西維因人工抗原的合成與鑒定

帥麗芳，趙勇，銀濤，黃桂通，蔣昀，李代波

(1.廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心， 廣東 廣州 510507；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

西維因人工抗原的合成與鑒定

帥麗芳1，趙勇2，銀濤1，黃桂通1，蔣昀1，李代波1

(1.廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心， 廣東 廣州 510507；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

[目的]制備西維因農(nóng)藥小分子的抗體，為建立免疫分析方法提供保障。[方法]制備6-(1-萘氧基甲酰胺基)己酸及其活化酯,將其與生物大分子偶聯(lián)得到人工免疫抗原和包被抗原。[結(jié)果]通過對(duì)CNH及其活化酯的偶聯(lián)物進(jìn)行質(zhì)譜、核磁共振、紅外線鑒定，證實(shí)合成的產(chǎn)物為目標(biāo)人工標(biāo)原。[結(jié)論]成功制備了西維因人工抗原，為西維因農(nóng)藥殘留免疫分析的方法研究奠定了基礎(chǔ)。

西維因；人工抗原；合成

Abstract:[Objective]To establish immunoassaymethod, the antibody of carbary pesticide was prepared.[Methods]6-(1-naphthyloxy methanamide)hexanoic acid was synthesized and activated,and then coupled with the biological macromolecules to obtain the artificial antigen.[Results]The synthesized product was confirmed as the target artificial antigen by mass spectrometry, nuclear magnetic resonance and infrared spectroscopy detection.[Conclusion]The artificial antigen was synthesized successfully, and it laid the foundation for the preparation of carbaryl antibody and establishing immunemethod .

Keywords:Carbary, Artificial antigen, Synthesis

農(nóng)藥是用來(lái)防治農(nóng)作物蟲害、病害及草害的化學(xué)物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用，按化學(xué)組成可分為有機(jī)磷、氨基甲酸酯類等[1]。西維因(1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯)是一種廣泛使用的高效低毒氨基甲酸酯類殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于糧食、蔬菜、水果及經(jīng)濟(jì)作物等的害蟲防治[2]。雖然西維因?qū)Τ鄯渫獾姆欠乐螌?duì)象的動(dòng)物(如家禽、鳥類、魚及其他野生動(dòng)物)危害很小，但殘留農(nóng)藥進(jìn)入人體內(nèi)，會(huì)造成致畸、慢性神經(jīng)中毒等嚴(yán)重危害[3]，因此開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速，適用農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)的痕量分析方法對(duì)保障食品安全和保護(hù)人體健康具有重要意義。

西維因的常規(guī)檢測(cè)方法包括氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC), 但這些檢測(cè)方法的樣品前處理過程非常復(fù)雜，并且西維因在處理過程中易轉(zhuǎn)變成α-萘酚[4,5]，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，其應(yīng)用受到限制。酶聯(lián)免疫吸附分析方法由于它具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[6]，已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。在免疫分析中，要獲得對(duì)農(nóng)藥分子具高特異性和親和性的抗體，需要制備人工抗原，人工抗原的免疫原性與偶聯(lián)方法、偶聯(lián)臂位置及長(zhǎng)度、偶聯(lián)比等有關(guān)，因此其合成方法至關(guān)重要。本試驗(yàn)分兩步：(1)合成保留農(nóng)藥分子結(jié)構(gòu)且?guī)Щ钚曰鶊F(tuán)的半抗原；(2)使半抗原的活性基團(tuán)與小牛血清及卵清蛋白等載體蛋白偶聯(lián)制備具有免疫原性和特異性的人工抗原。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)試劑

吡啶、α-萘酚、N-羥基琥珀酰亞胺、卵清蛋白(OVA)、對(duì)硝基苯氯甲酸酯、6-氨基己酸、牛血清蛋白、乙酸乙酯、石油醚、N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(縮寫作DCC)、丙酮、硼酸鹽緩沖液、乙醚、磷酸鹽緩沖液、H硅膠、鹽酸。

1.2 試驗(yàn)儀器

ZF-1型紫外分析燈，UV-7504型紫外可見分光光度計(jì)，F(xiàn)rontier FT-IR/NIR/FIR紅外光譜儀，GCC-Glass Clip Column層析柱，Thermo Scientific核磁共振儀， RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，MYP11-2型磁力攪拌器，聯(lián)合碳化透析袋。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 6-(1-萘氧基甲酰胺基)己酸(CNH)的制備

制備萘氧基-4-硝基苯碳酸酯的方法參照文獻(xiàn)[2]，然后量取12 mL溶有4 g制備的1-萘氧基-4-硝基苯碳酸酯的四氫呋喃溶液，滴加到120 mL溶有1.6 g 6-氨基己酸的四氫呋喃溶液中，此步操作過程中要始終保持冰浴，TLC跟蹤反應(yīng)(展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=2∶3)，反應(yīng)結(jié)束后，提取并濃縮反應(yīng)液，層析并減壓蒸餾后得到白色晶體。用質(zhì)譜、核磁共振氫譜碳譜[3]鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3.2 6-(1-萘氧基甲酰胺基)己酸(CNH)的活化

將4.3 g CNH和2.5 gNHS溶解于裝有100 mL的無(wú)水四氫呋喃的反應(yīng)瓶中，加入100 mL溶有5.9 g(28 mmol)DCC的無(wú)水四氫呋喃，在室溫下進(jìn)行攪拌反應(yīng)，以丙酮∶石油醚=1∶1為展開劑TLC跟蹤反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，過濾，得目標(biāo)溶液，進(jìn)一步經(jīng)過減壓蒸餾得到白色晶體。質(zhì)譜、核磁共振氫譜碳譜鑒定活化物。

1.3.3 CNH偶聯(lián)[7，8]

稱取15 mg的1.3.2制備的活化的CNH溶于1.25 mL二甲基亞砜中，磁力攪拌下加入到溶有50 mgBSA的5 mL pH9.0硼酸鹽緩沖液中，室溫反應(yīng)3 h；稱取22 mg活化酯溶于1.84 mL DMSO，磁力攪拌下加入到溶有50 mgOVA的5 mL pH9.0硼酸鹽緩沖液中，室溫反應(yīng)3 h。將反應(yīng)產(chǎn)物透析3 d。對(duì)透析結(jié)束后的試樣進(jìn)行冷凍干燥，用紅外光譜儀鑒定偶聯(lián)產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1半抗原CNH及其活化酯質(zhì)譜及核磁共振的鑒定

半抗原CNH及其活化酯CNH-NHS的結(jié)構(gòu)式如圖1半抗原CNH及其活化酯CNH-NHS結(jié)構(gòu)示意圖所示，其分子量分別為301.34和398.41。

圖1 半抗原CNH及其活化酯CNH-NHS結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Half antigen CNH and activated ester CNH

半抗原CNH及其活化酯質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果分別見圖2 質(zhì)譜CHN(CHN)和圖3 質(zhì)譜CHN-NHS(CHN-NHS Pos)。從圖2可以看出半抗原CNH質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果中，ACPI準(zhǔn)分子離子峰：302.1:

[M+H]+，319.0: [M+NH4]+，324.2: [M+Na]+，340.1: [M+K]+，可以得知合成半抗原CNH的分子量相符。

如圖3所示，半抗原CNH的活化酯CNH-NHS質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果中，ACPI準(zhǔn)分子離子峰：324.1: [CNH+Na]+，421.2:[CNH-NHS+Na]+，437.2: [CNH-NHS+K]+，可以得出與該產(chǎn)物活化酯CNH-NHS的分子量相符。

圖2 質(zhì)譜CNH(CNH)Pos)Fig.2 MS spectrum of CNH

圖3 質(zhì)譜CNH-NHS(CNH-NHS Pos)Fig.3 MS spectrum of CNH half antigen

試驗(yàn)中采用了1H-NMR分析方法對(duì)目標(biāo)物質(zhì)經(jīng)行分析和確證。如圖4所示為半抗原核磁共振氫譜，可見δH7.30～7.99 (7H)：萘環(huán)上7個(gè)氫；δH7.08 (t,1H)：N原子直接相連的氫；δH3.29 (m,2H)：N原子鄰位C原子上的氫；δH2.33 (dd,6.5,6.5)：羧基鄰位C原子上的氫；δH1.67 (m,4H)，1.48 (m,2H)：氨基己酸脂肪鏈上3個(gè)C原子上的氫。證實(shí)所合成半抗原為CNH。圖5所示為活化酯核磁共振氫譜，可見δH7.31～8.01 (7H)：萘環(huán)上7個(gè)氫；δH7.07 (t,1H)：N原子直接相連的氫；δH3.31 (m,2H)：N原子鄰位C原子上的氫；δH2.87(s,4H)：NHS五元環(huán)C原子上的氫；δH2.68 (dd,8.0,6.5)：羧基鄰位C原子上的氫；δH1.79 (m,2H)，1.69 (m,2H)，1.57 (m,2H)：氨基己酸脂肪鏈上3個(gè)C原子上的氫。證實(shí)半抗原活化后產(chǎn)物為CNH-NHS。

圖4 半抗原核磁共振氫譜(1H NMR)Fig.4 1H NMR spectrum of CNH

2.2 人工抗原的鑒定

本試驗(yàn)中采用紅外光譜法鑒定所合成的人工抗原，結(jié)果如圖6所示。從圖中可見BSA的紅外光譜呈現(xiàn)了如3 399 cm-1的胺基N-H伸縮振動(dòng)吸收峰、1 654 cm-1和1 540 cm-1的酰胺譜帶等蛋白質(zhì)類共有的吸收。將偶聯(lián)產(chǎn)物CNH-BSA和BSA的紅外光譜對(duì)比可知，CNH-BSA既顯示了蛋白的伸縮振動(dòng)吸收峰，同時(shí)在1 713 cm-1處出現(xiàn)半抗原CNH中氨基甲酸酯的羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 089 cm-1處的吸收峰是半抗原中的酯鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰。從圖7可見OVA的紅外光譜呈現(xiàn)了如3 294 cm-1的胺基伸縮振動(dòng)吸收峰、1 649 cm-1和1 537 cm-1的酰胺譜帶等蛋白質(zhì)類共有的吸收。將偶聯(lián)產(chǎn)物CNH-OVA和OVA的紅外光譜對(duì)比可知，CNH-OVA既顯示了蛋白的特征吸收峰，同時(shí)在1 716 cm-1處出現(xiàn)半抗原CNH中氨基甲酸酯的羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 078 cm-1處的吸收峰是半抗原中的酯鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰。紅外光譜結(jié)果證實(shí)了半抗原與兩種蛋白成功發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。

3 討論

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是小分子物質(zhì)，只有反應(yīng)原性沒有免疫原性，不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力，因此需要偶聯(lián)大分子蛋白制備出完全抗原[9～11]，才能引起機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。而在農(nóng)藥殘留的免疫分析中，能否合成穩(wěn)定的具有良好免疫原性的人工抗原是制備抗體和建立免疫分析方法的最關(guān)鍵的步驟[13,14]，人工抗原的制備一直是較難的步驟，而半抗原的設(shè)計(jì)和合成又是合成人工抗原的前提和基礎(chǔ)。本試驗(yàn)中西維因半抗原的合成，參考楊耀軍等[2]的方法(采用碳酸氫鈉溶液為反應(yīng)體系與氨基己酸反應(yīng))，發(fā)現(xiàn)部分萘氧基水解。然后本試驗(yàn)去掉碳酸氫鈉溶液, 直接采用四氫呋喃體系，在反應(yīng)體系中加入足量氨基己酸進(jìn)行反應(yīng)，獲得了CNH，并對(duì)其活化，進(jìn)一步偶聯(lián)了BSA和OVA兩種蛋白。

圖5 活化酯核磁共振譜(1H NMR)Fig.5 NMR spectrum of CNH-NHS

圖6 CNH-BSA及BSA紅外光譜鑒定Fig.6 IR spectrum of CNH-BSA and BSA

圖7 CNH-OVA及OVA紅外光譜鑒定Fig.7 IR spectrum of CNH-OVA and OVA

CNH活化后與蛋白的偶聯(lián)則采用CNH∶BSA、CNH∶OVA均為50∶1的摩爾比的反應(yīng)體系，在pH9.0的條件下室溫反應(yīng)3 h，經(jīng)鑒定偶聯(lián)成功。人工抗原的合成為下一步進(jìn)行動(dòng)物免疫、抗體鑒定及生物傳感器的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

[1]于春娣.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)農(nóng)作物中的西維因殘留[D].天津：天津科技大學(xué),2006.

[2]楊耀軍,渠桂榮,孟凡濤，等.西維因人工抗原的合成新方法[J].過程工程學(xué)報(bào),2005，5(2):201-204.

[3]Kuhr R J,Dorough W.Carbamate Tnsecticides:Chemistry,Biochemistry and Toxicology[M]. Florida:CRC Press,1976：135-140

[4]賴丹.基于鄰苯二甲酸酯的四種人工抗原的制備及免疫鑒定[D].廣州：廣東工業(yè)大學(xué)，2015.

[5]許艇,邵曉龍,秦治翔,等.殺蟲劑西維因單克隆抗體的研制及鑒定[J].免疫學(xué)雜志,2004，20(1):61-64.

[6]董婷婷.西維因農(nóng)藥殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究[D].天津：天津科技大學(xué),2009.

[7]Wu SX,Jiang JQ.Preparation of artificial antigen and immunological trait for estradiol[J].Advanced Materials Research,2012,424:612-615.

[8]XI Xi,Li Mujie,Gong YF,et al.Preparation and identification of streptomycin artificial antigen and its polyclonal antibody[J].Food Science,2013,34(5):181．

[9]姜盼盼，陳晨，李招慧，等.有機(jī)磷農(nóng)藥共性結(jié)構(gòu)人工抗原的合成與鑒定[J].衛(wèi)生研究,2009，38(6):649-652.

[10]張澤英,袁宗輝.獸藥人工抗原合成的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2006,40(5):44-47.

[11]李楠.強(qiáng)力霉素單克隆抗體的制備及其快速檢測(cè)試劑條的研究[D].煙臺(tái)：魯東大學(xué),2016.

[12]熊振宇,楊艷燕,李培武,等.兩種特異性氰戊菊酯人工抗原的合成與鑒定[J].食品科學(xué),2011,32(7):178-182.

[13]張煜超,王芳芳,李周敏,等.小分子藥物人工抗原的合成與研究進(jìn)展[J].藥物分析雜志,2014,34(6):947-951.

[14]Hua PZ,Ting TL,Hui LY. Antigens synthesis and antibodies preparation for furazolidone and its metabolite 3-amino-2-oxazolidinone[J]. Chinese Chemical Letters,2010,21(9):1049-1052.

(編輯：武英耀)

Synthesisandidentificationofartificialantigenforcarbary

Shuai Lifang1, Zhao Yong2, Yin Tao1, Huang Guitong1, Jiang Yun1, Li Daibo1

(1.CenterfordiseasecontrolandpreventionofGuangzhoumilitaryarea,Guangzhou510507,China; 2.SunYat-senUniversity,GuangZhou510006,China)

S482.3+4

A

1671-8151(2017)10-0749-05

2017-05-27

2017-06-30

帥麗芳(1978-)，女(漢)，山西原平人，副研究員，博士，研究方向：食品衛(wèi)生與安全

全軍后勤科研計(jì)劃(CGZ14J007)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B020314007)