血清AMA-M2抗體在ALT異常人群的檢出率和診斷PBC的價(jià)值

陳 辰，張 瑋

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肝病科，上海 200030

血清AMA-M2抗體在ALT異常人群的檢出率和診斷PBC的價(jià)值

陳 辰，張 瑋

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肝病科，上海 200030

目的探究基于ALT異?；颊邫z測(cè)血清抗線粒體抗體M2亞型(anti mitochondrial antibody-M2, AMA-M2)在原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)的診斷價(jià)值及不同檢測(cè)方法診斷PBC的靈敏度和特異度。方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法或免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)ALT異常的7 887例患者血清中AMA-M2抗體。結(jié)果7 887例患者中診斷為PBC者共137例，男26例，女111例，男女之比為1∶4.3(P<0.05)。40～60歲患者AMA-M2陽(yáng)性率明顯高于其他年齡組(P<0.05)；4 801例患者同時(shí)使用了兩種檢測(cè)方法，ELISA法診斷PBC的敏感度較高(P<0.05)；Western blotting法診斷PBC的特異度較高(P<0.05)；ELISA法檢測(cè)的M2抗體低滴度患者伴r-GT升高者占56.52%，AKP升高者占21.73%。結(jié)論ELISA法和Western blotting法都是診斷PBC的有效特異性指標(biāo)，其中敏感度以ELISA法為優(yōu)，特異度以Western blotting法為優(yōu)。M2抗體低滴度陽(yáng)性可能與患者存在肝內(nèi)膽汁淤積相關(guān)；部分患者也可能是PBC潛在的危險(xiǎn)人群。

M2型抗線粒體抗體；原發(fā)性膽汁性肝硬化；敏感度；特異度

抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody,AMA)是原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)的標(biāo)志性抗體，包括M1～M9 9個(gè)亞型，其中M2為PBC特異性抗體。相關(guān)報(bào)道[1]表明，AMA-M2在PBC發(fā)病中有重要作用，其陽(yáng)性率為95%。Hu等[2]認(rèn)為，在診斷PBC時(shí)，AMA和AMA-M2均有較高的特異度和敏感度。Gulamhusein等[3]研究表明，80%的AMA抗體陽(yáng)性患者在平均5年之后，會(huì)發(fā)展成為PBC。本研究擬對(duì)肝功異常患者分別研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法與免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)患者血清中AMA-M2抗體，并對(duì)ELISA檢測(cè)AMA-M2陽(yáng)性但滴度值<100 RU/ml，不能確診為PBC患者的人群進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料收集上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院2013年2月-2015年6月肝功能異常的患者7 887例并對(duì)其進(jìn)行M2抗體篩查，分別采用ELISA 法和/或Western blotting法檢測(cè)AMA-M2抗體(見表1)，男2 707例，女5 180例，年齡(54.99±16.69)歲(24～90歲)。同時(shí)選取兩種方法檢測(cè)的患者4 801例，分別統(tǒng)計(jì)兩種檢測(cè)方法的敏感度和特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、診斷符合率，比較兩種檢測(cè)方法檢測(cè)AMA-M2對(duì)PBC的診斷效率，并分析AMA-M2低滴定度患者的臨床意義。

1.2PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年更新的膽汁淤積性肝病診斷治療專家共識(shí)[4]以下3項(xiàng)中2項(xiàng)符合即可確診：(1)存在膽汁淤積的生化學(xué)表現(xiàn)，主要為AKP水平升高。(2)特異性自身抗體 AMA滴度> 1∶100(國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn))，陽(yáng)性率超過(guò)90%；AMA對(duì)于診斷PBC的特異度超過(guò)95%；M2型AMA(抗PDC-E2)；特異度ANA：抗sp100或gp210抗體。(3)組織學(xué)改變：典型改變?yōu)榉腔撔云茐男阅懝苎准靶∪~間膽管破壞。

1.3方法和試劑

1.3.1 ELISA法檢測(cè)血清AMA-M2抗體：采用ELISA法(上?？菩鹿旧a(chǎn))對(duì)血清中的AMA-M2(德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司生產(chǎn))水平進(jìn)行檢測(cè)，按說(shuō)明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用四參數(shù)回歸法計(jì)算待測(cè)樣本濃度值，濃度值≥25 RU/ml為陽(yáng)性。

1.3.2 Western blotting法檢測(cè)血清AMA-M2抗體：采用Western blotting法進(jìn)行AMA-M2檢測(cè)，根據(jù)說(shuō)明書以半定量(+)為陽(yáng)性，判讀范圍為(+)、(++)、(+++)。DL1300-1601-3G抗肝抗原譜抗體IgG檢測(cè)試劑盒(Western blotting)。

2 結(jié)果

2.17887例患者AMA-M2檢測(cè)情況

2.1.1 7 887例患者檢測(cè)AMA-M2陽(yáng)性結(jié)果分析：7 887例患者中，5 740例采用ELISA法檢測(cè)AMA-M2，6 948例患者采用Western blotting檢測(cè)。4 801例患者同時(shí)采用兩種方法檢測(cè)，其中ELISA法檢測(cè)M2≥800 者106例，Western blotting檢測(cè)強(qiáng)陽(yáng)性者99例；ELISA法檢測(cè)100≤M2<800者 31例，Western blotting法檢測(cè)陽(yáng)性者26例；ELISA法檢測(cè)<100 者6例，Western blotting法檢測(cè)弱陽(yáng)性者3例。

表1137例PBC患者不同年齡和性別之間陽(yáng)性率分析

Tab1Theanalysisofthepositiverateof137PBCpatientsbetweendifferentagesandgender

年齡組(歲)樣本量男AMA-M2陽(yáng)性陽(yáng)性率(%)樣本量女AMA-M2陽(yáng)性陽(yáng)性率(%)樣本量總體AMA-M2陽(yáng)性陽(yáng)性率(%)18～3055600.00315110024110.1831～40905116.67198583.3370760.6641～50169549.765503790.241145412.4251～601221611.544844688.46737524.2661～702093317.656601482.351433170.8171～80872342.86241457.1463171.49>80545969.23259430.77286131.29總計(jì)78872618.98270711181.0251801371.74

圖1137例PBC患者的年齡與M2抗體滴度關(guān)系

Fig1TherelationshipbetweenagesandthetiterofM2antibodyinPBCpatients

2.1.2 確診的PBC患者一般情況分析：在137例確診的PBC患者中，兩種方法同時(shí)為陽(yáng)性者128例，ELISA法檢測(cè)M2陽(yáng)性(>100)而Western blotting法檢測(cè)法陰性且確診的6例，另gp210(+)確診的患者2例，sp100(+)確診的患者1例，其年齡和性別分層如下。

由表1可知，137例PBC患者男女陽(yáng)性率之比為1∶4.3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。40～60歲患者AMA-M2陽(yáng)性率明顯高于其他年齡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；男性患者>80歲者PBC發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同年齡段的PBC患者與M2抗體的滴度存在一定的相關(guān)性。其中40～60歲患者M(jìn)2抗體滴度高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

2.1.3 137例PBC患者疾病合并情況分析：7 887例患者，隱源性肝炎1 523例，其中PBC 99例(6.50%)；脂肪肝809例中PBC 4例；慢性乙型病毒性肝炎3 152例中PBC 11例；丙型病毒性肝炎132例中PBC 1例；肝炎后肝硬化788例中PBC 3例；肝惡性腫瘤894例中PBC 3例；其他自身免疫性疾病589例，合并PBC者包括干燥綜合征4例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎3例，潰瘍性結(jié)腸炎3例，硬皮病1例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡3例，甲狀腺疾病2例。

2.1.4 ELISA低滴度分析：ELISA法檢測(cè)0

2.2兩種方法檢測(cè)AMA-M2靈敏度和特異度分析ELISA法診斷PBC的敏感度較Western blotting法高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；Western blotting法診斷PBC的特異度較ELISA法高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05，見表2)。

表2兩種方法檢測(cè)AMA-M2靈敏度和特異度分析(%)

Tab2ThecomparisonoftwomethodsofdetectingthesensitivityandspecificityofAMA-M2(%)

方法敏感度特異度陽(yáng)性預(yù)測(cè)值陰性預(yù)測(cè)值診斷符合率ELISA法99.2790.2066.6799.8491.70Westernblotting法75.18*97.55*85.8395.2193.86

注：與ELISA法比較，*P<0.05。

3 討論

1965 年Walker等[5]首次采用間接免疫熒光法，發(fā)現(xiàn)PBC患者血清中存在一種物質(zhì)，經(jīng)鼠肝線粒體預(yù)處理后可阻斷這種間接免疫熒光反應(yīng)，證實(shí)該物是AMA。有研究[6]顯示，PBC患者血清中存在的抗AMA-M2靶抗原抗人丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2)的IgG抗體與 PBC的疾病進(jìn)展有很強(qiáng)相關(guān)性。在臨床工作中，臨床癥狀及血清生化以膽汁淤積表現(xiàn)為主，IgM、IgG水平升高，ANA和(或)SMA陽(yáng)性、AMA陰性患者，仍需考慮PBC的可能。且特異性抗體(sp100和gp210)有助于該病的診斷[7-8]。本研究中，除使用AMA-M2確診外，另有2例患者gp210(+)、1例患者sp100(+)而確診。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，高滴度(>1∶100或強(qiáng)陽(yáng)性)的AMA-M2是PBC的血清學(xué)指標(biāo)之一，在患者出現(xiàn)癥狀前幾年甚至幾十年就可以檢測(cè)到AMA的存在[9]，高滴度的AMA-M2診斷PBC的敏感度和特異度均達(dá)到90%以上。而低滴度(<1∶100或弱陽(yáng)性)AMA-M2診斷PBC的敏感度、特異度均較低。

我們對(duì)低滴度患者的肝功能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)r-GT升高者占總例數(shù)的56.52%，AKP升高者占21.73%，反映低滴度的M2陽(yáng)性與膽汁淤積有相關(guān)性，此部分患者可能是PBC潛在的危險(xiǎn)人群，建議定期復(fù)查，有助于PBC的早期診斷和治療[7]。

據(jù)報(bào)道，PBC在世界不同地區(qū)的流行率不同，呈北高南低趨勢(shì)。過(guò)去的10年里，在紐卡斯?fàn)?英國(guó)),美國(guó)北方地區(qū)、加拿大和中國(guó)南方等地區(qū)，PBC年發(fā)病率從31/100萬(wàn)增長(zhǎng)到492/100萬(wàn)[10-11]。該病以女性發(fā)病為主，男女比例為1∶8[12]。本次研究也證實(shí)了上述觀點(diǎn)，7 887例ALT 異?；颊咧须[源性肝炎占1 523例，其中診斷PBC患者共計(jì)99例，PBC在隱源性肝炎中的發(fā)病率6.50%。與我們之前的研究基本相符[13]。值得注意的是，男性病例的比例在增加，且年齡>80歲者PBC的發(fā)病率有所上升，與我們推測(cè)雄激素可能介導(dǎo)PBC的發(fā)病有關(guān)，由于此次研究PBC男性患者較少，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在其他肝病的患者中雖然PBC的合并發(fā)病率不高，但對(duì)疾病進(jìn)展有影響必須引起臨床重視，慢性肝病、肝硬化長(zhǎng)期GGT、AKP異常有必要做M2抗體檢測(cè)，以利早期發(fā)現(xiàn)合并PBC的可能，早期治療以穩(wěn)定患者病情，控制疾病進(jìn)展。

AMA-M2的主要檢測(cè)方法有：IIF法、ELISA法、Western blotting法，不同方法的敏感性和特異性不同。IIF法是檢測(cè)AMA-M2的經(jīng)典檢測(cè)方法，其結(jié)果判斷主要依賴于檢驗(yàn)人員的熟悉程度，尤其當(dāng)AMA滴度較低時(shí)容易造成漏診。Villalta等[14]采用ELISA法檢測(cè)PBC患者血清M2型抗線粒體抗體水平，其靈敏度高于IIF法。Lleo等[15]研發(fā)出新的ELISA，將MIT3混合物及純化的PDC組合作為靶抗原，檢測(cè)AMA的敏感性達(dá)到93.6%，遠(yuǎn)高于常規(guī)的檢測(cè)方法。提示ELISA法檢測(cè)AMA-M2不同水平對(duì)其診斷PBC進(jìn)一步量化有重要意義。ELISA法廣泛使用，AMA滴度是否與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，是否AMA陽(yáng)性者生化正常最終會(huì)發(fā)展為PBC仍有爭(zhēng)議[8]。

本研究中，ELISA法與Western blotting法檢測(cè)AMA-M2抗體陽(yáng)性結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，ELISA法較Western blotting法敏感度較高，Western blotting法較 ELISA 法特異度高。然而體外診斷試劑根據(jù)不同的應(yīng)用需要，在檢測(cè)靈敏度、特異度檢測(cè)性能會(huì)有所差異。設(shè)計(jì)用途為篩查型的檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品設(shè)計(jì)會(huì)選擇適當(dāng)檢測(cè)特異度而提高檢測(cè)靈敏度，設(shè)計(jì)用途為確認(rèn)型的檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品則會(huì)選擇適當(dāng)檢測(cè)靈敏度而提高檢測(cè)特異度。不同設(shè)計(jì)應(yīng)用途徑的產(chǎn)品在檢測(cè)性能上也會(huì)有所差異，這也是導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不一致的因素之一。應(yīng)當(dāng)以臨床PBC診斷或輔助診斷金標(biāo)準(zhǔn)作為參考對(duì)試劑的靈敏度與特異度進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)。而不同方法檢測(cè)AMA-M2水平的敏感度、特異度有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。隨著研究的不斷深入，方法的不斷改進(jìn)，更多抗體或針對(duì)靶抗原特異性表達(dá)的檢測(cè)手段應(yīng)用到臨床實(shí)踐工作中，這對(duì)于PBC發(fā)病機(jī)制的了解，以及臨床診斷有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

The positive incidence and diagnostic significance of AMA-M2in PBC of abnomal ALT

CHEN Chen, ZHANG Wei

Department of Hepatology, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200030, China

ObjectiveTo investigate the diagnostic significance of anti-mitochondrial antibodies-M2 (AMA-M2) for primary biliary cirrhosis (PBC) in physical examine, based on abnormal ALT.MethodsAMA-M2 of 7 887 patients with abnormal ALT was determined by enzyme-lined immunosorbent assay (ELISA) and Western blotting．ResultsOne hundred and thirty seven patients (26 males and 111 females) were diagnosed as PBC in the screening of 7 887 patients, the sex ratio was 1∶4.3 (P<0.05). AMA-M2 from 40 to 60 years old patients were significantly higher than other groups (P<0.05). Four thousand eight hundred and one patients used two kinds of detection methods at the same time. The sensitivity of diagnosis of PBC with ELISA was higher than Western blotting (P<0.05); the specificity of diagnosis PBC with Western blotting higher than ELISA (P<0.05); in the M2 low degree patients， γ- GT increased accounted for 56.52% and AKP increased accounted for 21.73% by ELISA.ConclusionELISA and Western blotting both are effective specific indicators in the diagnosis of PBC. ELISA has the better sensitivity but Western blotting has the better specificity. Patients with M2 low degree may have the symptoms of intrahepatic cholestasis, and some patients may be at-risk of PBC.

M2 anti-mitochondrial antibodies; Primary biliary cirrhosis; Sensitivity; Specificity

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.015

R575.2

：A

：1006-5709(2017)09-1022-04

：2016-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373860)

陳辰，在讀碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合肝病。 E-mail: 15221362775@163.com

張瑋，教授，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合肝病。 E-mail: 18918104444@189.cn