CD133、β-catenin和hTERT在胃癌及癌前病變中的表達及相關性研究

戚紅霞，潘曉燕

上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院 1.消化內科；2.病理科，上海 200435

CD133、β-catenin和hTERT在胃癌及癌前病變中的表達及相關性研究

戚紅霞1，潘曉燕2

上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院 1.消化內科；2.病理科，上海 200435

目的探究CD133、β-catenin和人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)在胃癌及癌前病變中表達的臨床意義及其相關性。方法收集上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院收治的60例胃癌標本、60例癌前病變標本和40例胃炎標本，采用免疫組化法檢測CD133、β-catenin和hTERT蛋白的表達情況，探究CD133、β-catenin和hTERT表達水平與臨床病理因素的關系，分析三者之間的相關性。結果在胃癌組織和癌前病變組織中，CD133、β-catenin和hTERT表達水平明顯增加，與胃炎組織相比，CD133、β-catenin和hTERT在胃癌和癌前病變組織中的表達差異有統計學意義(P<0.01)。與癌前病變組織相比，以上三種蛋白在胃癌組織中表達顯著上調，差異有統計學意義(P<0.01)。在癌前病變組織中，CD133、β-catenin和hTERT的表達與患者的臨床病理因素均無相關性，而在胃癌患者中，三者的表達與淋巴結轉移、分化程度和浸潤深度有關(P< 0.05)。另外，在胃癌中CD133、β-catenin和hTERT兩兩之間均呈正相關(P<0.05)。結論CD133、β-catenin和hTERT的協同高表達與胃癌的發(fā)生及癌前病變向胃癌的發(fā)展密切相關，其可能成為抑制癌前病變向胃癌轉化的關鍵因子。

胃癌；癌前病變；CD133；β-catenin；人端粒酶逆轉錄酶

胃癌是世界范圍內排名第二的惡性腫瘤，它的發(fā)生是一個涉及多基因改變的多步驟、多因素逐漸進展的過程。其死亡率高與胃癌細胞的侵襲能力強、轉移范圍廣等密切相關，研究[1-3]發(fā)現，胃癌的侵襲和轉移與多種因素有關，如肥胖、抑癌基因的表達異常等。早期胃癌多無癥狀，或僅有一些非特異性的消化道癥狀，僅憑臨床表現診斷早期胃癌十分困難[4]。癌前病變是腸型胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素，在發(fā)生惡性腫瘤之前常持續(xù)多年的演變，可為胃癌的早期檢測和治療提供依據[5-6]。因此，本研究采用免疫組化法檢測60例胃癌患者、60例胃癌前病變患者和40例胃炎患者中CD133、β-catenin和hTERT的表達情況，分析CD133、β-catenin和hTERT在胃癌癌前病變向胃癌方向發(fā)展過程中的作用，以期為胃癌的早期診斷提供新的指標，為胃癌早期治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2014年7月-2016年5月上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院手術切除并經病理診斷確診的胃癌標本60例，男39例，女21例，年齡(59.8±5.1)歲(45～79歲)；發(fā)生淋巴轉移26例，未發(fā)生淋巴轉移34例；浸潤深度為T1+T2的32例，T3+T4的28例；腺癌高-中分化39例、低分化21例。另取同期內鏡室活檢病理明確的60例癌前病變標本(慢性萎縮性胃炎伴有不完全大腸型化生或輕、重度不典型增生)，男37例，女23例，年齡(57.2±5.1)歲(30～82)歲。同時再取40例慢性非萎縮性胃炎標本，男24例，女16例，年齡(55.7±5.1)歲(35～76)歲，三組標本年齡、性別等基本資料相比，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法采用免疫組織化學法分別檢測三組CD133、β-catenin及hTERT蛋白表達情況，具體方法如下：所有標本均進行石蠟切片脫蠟，并使用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照，其中兔抗CD133和兔抗hTERT試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗β-catenin購自Abcam。且按照1∶100比例稀釋后進行。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用DAB顯色，蘇木精復染，待其脫水至透明后，應用顯微鏡進行觀察。

1.3免疫組化定量評價標準CD133結果判定：隨機選取4個不同高倍視野下200個細胞，陽性細胞百分率≥10%為CD133陽性；<10%為CD133陰性。β-catenin結果判定：免疫組化陽性表達信號為棕黃色細小顆粒狀，分別從細胞膜、細胞質、細胞核三方面判斷β-catenin在細胞內的分布特征：若<70%癌細胞細胞膜陽性表達或>10%癌細胞細胞質、細胞核陽性表達則取結果為陽性。而≥70%的細胞膜陽性表達且≤10%的細胞質、細胞核出現陽性表達為陰性。hTERT結果判定：隨機選取4個不同高倍視野下200個細胞，按照陽性染色細胞百分率分為0分：百分率<10%；1分：百分率10%～25%；2分：百分率25%～50%；3分：百分率>50%。此外，根據染色強度分為0分：無色；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。得分=染色范圍×染色強度。0～2分為陰性，得分>2分為陽性。

1.4統計學處理采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料用例數(%)表示，采用χ2檢驗；CD133、β-catenin和hTERT的表達與臨床病理因素的關系采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CD133、β-catenin和hTERT在胃癌組織、癌前病變組織和胃炎組織中的表達相比胃炎組織，在胃癌組織和癌前病變組織中CD133、β-catenin和hTERT蛋白表達量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。其中CD133主要位于癌細胞的胞膜上；β-catenin主要位于癌細胞的胞質中；hTERT則主要位于細胞核和細胞漿中。與癌前病變組織相比，以上三個蛋白在胃癌組織中表達也顯著上調，差異有統計學意義(P<0.01，見圖1、表1)。

表1CD133、β-catenin和hTERT在胃癌、癌前病變和胃炎組織中的表達分析[例數(%)]

Tab1ExpressionsofCD133,β-cateninandhTERTingastriccancer,precancerouslesionsandgastritistissue[n(%)]

分組例數陽性率CD133β-cateninhTERT胃炎組織407(17.50)6(15.00)4(10.00)癌前病變組織6036(60.00)*37(61.67)*19(31.67)*胃癌組織6049(81.67)*#44(73.33)*#37(61.67)*#

注：與胃炎組織比較，*P<0.01；與癌前病變組織比較，#P<0.01。

2.2胃癌癌前病變和胃癌中CD133、β-catenin和hTERT的表達與臨床病理因素的關系在癌前病變患者中CD133、β-catenin和hTERT的表達與患者的年齡、性別、淋巴結轉移、病理類型均無顯著的相關性(P>0.05，見表2)。在胃癌患者中CD133、β-catenin和hTERT的表達與腫瘤的淋巴結轉移、分化程度和浸潤深度有關(P<0.05，見表3)。

2.3CD133、β-catenin和hTERT在胃癌中的表達及相關性分析Spearman相關性分析結果顯示，在胃癌組織中，CD133與β-catenin蛋白表達水平呈顯著正相關(r=0.562，P=0.000)，β-catenin與hTERT蛋白表達水平呈顯著正相關(r=0.412，P=0.023)，CD133與hTERT蛋白表達水平呈顯著正相關(r=0.476，P=0.014)。

圖1CD133、β-catenin和hTERT在胃癌、癌前病變和胃炎組織中的表達(400×) A:胃炎組織； B：癌前病變組織； C：胃癌組織

Fig1ExpressionsofCD133,β-cateninandhTERTingastriccancer,precancerouslesionsandgastritis(400×) A: gastritis tissue; B: precancerous lesions tissue; C: gastric cancer tissue

表2CD133、β-catenin和hTERT在胃癌癌前病變組織中的表達及其與臨床病理因素的關系

Tab2TherelationshipoftheclinicopathologicalfactorswithexpressionsofCD133,β-cateninandhTERTinprecancerouslesionsofgastriccancer

臨床病理因素例數CD133陰性陽性χ2值P值β-catenin陰性陽性χ2值P值hTERT陰性陽性χ2值P值年齡(歲)0.2350.6280.7760.379?0.4230.235 <603313201122?2211 ≥602711161215?198性別0.4230.5152.3660.144?2.7610.101 男3716211720?2512 女23815617?167淋巴結轉移0.0240.8770.0460.783?1.5310.209 是83535?44 否5221312032?3715病理類型0.3850.5350.4170.419?0.1900.663 不完全大腸型化生5220321933?3517 輕、重度不典型增生84444?62

表3CD133、β-catenin和hTERT在胃癌組織中的表達及其與臨床病理因素的關系

Tab3TherelationshipoftheclinicopathologicalfactorswithexpressionsofCD133,β-cateninandhTERTingastriccancertissues

臨床病理因素例數CD133陰性陽性χ2值P值β-catenin陰性陽性χ2值P值hTERT陰性陽性χ2值P值年齡(歲)0.6900.4060.0020.969?0.2680.604 <6026620719?917 ≥6034529925?1420

續(xù)表3

臨床病理因素例數CD133陰性陽性χ2值P值β-catenin陰性陽性χ2值P值hTERT陰性陽性χ2值P值性別2.6970.0890.0150.897?1.4310.220 男3910291029?1326 女21120615?1011TNM分期1.0310.5971.7650.414?1.7900.671 Ⅰ26521818?917 Ⅱ23320419?914 Ⅲ113847?56淋巴結轉移3.4700.0494.4340.035?7.0830.008 是26224422?521 否349251222?1816分化程度3.9740.0461.7850.004?5.0830.024 高-中399301425?1920 低21219219?417浸潤深度4.3910.0364.1150.042?6.3470.012 T1+T2329231220?1715 T3+T428226424?622病理類型4.0420.1752.0910.871?4.7920.489 腺癌498411237?1831 黏液腺癌113847?56

3 討論

晚期胃癌的預后極差，5年生存率僅為10%～15%[7-8]，而早期胃癌5年生存率在90%以上[9]。但是，目前臨床上首次就診的胃癌患者中，胃癌早期診斷率低于10%，85%左右為中晚期[10]。造成這種狀況的原因很多，但缺乏特異、敏感的高危人群預警和早期診斷的生物學指標、方法是導致早癌發(fā)現困難的關鍵。不完全大腸型腸上皮化生和異型增生是胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要階段，被統稱為癌前病變，也是進行干預并防止胃癌發(fā)生的最有效的階段[11]。因此，尋找一種能在癌前病變階段或胃癌早期進行準確診斷的指標是提高胃癌患者臨床預后和生存率的關鍵。CD133早被認為是一種位于造血干細胞表面的早期抗原[12]。研究[13]發(fā)現，CD133可能是腫瘤干細胞表面特異性表達的分子，提示CD133極有可能成為治療腫瘤的一個有效的靶點。β-catenin屬連環(huán)素家族，其上調可以誘導Wnt靶基因激活，從而誘導腫瘤的發(fā)生[14]。hTERT是端粒酶的亞單位，為端粒酶活性的限制性組分，研究[15]發(fā)現，hTERT的異常表達與多種腫瘤密切相關。目前國內外尚未見CD133、β-catenin和hTERT三種因子聯合在胃癌和癌前病變組織的研究報道。

本研究發(fā)現，在胃癌組織和癌前病變組織中CD133、β-catenin和hTERT蛋白表達量明顯增加，與胃炎組織相比，CD133、β-catenin和hTERT在胃癌與癌前病變組織中的表達具有顯著性差異。與癌前病變組織相比，以上三種蛋白在胃癌組織中表達也顯著上調，差異也有統計學意義。提示CD133、β-catenin和hTERT的異常表達與胃癌有關，其也可能是胃癌癌前病變向胃癌發(fā)展過渡的關鍵因素。進一步分析以上蛋白的表達與胃癌癌前病變和胃癌臨床病理因素的關系可知，在癌前病變患者中，三者的表達與患者的臨床病理因素均無顯著的相關性，而在胃癌患者中，CD133、β-catenin和hTERT的表達與淋巴結轉移、分化程度和浸潤深度有關，這與以往關于CD133、β-catenin和hTERT在其他腫瘤中異常表達的特點相一致[16-17]，進一步提示CD133、β-catenin和hTERT的表達可能與胃癌癌前病變向胃癌方向的發(fā)展有關。也有研究[18-19]發(fā)現，CD133、β-catenin及β-catenin與hTERT之間存在功能上的相關性；三者又在胃癌中同時高表達，提示三者在胃癌中表達的相關性。據此，本實驗分析了CD133、β-catenin和hTERT在胃癌患者中表達的相互性，結果發(fā)現，在胃癌中CD133、β-catenin和hTERT三者兩兩之間均呈明顯的正相關，提示同時檢測CD133、β-catenin和hTERT可預測胃癌的發(fā)展。近年來，分子靶向治療是胃癌治療研究的熱點，本探究證實CD133、β-catenin和hTERT的異常表達與胃癌有關，提示CD133、β-catenin和hTERT是極具潛力的胃癌基因靶向治療的潛在靶點。

綜上所述，本研究證實，在胃癌和癌前病變中，CD133、β-catenin和hTERT表達均明顯上調，但還是存在顯著的差異，這可能與胃癌的發(fā)生及胃癌癌前病變向胃癌的發(fā)展有關。在胃癌中，三者的表達與淋巴結轉移、分化程度和浸潤深度有關，且CD133、β-catenin和hTERT 在胃癌中的高表達呈顯著正相關。提示CD133、β-catenin和hTERT的正向高表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關。本研究也有許多不足，比如涉及的病理標本相對較少，沒有探明CD133、β-catenin和hTERT在胃癌中異常表達的分子機制等，這將是本課題組后續(xù)的研究重點。

[1] Howard JM, Pidgeon GP, Reynolds JV. Leptin and gastro-intestinal malignancies [J]. Obes Rev, 2010, 11(12): 863-874.

[2] Calle EE, Rodriguez C, Walker-Thurmond K, et al. Overweight, obesity, and mortality from cancer in a prospectively studied cohort of U.S. adults [J]. N Engl J Med, 2003, 348(17): 1625-1638.

[3] Kodera Y, Fujitani K, Fukushima N, et al. Surgical resection of hepatic metastasis from gastric cancer: a review and new recommendation in the Japanese gastric cancer treatment guidelines [J]. Gastric Cancer, 2014, 17(2): 206-212.

[4] Yada T, Yokoi C, Uemura N. The current state of diagnosis and treatment for early gastric cancer [J]. Diagn Ther Endosc, 2013, 2013: 241320.

[5] Song H, Ekheden IG, Zheng Z, et al. Incidence of gastric cancer among patients with gastric precancerous lesions: observational cohort study in a low risk Western population [J]. BMJ, 2015, 351: h3867.

[6] den Hoed CM, Holster IL, Capelle LG, et al. Follow-up of premalignant lesions in patients at risk for progression to gastric cancer [J]. Endoscopy, 2013, 45(4): 249-256.

[7] Zhang J, Guo SB, Duan ZJ. Application of magnifying narrow-band imaging endoscopy for diagnosis of early gastric cancer and precancerous lesion [J]. BMC Gastroenterol, 2011, 11: 135.

[8] Paoletti X, Oba K, Burzykowski T, et al. Benefit of adjuvant chemotherapy for resectable gastric cancer: a meta-analysis [J]. JAMA, 2010, 303(17): 1729-1737.

[9] Peddanna N, Holt S, Venna RS. Genetics of gastric cancer [J]. Anticancer Res, 1995, 15(5B): 2055-2064.

[10] Fan YJ, Song X, Li JL, et al. Esophageal and gastric cardia cancers on 4238 Chinese patients residing in municipal and rural regions: a histopathological comparison during 24-year period [J]. World J Surg, 2008, 32(9): 1980-1988.

[11] Correa P, Piazuelo MB. The gastric precancerous cascade [J]. J Dig Dis, 2012, 13(1): 2-9.

[12] Irollo E, Pirozzi G. CD133: to be or not to be, is this the real question [J]. Am J Transl Res, 2013, 5(6): 563-581.

[13] Li Y, Xiao B, Tu SF, et al. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line [J]. Braz J Med Biol Res, 2012, 45(3): 197-204.

[14] Kidani T, Nakamura A, Kamei S, et al. Overexpression of cytoplasmic β-catenin inhibits the metastasis of the murine osteosarcoma cell line LM8 [J]. Cancer Cell Int, 2014, 14(1): 31.

[15] Killedar A, Stutz MD, Sobinoff AP, et al. A common cancer risk-associated allele in the hTERT locus encodes a dominant negative inhibitor of telomerase [J]. PLoS Genet, 2015, 11(6): e1005286.

[16] Shimozato O, Waraya M, Nakashima K, et al. Receptor-type protein tyrosine phosphatase directly dephosphorylates CD133 and regulates downstream AKT activation [J]. Oncogene, 2015, 34(15): 1949-1960.

[17] Abel EV, Simeone DM. Biology and clinical applications of pancreatic cancer stem cells [J]. Gastroenterology, 2013, 144(6): 1241-1248.

[18] Zhang Y, Toh L, Lau P, et al. Human telomerase reverse transcriptase (hTERT) is a novel target of the Wnt/β-catenin pathway in human cancer [J]. J Biol Chem, 2012, 287(39): 32494-32511.

[19] Rappa G, Fargeas CA, Le TT, et al. Letter to the editor: An intriguing relationship between lipid droplets, cholesterol-binding protein CD133 and Wnt/β-catenin signaling pathway in carcinogenesis [J]. Stem Cells, 2015, 33(4): 1366-1370.

(責任編輯：馬 軍)

Correlation study of CD133, β-catenin and hTERT expressions in gastric cancer and precancerous lesion

QI Hongxia1, PAN Xiaoyan2

1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Pathology, Jing’an District Shibei Hospital, Shanghai 200435, China

ObjectiveTo investigate the clinical significance and correlation of CD133, β-catenin and human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in gastric cancer and precancerous lesion.MethodsSixty cases of gastric cancer specimens, 60 cases of precancerous lesions and 40 cases of gastritis specimens were collected in Jing’an District Shibei Hospital. The expressions of CD133, β-catenin and hTERT were detected by immunohistochemical (IHC) method. The relationship of expressions of CD133, β-catenin and hTERT with clinicopathological factors were analyzed.ResultsCompared with gastritis tissues, the expressions of CD133, β-catenin and hTERT were significantly increased in gastric cancer tissues and precancerous lesions (P<0.01). Compared with the precancerous lesions, the expressions of the above three proteins in gastric cancer were also significantly increased, the difference was also statistically significant (P<0.01). The expressions of CD133, β-catenin and hTERT were not correlated with clinicopathological factors in precancerous lesions, but the expressions of the above three proteins were correlated with lymph node metastasis, differentiation and infiltration depth in gastric cancer (P<0.05). In addition, there were also positive correlations among CD133, β-catenin and hTERT in gastric cancer (P<0.05).ConclusionThe co-expressions of CD133, β-catenin and hTERT are closely related to the development of gastric cancer and transformation of precancerous lesions to gastric cancer, which may be key factors for inhibiting the transformation of precancerous lesions to gastric cancer.

Gastric cancer; Precancerous lesions; CD133; β-catenin; hTERT

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.006

R735.2

：A

：1006-5709(2017)09-0981-05

：2017-01-05

2014年上海市閘北區(qū)衛(wèi)生局級課題面上項目(2014MS04)

戚紅霞，副主任醫(yī)師，研究方向：擅長內鏡操作及治療。E-mail：rye@21cn.com