馬身豬ZNF280D基因新型剪接體的鑒定及生物信息學分析

靳玉舒，李萌，張旗，高鵬飛，李步高，郭曉紅

(山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801)

馬身豬ZNF280D基因新型剪接體的鑒定及生物信息學分析

靳玉舒，李萌，張旗，高鵬飛，李步高，郭曉紅*

(山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801)

[目的]本試驗旨在探究馬身豬中鋅指蛋白(zinc finger protein)ZNF280D基因的剪接體類型。[方法]在豬轉(zhuǎn)錄組測序?qū)NF280D基因剪切位置預(yù)測的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR和克隆測序技術(shù)對預(yù)測的剪切位點進行驗證，檢測該基因不同剪接體的結(jié)構(gòu)并進行生物信息學分析。[結(jié)果]共檢測到2個剪接體，分別是ZNF280D1和ZNF280D2，ZNF280D1為該基因的常規(guī)轉(zhuǎn)錄本，ZNF280D2第8外顯子5’端大部分缺失。ZNF280D1含有3個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，屬tC2H2型鋅指蛋白，ZNF280D2含有4個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，屬maC2H2型鋅指蛋白。[結(jié)論]ZNF280D2與DNA的親和力大于ZNF280D1。

豬；ZNF280D基因；剪接體

Abstract:[Objective]In this study,the splice variant of the gene of zinc finger protein 280D (ZNF280D) in Mashen pigs was investigated.[Methods]Based on the prediction of theZNF280Dgene splicing position in the pig transcriptome sequence, these splice sites were verified by RT-PCR amplification, cloning and sequencing technique.[Results]Two alternative splicing isoforms of theZNF280Dgene calledZNF280D1 andZNF280D2 were discoveried in Mashen pigs. Compared withZNF280D1, the exon 8 inZNF280D2 was missed. Three C2H2zinc finger domain structures were found in ZNF280D1 that was a tC2H2type zinc finger protein. Four C2H2zinc finger domain structures were found inZNF280D2 that was a maC2H2type zinc finger protein.[Conclusion]The greater affinity for DNA was detected inZNF280D2.

Keywords:Susscrofa, ZNF 280D gene, Alternative splicing isoforms

鋅指蛋白(zinc finger protein)又名SUWH4(Suppressor of Hairy Wing Homolog 4)、 Zinc Finger Protein 634或 KIAA1584[1]，是一類通過特定的保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合Zn2+折疊形成類似“手指”樣結(jié)構(gòu)的蛋白。根據(jù)氨基酸與Zn2+結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)不同，鋅指蛋白可分成C2H2、C4和C63種主要的類型[2]。C2H2型鋅指蛋白可能是哺乳動物最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在細胞和生物體的生長、分泌等眾多生物過程中都起著重要的作用。例如，ZNF18在小鼠胚胎的心臟高表達，在成體中低表達，提示ZNF18可能與心臟發(fā)育密切相關(guān)[3]?？寺〉男∈蠡蚪M中的新基因Zfp474在睪丸中呈現(xiàn)高豐度表達，暗示其可能參與精子的發(fā)生[4]。另外通過體外人工構(gòu)建，還發(fā)現(xiàn)了某些特定鋅指結(jié)構(gòu)如VEGF-A的轉(zhuǎn)錄可以促進血管生長進而加速傷口愈合[5]。

鋅指蛋白家族含有大量的各類型剪接體，不同剪接體的出現(xiàn)增加了基因的多樣性和復(fù)雜性。轉(zhuǎn)錄本的差異性剪接可以直接或間接的影響蛋白質(zhì)的功能，也可視為蛋白的進化，這也使得研究鋅指蛋白及其剪接體的種類及功能在生物體的發(fā)育成熟、免疫抗病、適應(yīng)環(huán)境甚至進化等方面都變得尤為重要。

鋅指蛋白280D(ZNF280D)基因是C2H2型鋅指蛋白家族的成員之一，廣泛存在于在自然界的多種生物中，不同物種中該基因的位置、結(jié)構(gòu)和剪接體種類都有所不同。人的ZNF280D基因位于15號染色體，長288.396 kb，編碼的蛋白質(zhì)由979個氨基酸構(gòu)成，含有5個高度保守的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域(http://www.uniprot.org/uniprot/Q6N043)和一個DUF(domain of unknown function)4195結(jié)構(gòu)域，這些鋅指結(jié)構(gòu)通過結(jié)合DNA發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用。DUF4195結(jié)構(gòu)域是在多細胞動物蛋白N端發(fā)現(xiàn)的一個家族，它可以運載PHD樣鋅指結(jié)構(gòu)域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid=206007)。豬ZNF280D基因位于1號染色體，含有20個外顯子，該基因有67個直系同源，也同時包含C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域和DUF4195結(jié)構(gòu)域(http://asia.ensembl.org)。

在自然界的多種生物中都存在ZNF280D基因的剪接體，在人上已有24個該基因的剪接變異體得到證實，且有7個可能性較大的不同啟動子(https://en.wikipedia.org/wiki/SUHW4)。豬上已發(fā)現(xiàn)4種該基因的不同轉(zhuǎn)錄本，按所含堿基數(shù)由大到小排列依次為ZNF280DX2 (5609nt)，ZNF280DX1 (5458nt)，ZNF280DX5 (2857nt)和ZNF280DX3(2712nt)。ZNF280DX2 與ZNF280DX1相比在第2外顯子起始端增添了151個堿基，但該變化發(fā)生在CDS區(qū)外，因此ZNF280DX2和ZNF280DX1編碼的蛋白質(zhì)中氨基酸相同，為966個。ZNF280DX1包含ZNF280DX5，ZNF280DX5包含ZNF280DX3，前一序列從后一序列的3’端向后延長，ZNF280DX5和ZNF280DX3編碼的蛋白質(zhì)所含氨基酸個數(shù)分別為729和791個。4個轉(zhuǎn)錄本都含有3個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域和兩個Zn2+結(jié)合位點。牛、雞和鼠上也分別發(fā)現(xiàn)有8、4和2種該基因不同的轉(zhuǎn)錄本(www.ncbi.nlm.nih.gov)。但有關(guān)ZNF280D基因研究還很少，具體功能尚不清楚。

馬身豬為山西地方優(yōu)良品種，在抗逆性、繁殖力和肉品質(zhì)等方面有較多優(yōu)勢。本研究采用RT-PCR擴增和克隆測序技術(shù)，鑒定馬身豬ZNF280D基因剪接體類型，為進一步探討ZNF280D基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品收集

本研究試驗動物來自山西省大同市種豬場，0、3、6月齡的馬身豬，每階段4頭，公母各半，公豬斷奶時去勢。試驗動物在達到目標日齡當日屠宰，立即取背最長肌，用鋁箔包裹，放入離心管中，然后放入液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

PrimeScriptTMRT-PCR reagent Kit with gDNA Eraser(perfect Real Time)(TaKaRa, 大連)；RNAiso Plus regent(TaKaRa, 大連)。

AB-9902型觸摸式PCR儀(AB公司，美國)；DYY-3電泳儀(六一儀器廠，北京)；ND-1000核酸蛋白測定儀(Nanodrop，美國)。

1.3 RNA提取和cDNA合成

按照RNAiso Plus regent(TaKaRa, 大連)說明書提取肌肉的總RNA，利用ND-1000核酸蛋白測定儀測定總RNA 的OD 260/280值確定RNA的純度。用非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按照PrimeScriptTM-RT-PCR reagent Kit with gDNA Eraser(perfect Real Time)(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。第一步反應(yīng)體系10 μL： RNA 500 ng，gDNA Eraser buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，加RNase-free水至10 μL。反應(yīng)程序：42 ℃，2 min，4 ℃，3～5 min。第二步反應(yīng)體系20 μL：第一步產(chǎn)物加RNAase Free H2O 4 μL，5×primer 4 μL，mixⅠ1 μL，RTmix 1 μL。反應(yīng)程序：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s，4 ℃，5 min。cDNA保存于-20 ℃。

1.4 ZNF280D引物設(shè)計與合成

本試驗對ZNF280D引物的設(shè)計是基于豬轉(zhuǎn)錄組測序中可變剪切位點的預(yù)測所進行的。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，ZNF280DmRNA第1～9外顯子中共有3處可能性較大的剪切位點，分別位于第1內(nèi)含子間、第4內(nèi)含子間和第7內(nèi)含子5’端至第8外顯子3’端。根據(jù)此預(yù)測結(jié)果和NCBI中豬ZNF280D(登錄號：XM_005659574.2)基因序列，選用NCBI Primer-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和 Oligo 7軟件設(shè)計3對引物(表1)。

引物PL:FL位于第1外顯子末端，RL位于第9外顯子起始端，跨越第2～8外顯子，包含3個預(yù)測的可變剪切位點。

引物PS1：FS1與PL相同，RS1位于第5外顯子上，跨越2～4外顯子，包含前2個預(yù)測位點。

引物PS2：FS2位于第7外顯子起始端，RS2與RL相同，跨越部分第7外顯子，第8外顯子和部分第9外顯子，包含第3個剪切位點(圖1)。先用包含所有剪切位點的引物(PL)來確定ZNF280D基因是否產(chǎn)生多個剪接體，再分別針對不同位點設(shè)計引物(PS1和PS2)檢測該基因的變異位置，增強試驗的可靠性。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 豬ZNF280D克隆引物Table 1 Primers used for cloning of pig ZNF280D genes

圖1 豬ZNF280D基因部分結(jié)構(gòu)圖及引物位置Fig.1 The partial genomic structure diagram and positions of the primers of ZNF280D in pig注：(1)藍色方框代表外顯子。(2)綠色箭頭代表引物。上游引物FL/FS1位于外顯子1；下游引物RS1位于外顯子5；上游引物FS2位于外顯子7；下游引物RS2/RL位于外顯子9。Note: (1) Blue box meant the exon.(2) Green arrow meant the primer. The upstream primer FL / FS1 are located in exon 1; The downstream primer RS1 is located in exon 5; The upstream primer FS2 is located in exon 7; The downstream primer RS2 / RL are located in exon 9.

1.5 PCR擴增及克隆

PCR體系10 μL：cDNA 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 5 μL，上下游引物各1 μL，加RNAase Free H2O 至10 μL。PCR反應(yīng)程序： 95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56～64 ℃ 30 s，72 ℃ 69 s 35個循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離。

PCR產(chǎn)物經(jīng)OMEGA Gel Extraction Kit(OMEGA D2500-01)純化后，連接克隆pMD-19T(TaKaRa，大連)，陽性克隆菌液送華大基因測序。

1.6 生物信息學分析

采用Megalign軟件對測序結(jié)果拼接并進行序列比對，用Editseq軟件翻譯核苷酸序列，用Megalign比對不同剪接體氨基酸序列，不同物種該基因的同源性并構(gòu)建生物進化樹，用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬ZNF280D可變剪接體的鑒定

以cDNA池為模板，擴增ZNF280DmRNA的前半段(外顯子1～9)，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產(chǎn)物分3部分：引物PS1包含預(yù)測結(jié)果中的前2個可能發(fā)生變化的剪切位點，擴增產(chǎn)物為清晰的一條目的條帶(圖2a)，說明在外顯子1～5之間無可變剪接體產(chǎn)生，對于前2個剪切位點的預(yù)測結(jié)果不成立。PS2擴增產(chǎn)物(圖 2b)與PL擴增產(chǎn)物(圖2c)都顯示為2條甚至多條帶，推測ZNF280D有至少2種以上的轉(zhuǎn)錄本。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR 擴增結(jié)果Fig.2 RT-PCR products detected by agarosegel electrophoresis

對PS2和PL引物擴增的產(chǎn)物進行割膠回收、純化、連載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞克隆。測序結(jié)果顯示含有2條不同序列：一條是經(jīng)正常剪接產(chǎn)生的ZNF280DmRNA，另一條則由于第7內(nèi)含子3’端剪切位點后移至第8外顯子內(nèi)，使得第8外顯子由5’端開始的222個堿基序列被剪切，僅保留第8外顯子3’端最后兩個堿基(5’-AG-3’)(圖3,圖4)，分別定義常規(guī)轉(zhuǎn)錄本和變異轉(zhuǎn)錄本為ZNF280D1和ZNF280D2。ZNF280D2是不同于NCBI數(shù)據(jù)庫中豬ZNF280D基因4個剪接體的新序列。

2.2 生物信息學分析

采用Megalign軟件對克隆菌液測序結(jié)果拼接，并采用Editseq軟件翻譯這兩條核苷酸序列進行比對，并對多肽鏈進行比對，與ZNF280D1相比，ZNF280D2缺失了第247～322個AA(圖5)。并用NCBI的BLAST對兩條多肽鏈進行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，在ZNF280D1的第347～426 AA存在著3段C2H2型鋅指蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和2個Zn2+結(jié)合位點。而剪接體ZNF280D2在第229～352AA間有4段同類型的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和3個Zn2+結(jié)合位點，但它們都屬于典型C2H2型鋅指蛋白(圖6)。

圖3 豬ZNF280D1 和 ZNF280D2 的部分核苷酸序列比對Fig.3 Partial nucleotide sequence alignments of ZNF280D1 and ZNF280D2 in pig注：紅色“…”代表缺失序列，藍色“∣”代表同樣的序列。Note: The red“…”meant deletion of nucleotide; The blue “∣”meant the same sequence.

圖4 豬ZNF280D1和ZNF280D2的部分基因結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The partial genomic structure diagram of ZNF280D1和ZNF280D2 in Mashen pig注：虛線方框代表外顯子缺失部分。Note: Dotted box meant the partial deletion of exon.

采用Megalign比對豬ZNF280D與其他物種的該蛋白AA序列的同源性并構(gòu)建生物進化樹，結(jié)果顯示豬ZNF280D蛋白與小須鯨、牪牛和綿羊的同源性最高，其次是蒙古野馬、白犀牛、雪貂和長翼蝠，而與果蠅與人的同源性較低(圖6,圖7)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在馬身豬中，只出現(xiàn)了2個ZNF280D的轉(zhuǎn)錄本，除了常規(guī)的ZNF280DmRNA，還發(fā)現(xiàn)了一個新剪接體。不同轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)的原因可以分兩類，mRNA的選擇性剪切和翻譯起始位點的不同。分析該剪接體的核苷酸序列，并與常規(guī)的ZNF280DmRNA(ZNF280D1)相比，ZNF280D2變異剪切位點發(fā)生在第7內(nèi)含子3’端，導致第8外顯子5’端選擇性縮短，該外顯子的大部分序列缺失，除此之外沒有內(nèi)含子保留或其他的堿基增添現(xiàn)象，而ZNF280D基因的起始密碼子位于第2外顯子，該位置沒有發(fā)生任何變化，因此該剪接體的啟動子未發(fā)生改變，僅基因編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生選擇性剪切。對這2個轉(zhuǎn)錄本的氨基酸序列在線分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)發(fā)現(xiàn)，兩者所編碼蛋白都含有保守的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，但常規(guī)ZNF280DmRNA含有3個該結(jié)構(gòu)域，屬于tC2H2型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，新型剪接體則由于第8外顯子的大部分缺失，在變異的位置堿基重新組合使得其編碼的蛋白質(zhì)增加了一個鋅指蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，變成了maC2H2型鋅指蛋白。

圖5 馬身豬ZNF280D1和ZNF280D2氨基酸序列對比圖Fig.5 Amino acid sequence alignments of ZNF280D1 and ZNF280D2 in Mashen pig注：黑色方框代表相同氨基酸，“——”代表缺失氨基酸。Note: Black box meant the same sequence, “——”meant deletion of amino acid sequence.

圖6 ZNF280D1和ZNF280D2的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conservative amino acid structure domain of ZNF280D1 and ZNF280D2

圖7 ZNF280D1和 ZNF280D2蛋白在不同物種間的系統(tǒng)發(fā)育樹(貓頭鷹猴，牦牛，小須鯨，白犀牛，果蠅，野馬，人，穿山甲，長翼蝠，雪貂和綿羊)Fig.7 Phylogentic tree of ZNF280D1 and ZNF280D2 protein among different species (Aotus nancymaae, Bos mutus, Balaenoptera acutorostrata scammoni, Ceratotherium simum simum, Drosophila, Equus przewalskii, Homo sapiens, Manis javanica, Miniopterus natalensis, Mustela putorius furo, Ovis aries aries)

GAGA因子是唯一一個只含有一個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白[6]，其他的C2H2型鋅指蛋白都含有3個或3個以上的鋅指結(jié)構(gòu)，但并不是所有的結(jié)構(gòu)域都可以結(jié)合DNA，例如典型的maC2H2型轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA，含有9個鋅指結(jié)構(gòu)，其中只有前1～3個鋅指可以穿過DNA雙螺旋的“大溝”與之特異性結(jié)合，而鋅指4～6則游離在DNA外部形成一個開放型結(jié)構(gòu)[7～10]。除此之外，很多研究顯示，結(jié)合DNA的各鋅指結(jié)構(gòu)其結(jié)合能力也不相同，例如TFⅢA，其第7～9個鋅指結(jié)構(gòu)也可以結(jié)合DNA，但親和力比鋅指1～3要弱[11,12]。小鼠的轉(zhuǎn)錄因子tC2H2型鋅指蛋白Zif268所含的3個鋅指結(jié)構(gòu)按親和力由大到小排列依次為鋅指1大于鋅指2大于鋅指3[13]。maC2H2型鋅指蛋白WT1含有的4個鋅指結(jié)構(gòu)中，鋅指1與DNA的結(jié)合能力明顯低于鋅指2～4，但鋅指2～4對靶DNA的親和力要高于完整的鋅指1～4結(jié)構(gòu)[14,15]，這一現(xiàn)象也暗示了，不能結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)具有增強其他鋅指與DNA結(jié)合力，使得整個結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的作用。許多其他研究也表明，通常蛋白中所含鋅指的數(shù)目越多， 它選擇結(jié)合的能力也就越強。除此之外，鋅指結(jié)構(gòu)中鋅的作用也不可替代，鋅離子與氨基酸殘基結(jié)合使肽鏈形成穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)，進而通過該結(jié)構(gòu)激活蛋白與DNA結(jié)合發(fā)揮生物學功能。本研究中通過分析ZNF280D蛋白結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，ZNF280D1和ZNF280D2蛋白的最后一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域都不含有Zn2+結(jié)合位點，不能形成穩(wěn)定的鋅指結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合。ZNF280D2發(fā)生變異后增加的鋅指1雖含有Zn2+結(jié)合位點，但不能結(jié)合核苷酸，說明該鋅指結(jié)構(gòu)與DNA沒有實際結(jié)合功能，但它的出現(xiàn)可能提升了鋅指2～3與DNA的親和力，使得該剪接體所編蛋白比傳統(tǒng)ZNF280D蛋白更易結(jié)合DNA，形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在該基因的編碼水平達到蛋白進化的效果。

C2H2鋅指蛋白在生物體生長發(fā)育過程中起著不容忽視的作用，很多研究發(fā)現(xiàn)它可以影響機體的免疫功能，例如參與造血干細胞、T細胞[16]和B細胞[17]等免疫細胞的分化和成熟，某些炎性因子[18]的產(chǎn)生，信號轉(zhuǎn)導，以及腫瘤的形成[19,20]。在人的某些免疫性疾病如紅斑狼瘡[21]和念珠菌病等遺傳病[22]中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在鋅指蛋白基因的變異，在肝細胞癌、胃癌、結(jié)腸癌和非小細胞型肺癌中也都能檢測到某些鋅指蛋白(ZNF165)mRNA 的表達[23]。這一系列關(guān)于C2H2型鋅指家族的研究暗示了ZNF280D基因在機體生長發(fā)育以及免疫過程中的潛在影響，對進一步研究ZNF280D基因在生物體中的功能具有導向作用。

4 結(jié)論

本試驗在馬身豬上發(fā)現(xiàn)了一個ZNF280D基因的新型剪接體(ZNF280D2)，該剪接體第8外顯子靠近5’端的大部分序列被剪切，導致其編碼的蛋白質(zhì)中增加了一個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域不能結(jié)合DNA，但可能會增強相鄰鋅指結(jié)構(gòu)與DNA的親和力，提高結(jié)合產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

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(編輯：馬榮博)

IdentificationandbioinformaticsanalysisofalternativesplicingisoformsofZNF280DgeneinMashenPig

Jin Yushu, Li Meng, Zhang Qi, Gao Pengfei, Li Bugao, Guo Xiaohong*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedcine,ShanxiAgriculturalUnivesity,Taigu030801,China)

Q78

A

1671-8151(2017)10-0726-07

2017-03-28

2017-06-06

靳玉舒(1993-)，女(漢)，山西長治人，碩士研究生，研究方向：動物環(huán)境調(diào)控

*通信作者：郭曉紅，副教授，碩士生導師，E-mail:g_xiaohong@126.com

山西省科技創(chuàng)新重點團隊項目(201605D131045-24)；山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(20140311020-5)