不同沙棘果渣添加水平對公綿羊睪丸和附睪抗氧化性的影響

韓曉強(qiáng)，張春香，張文佳，項(xiàng)斌偉，張建新*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省右玉縣畜牧局，山西 右玉 037200)

不同沙棘果渣添加水平對公綿羊睪丸和附睪抗氧化性的影響

韓曉強(qiáng)1，張春香1，張文佳2，項(xiàng)斌偉2，張建新1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省右玉縣畜牧局，山西 右玉 037200)

[目的]研究飼喂不同沙棘果渣添加水平的日糧對公綿羊睪丸與附睪抗氧化性的影響。[方法]選用24只5月齡，體重(25.00±1.00) kg健康的杜泊×小尾寒羊雜交公羔，隨機(jī)分為4組，按照分組依次飼喂添加不同水平沙棘果渣(0%、10%、20%、30%)的日糧，試驗(yàn)期65 d。試驗(yàn)結(jié)束后采集公綿羊的睪丸和附睪組織，并對組織抗氧化相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究。[結(jié)果]睪丸組織中，30%沙棘果渣添加組GPx4 mRNA的相對表達(dá)量相較于10%添加組以及對照組顯著降低(P<0.05)。附睪頭組織中，30%沙棘果渣添加組Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量顯著低于10%和20%沙棘果渣添加組(P<0.05)；30%沙棘果渣添加組GPx4 mRNA的相對表達(dá)量相較于對照組顯著降低(P<0.05)。附睪體組織中，30%沙棘果渣添加組CATmRNA的相對表達(dá)量相較于10%添加組顯著降低(P<0.05)。附睪尾組織中，20%沙棘果渣添加組Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量相較于30%添加組與對照組顯著升高(P<0.05)；30%沙棘果渣添加組Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量相較于10%添加組顯著降低(P<0.05)。20%沙棘果渣添加組附睪頭Nrf2與附睪尾Cu-ZnSOD蛋白表達(dá)量顯著高于10%和30%沙棘果渣添加組。[結(jié)論]日糧中添加10%和20%沙棘果渣可以不同程度促進(jìn)公綿羊睪丸和附睪抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，而添加30%沙棘果渣會降低睪丸GPx4、附睪頭Cu-ZnSOD和GPx4、附睪體CAT、附睪尾Cu-ZnSODmRNA以及附睪頭Nrf2和附睪尾Cu-ZnSOD蛋白的表達(dá)量。因此，25 kg杜泊×小尾寒羊雜交公羔日糧中添加30%沙棘果渣為過量添加水平。

沙棘果渣；睪丸；附睪；抗氧化；綿羊；mRNA

Abstract:[Objective]The purpose of this study was to investigate the effects of dietary Sea buckthorn Pomace on antioxidation in testis and epididymis of ram.[Methods]A total of 24 Dopor×Small Tail Han Sheep ram lambs (5 month old, 25.00±1.00 kg)were randomly selected and equally divided into 4 groups, and received diet containing different level of sea buckthorn pomace (0%, 10%, 20%, 30%). At the end of the trial (65 d), the samples of testis and epididymis were collected and the mRNA and protein expression were detected.[Results]The results were as follows: The mRNA expression ofGPx4 in testis was significantly lower in 30% group than that in control group and 10% supplementation group (P< 0.05). Compared with the 10% and 20% groups, the mRNA expression ofCu-ZnSODin 30% group was significantly lower in caput epididymidis (P<0.05). The mRNA expression ofGPx4 in caput epididymidis was significantly lower in 30% supplementation group than this in control group (P<0.05). Compared with the group with 10% sea buckthorn pomace, the mRNA expression ofCATin 30% group was significantly lower in corpus epididymidis (P<0.05). The mRNA expression ofCu-ZnSODin cauda epididymidis was significantly lower in control group and 30% group than that in 20% sea buckthorn pomace supplementation group (P<0.05). In addition, compared with 10% sea buckthorn pomace addition group, the mRNA expression ofCu-ZnSODin 30% group was significantly lower in cauda epididymidis (P<0.05). The protein expression of Nrf2 in caput epididymal and Cu-ZnSOD in the cauda epididymal were significantly higher in 20% group than that in 10% group and 30% group (P<0.05).[Conclusion]The results indicated that supplementation of 10% and 20% of dietary sea buckthorn pomace could improve the mRNA expression of antioxidation related genes expression in testis and epididymis of ram, whereas supplementation of 30% sea buckthorn pomace reduced the mRNA expression ofGPx4 in testis,Cu-ZnSODandGPx4 in caput epididymidis,CATin corpus epididymidis andCu-ZnSODin cauda epididymidisa and the protein expression of Nrf2 in caput epididymidis and Cu-ZnSOD in cauda epididymidisa. Therefore, dietary 30% sea buckthorn pomace is not optimal.

Keywords:Sea buckthorn pomace, Testis, Epididymis, Antioxidation, Ram, mRNA

沙棘作為一種胡頹子科的植物，含有豐富的生物活性物質(zhì)，如維生素、多不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、植物甾醇、有機(jī)酸、黃酮類以及一些必需氨基酸等，具有調(diào)節(jié)心血管、抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤及抗衰老等眾多積極功能[1,2]。其中，黃酮類物質(zhì)與沙棘的抗氧化功能密切相關(guān)。Geetha等[3]以鉻誘導(dǎo)氧化損傷的雄性白鼠為模型動物，證明了100和250 mg·kg-1BW濃度的沙棘葉提取物對其具有顯著的保護(hù)作用。杜鵑等[4]研究表明對于由酒精造成的小鼠急性睪丸組織損傷，灌服沙棘勻漿可以起到保護(hù)作用。

山西省沙棘的種植量大，廣泛制造沙棘果汁及其他沙棘產(chǎn)品的同時，勢必會產(chǎn)生大量的沙棘果渣等下腳料。已有研究中，沙棘果渣主要在蛋雞[5]、肉雞[6]及育肥豬[7]的日糧中添加，研究對動物機(jī)體生長性能、肉質(zhì)、血清生化指標(biāo)及肌肉脂肪酸等指標(biāo)的影響。另有研究指出，沙棘果渣中提取的總黃酮具有良好的抗氧化性[8,9]。因此，本試驗(yàn)使用添加不同水平沙棘果渣的飼料來飼喂杜泊×小尾寒羊雜交公羔，觀察其對公綿羊睪丸與附睪組織抗氧化相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)量的影響，為今后沙棘果渣作為綿羊非常規(guī)飼料潛能的發(fā)掘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)日糧

沙棘果渣購自山西省朔州市右玉縣沙棘廠，自然晾干后使用。以NRC(2007)中體重25 kg，日增重200 g公羔羊營養(yǎng)需要為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)本試驗(yàn)所需的基礎(chǔ)日糧；再分別按照10%、20%、30%的沙棘果渣等比例替代谷秸設(shè)計(jì)試驗(yàn)組日糧，4種試驗(yàn)日糧均制備為顆粒飼料，表1為其相應(yīng)組成成分。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取5月齡的杜泊×小尾寒羊雜交公羔24只，其體重為(25.00±1.00)kg。按照單因素完全隨機(jī)的方法將選取的綿羊分為4組，各組均為混合飼養(yǎng)，嚴(yán)格按照對照組(0%)、試驗(yàn)組(10%、20%、30%)的分組設(shè)計(jì)飼喂對應(yīng)日糧。

1.3 動物管理

2015年5-8月期間進(jìn)行為期65 d的動物飼養(yǎng)試驗(yàn)，包括15 d預(yù)試期與50 d正試期。由山西省右玉縣宏宇牧業(yè)有限公司提供試驗(yàn)基地。試驗(yàn)前將羊舍清掃并進(jìn)行嚴(yán)格消毒，同時對選取的試驗(yàn)羊嚴(yán)格檢疫，之后使用小反芻獸疫、羊痘以及口蹄疫疫苗對檢疫合格的試驗(yàn)羊進(jìn)行免疫接種。

在預(yù)試期對選取的試驗(yàn)綿羊進(jìn)行明確的編號并隨機(jī)分組，與此同時對綿羊進(jìn)行驅(qū)蟲。正試期所有試驗(yàn)羊均為自由采食和飲水，每日分別于8:00與18:00嚴(yán)格按照分組飼喂相對應(yīng)的日糧2次，并對每只羊每天的采食量進(jìn)行記錄。

1.4 睪丸及附睪組織的采集

于飼養(yǎng)試驗(yàn)完成當(dāng)天16:00禁食禁水，次日屠宰時采集睪丸組織，去除睪丸周圍結(jié)締組織并分離附睪后取一側(cè)睪丸組織和附睪組織剪成小塊，其中附睪按附睪頭、體、尾3部分進(jìn)行采集，錫紙包裹后做好標(biāo)記并投入液氮，之后-80 ℃存放以便使用。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 抗氧化相關(guān)基因選取

對采集的睪丸和附睪組織中過氧化氫酶(CAT)、核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶4(GPx4)等基因mRNA和蛋白的表達(dá)量進(jìn)行研究。并選取RPL13和β-actin分別作為mRNA和蛋白測定的內(nèi)參基因。

1.5.2 抗氧化基因mRNA表達(dá)量檢測

液氮中分別研磨睪丸與附睪頭、體、尾組織后，按照Trizol法對各個組織的總RNA進(jìn)行提取，測定其完整性，并檢測濃度。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser 的方法合成 cDNA，檢測并調(diào)整cDNA濃度一致后，再通過實(shí)時熒光定量PCR，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，所得結(jié)果按照2-ΔΔCT法計(jì)算。表2為試驗(yàn)所需目的基因與內(nèi)參基因的引物參數(shù)。

表1 日糧成分及其營養(yǎng)水平Table 1 The compositions and nutrient levels of experiment diets

注：每千克日糧中維生素以及微量元素的含量依次為：維生素A 20000 IU; 維生素D 4000 IU; 維生素E 400 IU; 銅 14 mg; 鐵 50 mg; 錳 40 mg; 硒 0.3 mg; 碘 0.5 mg; 鈷 0.2 mg。表中日糧各營養(yǎng)成分除消化能以外都是實(shí)測值。
Note: The contents of vitamins and trace elements per kilogram of diet: VA 20000 IU; VD 4000 IU; VE 400 IU; Cu 14 mg; Fe 50 mg; Mn 40 mg; Se 0.3 mg; I 0.5 mg; Co 0.2 mg; Beside DE, the compositions of diets were calculated values.

1.5.3 抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測

分別稱取研磨好的睪丸及附睪樣品，根據(jù)實(shí)際所取組織樣品重量按1∶10加入相應(yīng)體積的蛋白裂解液來提取總蛋白。取分裝的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，利用考馬斯亮藍(lán)染色確認(rèn)成功提取蛋白。

通過以下步驟進(jìn)行目的和內(nèi)參蛋白的檢測：按順序配制分離膠和沉積膠，凝固后按順序點(diǎn)樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用電泳后的分離膠轉(zhuǎn)膜1 h。之后封閉1 h，再加入相應(yīng)一抗孵育，4 ℃過夜。次日漂洗后加入相對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，漂洗之后使用ECL顯色液進(jìn)行蛋白免疫印跡曝光，獲取結(jié)果圖像并保存。使用Image Lab軟件分析曝光圖像中目的蛋白與β-actin蛋白含量，根據(jù)公式(目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白含量/β-actin蛋白含量)計(jì)算結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

將試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)在Excel 2007中進(jìn)行初步的整理并按照公式計(jì)算，之后把計(jì)算獲得的數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0的單因素方差分析，同時采用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05為判斷差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

表2引物參數(shù)
Table2 Parameters of Primer

基因Genename引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')產(chǎn)物大小/bpProductsizeRPL13F:GCAAAAAGGGCCAAGGAAGCR:CAAAGGTCAGACACACCCCA155Nrf2F:TGTGGAGGAGTTCAACGAGCR:CGCCGCCATCTTGTTCTTG88GPx4F:TCGCTGCTGGCTATAACGTCR:GACCATACCGCTTCACCACA189CatalaseF:GAGCCCACCTGCAAAGTTCTR:CTCCTACTGGATTACCGGCG148Cu-ZnSODF:GGAGACCTGGGCAATGTGAAR:CCTCCAGCGTTTCCAGTCTT182

2 結(jié)果與分析

2.1日糧添加沙棘果渣對綿羊睪丸和附睪抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

2.1.1 日糧添加沙棘果渣對綿羊睪丸抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

圖1 A、1 B和1 C中，10%與20%沙棘果渣添加組中CAT、Nrf2、Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量相較于對照組具有升高趨勢(P>0.05)，而沙棘果渣添加量達(dá)到30%時睪丸CAT和Nrf2 mRNA的相對表達(dá)量均降低(P>0.05)；圖1 D中30%沙棘果渣添加組睪丸中GPx4 mRNA的相對表達(dá)量低于10%添加組和對照組(P<0.05)，而10%與20%沙棘果渣添加組睪丸中GPx4 mRNA的相對表達(dá)量相較于對照組無明顯變化(P>0.05)。

圖1 各試驗(yàn)組綿羊睪丸中抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量Fig.1 The mRNA expression of antioxidant related gene in ram testis from each group注：柱狀圖上標(biāo)的小寫字母不同表明其差異顯著(P<0.05)，上標(biāo)相同字母表明差異不顯著(P>0.05)。圖2～圖8同。Note: In the histogram, different lowercase letter susperscripts indicate significant difference(P<0.05), the same lowercase letter susperscripts indicate no significant difference(P>0.05). Figure 2 to Figure 8 were as the same.

圖2 各試驗(yàn)組綿羊附睪頭中抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量Fig.2 The mRNA expression of antioxidant related gene in ram caput epididymidis from each group

圖3 各試驗(yàn)組綿羊附睪體中抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量Fig.3 The mRNA expression of antioxidant related gene in ram corpus epididymidis from each group

2.1.2 日糧添加沙棘果渣對綿羊附睪頭抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

圖2 A和圖2 B中，沙棘果渣的不同添加水平下CAT和Nrf2 mRNA的相對表達(dá)量在各組別間均無顯著差異(P>0.05)。圖2 C中30%沙棘果渣添加組Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量顯著低于10%和20%沙棘果渣添加組(P<0.05)；相對于對照組，10%和20%沙棘果渣添加組均有升高趨勢，但沒有顯著差異(P>0.05)，沙棘果渣添加量達(dá)到30%反而下降(P>0.05)。圖2 D中，30%沙棘果渣添加組GPx4 mRNA的相對表達(dá)量相較于對照組顯著降低(P<0.05)，而其余各組別無顯著差異(P>0.05)。

2.1.3 日糧添加沙棘果渣對綿羊附睪體抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

圖3 A中30%沙棘果渣添加組CATmRNA的相對表達(dá)量顯著低于10%添加組(P<0.05)；相較于對照組，10%和20%沙棘果渣添加組CATmRNA的相對表達(dá)量有不同程度的上升趨勢，30%添加組CATmRNA表達(dá)量反而降低，但均無明顯差異(P>0.05)。而圖3 B、3 C和3 D中，10%沙棘果渣添加組Nrf2、Cu-ZnSOD和GPx4 mRNA的相對表達(dá)量相較于對照組具有升高趨勢(P>0.05)，20%沙棘果渣添加組中Nrf2和GPx4 mRNA的相對表達(dá)量相較于對照組均有所上升(P>0.05)；而沙棘果渣添加量達(dá)到30%時附睪體Nrf2、Cu-ZnSOD和GPx4 mRNA的相對表達(dá)量均降低(P>0.05)。

2.1.4 日糧添加沙棘果渣對綿羊附睪尾抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

圖4 A、4 B和4 D中，沙棘果渣的不同添加水平下CAT、Nrf2和GPx4 mRNA的相對表達(dá)量在各組別間均無顯著差異(P>0.05)。圖4 C中20%沙棘果渣添加組中Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量相較于對照組顯著升高(P<0.05)；10%和20%添加組Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量顯著高于30%添加組(P<0.05)，而30%添加組相較于對照組Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量僅有降低趨勢 (P>0.05)。

圖4 各試驗(yàn)組綿羊附睪尾中抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量Fig.4 The mRNA expression of antioxidant related gene in ram cauda epididymidis from each group

2.2日糧添加沙棘果渣對綿羊睪丸和附睪抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

2.2.1 日糧添加沙棘果渣對綿羊睪丸抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

圖5 A、5 B、5 C和5 D中，沙棘果渣的不同添加水平下各組別間CAT、Nrf2、Cu-ZnSOD及GPx4 蛋白的相對表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 日糧添加沙棘果渣對綿羊附睪頭抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

圖6 A、6 C和6 D中，沙棘果渣的不同添加水平下CAT、Cu-ZnSOD和GPx4蛋白的相對表達(dá)量在各組別間均無顯著差異(P>0.05)。圖6 B中20%沙棘果渣添加中Nrf2 蛋白的相對表達(dá)量顯著高于10%和30%添加組(P<0.05)，與對照組相比有升高趨勢卻無顯著差異(P>0.05)。

2.2.3 日糧添加沙棘果渣對綿羊附睪體抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

圖7 A、7 B、7 C和7 D中，沙棘果渣的不同添加水平下CAT、Nrf2、Cu-ZnSOD、GPx4蛋白的相對表達(dá)量在各組別間均無顯著差異(P>0.05)。

2.2.4 日糧添加沙棘果渣對綿羊附睪尾抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

圖8 A、8 B和8 D中，沙棘果渣的不同添加水平下CAT、Nrf2和GPx4蛋白的相對表達(dá)量在各組別間均無顯著差異(P>0.05)；圖8 C中20%沙棘果渣添加組Cu-ZnSOD 蛋白的相對表達(dá)量顯著高于10%和30%添加組(P<0.05)，與對照組相比有升高趨勢卻無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

沙棘擁有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，并有多種藥理作用，其不同部位及提取物均能有效提高動物組織器官及機(jī)體的抗氧化能力。有研究表明，沙棘可以有效緩解由于急性酒精攝入造成的小鼠肝臟和腦組織的氧化應(yīng)激[10]；沙棘籽渣以及大果沙棘中提取的黃酮可以分別提高更年期大鼠和糖尿病小鼠機(jī)體的抗氧化能力[11,12]。

調(diào)控動物機(jī)體的抗氧化性能一般通過改變抗氧化相關(guān)酶的活性、數(shù)量以及其他抗氧化物質(zhì)實(shí)現(xiàn)。動物機(jī)體中存在CAT、SOD及GPx等多種抗氧化酶，可以有效的清除動物機(jī)體產(chǎn)生的活性氧以及氧化產(chǎn)物。機(jī)體產(chǎn)生的O2-首先需要SOD催化生成H2O2，而其產(chǎn)生的H2O2同機(jī)體代謝產(chǎn)生的H2O2均通過CAT和GPx催化轉(zhuǎn)化為對機(jī)體無負(fù)面影響的H2O，從而保護(hù)細(xì)胞及機(jī)體免受氧化損傷。SOD和GPx基因家族在不同組織器官中的含量各不相同，而睪丸組織中含量較多的為Cu-ZnSOD和GPx4[13,14]，并且其在附睪中亦有表達(dá)。

圖5 各試驗(yàn)組綿羊睪丸中抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)量Fig.5 The expression of antioxidant related protein in ram testis from each group

圖6 各試驗(yàn)組綿羊附睪頭中抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)量Fig.6 The expression of antioxidant related protein in ram caput epididymis from each group

圖7 各試驗(yàn)組綿羊附睪體中抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)量Fig.7 The expression of antioxidant related protein in ram corpus epididymis from each group

圖8 各試驗(yàn)組綿羊附睪尾中抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)量Fig.8 The expression of antioxidant related protein in ram cauda epididymis from each group

國內(nèi)外均有研究表明，沙棘果渣提取的總黃酮具有良好的抗氧化性[8,9]，但其對動物睪丸和附睪mRNA的影響研究卻很少見。在日糧中添加有抗氧化性能的物質(zhì)，可以影響動物睪丸mRNA的表達(dá)量。葡多酚和槲皮素的抗氧化性能已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)識，前者是葡萄皮渣中的一種有效成分，公綿羊飼喂添加適量葡萄皮渣的日糧，能夠有效提高其睪丸中Cu-ZnSODmRNA的相對表達(dá)量，以緩解活動空間造成的氧化應(yīng)激[15]。后者為一種黃酮類化合物，可以增強(qiáng)大鼠睪丸支持細(xì)胞中GSH-Px、GR、GST和SOD-1 mRNA的表達(dá)量[16]。本研究中，相較于對照組，日糧中添加20%的沙棘果渣，顯著增強(qiáng)了附睪尾Cu-ZnSODmRNA的表達(dá)量，結(jié)果與以上研究基本一致。

不同添加水平的抗氧化物質(zhì)對動物機(jī)體產(chǎn)生的影響程度不同。動物靜脈注射不同劑量的外源性抗氧化劑可以提高血液中CAT、GSH-Px基因表達(dá)水平，其效果隨劑量增大而提高[17]。黃晶等研究也表明，僅中、高水平的沙棘提取物可以增強(qiáng)小鼠心肌組織SODmRNA的表達(dá)量，并且表現(xiàn)為高水平組表達(dá)量高于中水平組[18]。而沙棘在不同動物中的添加水平是有很大差別的，并且沙棘果渣成分復(fù)雜，不同的添加水平對動物機(jī)體的影響也會有所不同。本試驗(yàn)中，公綿羊睪丸和附睪組織中抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量并未與沙棘果渣添加劑量呈正相關(guān)變化，20%沙棘果渣添加組附睪尾中Cu-ZnSOD mRNA的表達(dá)量有效提高，而其余10%與20%沙棘果渣添加組中睪丸和附睪抗氧化相關(guān)mRNA表達(dá)量僅有不同程度的升高趨勢；然而，30%沙棘果渣添加組中附睪頭與睪丸中GPx4 mRNA的相對表達(dá)量、附睪頭與附睪尾中的Cu-ZnSODmRNA相對表達(dá)量以及附睪體中CATmRNA的相對表達(dá)量反而顯著降低。其中，睪丸與附睪頭GPx4 mRNA的相對表達(dá)量相較于對照組顯著降低。由此看出，綿羊日糧中添加適宜的沙棘果渣可以不同程度的提高睪丸和附睪組織抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量，而沙棘果渣的添加水平過量反而會降低其表達(dá)量。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在細(xì)胞、組織、器官中起重要的抗氧化作用，其對下游靶基因的調(diào)控是通過信號通路Keap1-Nrf2-ARE來實(shí)現(xiàn)。Nrf2激活后可以調(diào)控下游基因CAT、Cu-ZnSOD、GPx4的表達(dá)[19,20]。研究表明，沙棘提取物預(yù)處理的細(xì)胞，可以激活Nrf2 mRNA的表達(dá)，經(jīng)百草枯處理后可有效誘導(dǎo)其靶基因GPx1、CAT、GST等表達(dá)[21]。此外，抗氧化劑可以抑制Nrf2與Keap1的正常解離，從而降低Nrf2 mRNA的表達(dá)量[22]。本試驗(yàn)中，睪丸與附睪各組別間Nrf2 mRNA相對表達(dá)量均沒有顯著變化，但30%沙棘果渣添加組睪丸與附睪中Nrf2 mRNA表達(dá)量均有降低的趨勢，可能與其他抗氧化基因表達(dá)量降低有關(guān)，而其具體的機(jī)制需要更深層次的研究。

有報道指出，添加具有抗氧化性的物質(zhì)可以提高睪丸抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)。在灘羊日糧中添加不同劑量的維生素E可以顯著增加GPx3和GSTα1 mRNA和蛋白的表達(dá)[23]。而日糧中添加不同水平的葡萄皮渣可以不同程度的提高單欄飼養(yǎng)條件下公綿羊睪丸和附睪中CAT、Cu-ZnSOD、GPx4以及Nrf2蛋白的表達(dá)量[15]。本研究中，20%沙棘果渣添加組附睪頭Nrf2與附睪尾Cu-ZnSOD蛋白表達(dá)量顯著高于10%和30%沙棘果渣添加組，并且附睪尾中20%沙棘果渣添加組Cu-ZnSODmRNA的表達(dá)量顯著高于對照組和30%添加組，相較于10%沙棘果渣添加組有升高趨勢，與附睪尾中Cu-ZnSOD蛋白表達(dá)量變化基本一致。而其他蛋白表達(dá)量的變化并未與mRNA的表達(dá)量相一致，可能是由于在mRNA翻譯為蛋白的過程中存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等調(diào)控機(jī)制，其可能會促進(jìn)蛋白的表達(dá)，也可能會抑制蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致蛋白的表達(dá)量并不一定與mRNA的表達(dá)量相一致。綜合沙棘果渣對綿羊睪丸和附睪mRNA和蛋白表達(dá)量的影響，可以得出30%添加水平為過量添加。

4 結(jié)論

日糧中添加10%和20%沙棘果渣可以不同程度促進(jìn)公綿羊睪丸和附睪組織中抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，而添加30%沙棘果渣會降低睪丸GPx4、附睪頭Cu-ZnSOD和GPx4、附睪體CAT、附睪尾Cu-ZnSODmRNA以及附睪頭Nrf2和附睪尾Cu-ZnSOD蛋白的表達(dá)量。因此，25 kg杜泊×小尾寒羊雜交公羔日糧中30%沙棘果渣為過量添加水平。

[1]Patel C A,Divakar K,Santani D,et al.Remedial Prospective of Hippophae rhamnoides Linn. (Sea Buckthorn)[J].Isrn Pharmacology,2012:436857.

[2]Suryakumar G,Gupta A.Medicinal and therapeutic potential of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.)[J].Journal of Ethnopharmacology,2011,138(2):268-278.

[3]Geetha S,Ram M S,Mongia S S,et al.Evaluation of antioxidant activity of leaf extract of Seabuckthorn (Hippophae rhamnoides L.) on chromium(VI) induced oxidative stress in albino rats[J].Journal of Ethnopharmacology,2003,87(2):247-251.

[4]杜鵑,葛紅娟,王長文,等.沙棘對急性酒精攝入小鼠的睪丸組織酶活性及微量元素水平的影響[J].食品工業(yè)科技,2015,36(1):366-368.

[5]杜延萍,吳華,張輝,等.日糧中添加沙棘果渣對蛋雞生產(chǎn)性能及腸道菌群的影響[J].中國飼料,2014(15):35-36.

[6]李鳳鳴,王兵,趙烈武.日糧添加不同水平的沙棘果渣對肉仔雞生產(chǎn)性能與血清生化指標(biāo)的影響[J].中國飼料,2012(14):19-21.

[7]Nuernberg K,Nuernberg G,Priepke A,et al.Sea buckthorn pomace supplementation in the finishing diets of pigs-Are there effects on meat quality and muscle fatty acids?[J].2015,58(1):107-113.

[8]白生文,湯超,田京,等.沙棘果渣總黃酮提取工藝及抗氧化活性分析[J].食品科學(xué),2015,36(10):59-64.

[9]Varshneya C,Kant V,Mehta M.Total phenolic contents and free radical scavenging activities of different extracts of seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) pomace without seeds[J].International Journal of Food Sciences & Nutrition,2012,63(2):153-159.

[10]杜鵑,王琰,白雪松,等.沙棘對急性酒精攝入小鼠肝、腦抗氧化系統(tǒng)的影響[J].食品科技,2013(6):79-81.

[11]楊現(xiàn)艷,瞿偉菁,徐自良,等.沙棘籽渣黃酮對更年期大鼠血脂及體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的影響[J].中國中藥雜志,2006,31(13):1109-1112.

[12]王振宇,劉瑜,周麗萍.大果沙棘黃酮對糖尿病小鼠血脂與抗氧化水平的影響[J].食品科學(xué),2010,31(7):297-301.

[13]任有蛇,秦小偉,郭麗娜,等.日糧納米鋅水平對公羊睪丸和附睪Cu-ZnSOD表達(dá)的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2014,45(10):1622-1630.

[14]張建新,王茜,荀文娟,等.GPxs家族基因在山羊不同組織和睪丸不同發(fā)育時期的表達(dá)特性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2011,42(5):650-657.

[15]金亞倩,劉文忠,趙俊星,等.釀酒葡萄皮渣對單欄飼養(yǎng)方式下公綿羊繁殖性能及睪丸抗氧化性的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2016,47(11):2228-2239.

[16]Abarikwu S O,Pant A B,Farombi E O.Dietary antioxidant, quercetin, protects sertoli-germ cell coculture from atrazine-induced oxidative damage[J].Journal of Biochemical & Molecular Toxicology,2012,26(11):477-485.

[17]張彬,譚瓊,李麗立,等.金屬硫蛋白對奶牛血液抗氧化酶GSH-Px和CAT基因表達(dá)的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2010,19(3):132-138.

[18]黃晶,王桂蘭,劉志婷,等.復(fù)方沙棘提取液對老齡大鼠SOD mRNA表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2004,24(5):431-432.

[19]崔俁,馬海英,孔力.Nrf2/ARE通路與機(jī)體抗氧化機(jī)制的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011,37(1):187-190.

[20]鐘佳,劉進(jìn)輝,張珊珊,等.Keap1-Nrf2-ARE動物氧化應(yīng)激反應(yīng)信號通路與天然抗氧化產(chǎn)品開發(fā)[J].中國畜牧雜志,2016,52(5):79-83.

[21]Podder B,Kim Y S,Song H Y.Cytoprotective effect of bioactive sea buckthorn extract on paraquat-exposed A549 cells via induction of Nrf2 and its downstream genes[J].Molecular Medicine Reports,2013,8(6):1852-1860.

[22]劉榮,姜元松,辛越,等.山桃稠李果實(shí)花色苷對Nrf2/Keap1通路的影響[J].食品工業(yè)科技,2014,35(6):116-118.

[23]Xu C,Zuo Z,Liu K,et al.Transcriptome analysis of the Tan sheep testes:Differential expression of antioxidant enzyme-related genes and proteins in response to dietary vitamin E supplementation[J].Gene,2016,579(1):47-51.

(編輯：馬榮博)

Effectsofsupplementationofdifferentseabuckthornpomacelevelsonantioxidationintestisandepididymisofram

Han Xiaoqiang1, Zhang Chunxiang1, Zhang Wenjia2, Xiang Binwei2, Zhang Jianxin1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.AnimalHusbandryBureauofYouyuCounty，Youyu037200，China)

S826

A

1671-8151(2017)10-0733-10

2017-05-04

2017-06-29

韓曉強(qiáng)(1991-)，男(漢)，山西交城人，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)對繁殖性能影響

*通信作者：張建新，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:13935439778；E-mail: ypzjx@126.com

國家現(xiàn)代肉羊技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-39)