水中短鏈脂肪酸組成的最佳色譜條件：流動(dòng)相為磷酸鹽溶液(pH 2.8，0.05 mol/L)和甲醇組成的梯度洗脫系統(tǒng)、流速1.0 mL/min、柱溫40.℃、紫外檢測波長210 nm、進(jìn)樣量10 μL。在最佳色譜條件下，可對(duì)測量池水中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸進(jìn)行測定，并且有較好的精密度和準(zhǔn)確度。分析了棕櫚油、大豆油和亞麻籽油氧化穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)所得水溶液，溶解在水中的短鏈脂肪酸主要為甲酸和乙酸。此法為深入理解、分析、優(yōu)化油脂氧化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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Determinationofshort-chainfattyacidsinRancimatmeasuringcellwaterbyreversed-phasehigh-performanceliquidchromatography

LI Yongru,LI Xu,TAO Shengnan,ZHANG Yunxiao,LIU Ruijie,JIN Qingzhe,WANG Xingguo

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China)

Q547;O657.7

A

1003-7969(2017)09-0126-03

2016-12-19；

2017-03-16

江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PPZY2015A052)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140156)

李詠如(1994)，女，在讀本科，研究方向?yàn)橹|(zhì)營養(yǎng)與安全(E-mail)liyongru1994@outlook.com。

劉睿杰，副教授(E-mail)liuruijie163@163.com。