蘇州地區(qū)不同HCV基因型感染者對(duì)抗病毒治療的敏感性分析

朱曉燕，高媛媛，時(shí)翠林，徐俊馳，宋華峰，朱 捷，胥 萍

1.蘇州市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，江蘇 蘇州 215007; 2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部

蘇州地區(qū)不同HCV基因型感染者對(duì)抗病毒治療的敏感性分析

朱曉燕1，高媛媛2，時(shí)翠林1，徐俊馳1，宋華峰1，朱 捷1，胥 萍1

1.蘇州市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，江蘇 蘇州 215007; 2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部

目的調(diào)查丙型病毒性肝炎(hepatitis C virus, HCV)各基因型在蘇州地區(qū)的流行性，探討不同基因型HCV-RNA載量之間的差異，以及蘇州地區(qū)各基因型對(duì)于INF-2b聯(lián)合口服利巴韋林抗病毒治療的敏感性差異。方法收集144例HCV確診患者，采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)法檢測(cè)患者HCV-RNA的載量；使用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定AST及ALT；采用直接測(cè)序法分析HCV的各基因型及其亞型；根據(jù)用藥后HCV-RNA載量轉(zhuǎn)陰(或低于檢測(cè)限)所需的時(shí)間來判定治療的敏感性。結(jié)果144例HCV患者中，1b亞型占多數(shù)(70.14%)，2a亞型(20.14%)及3a亞型(9.72%)所占比例較低；不同基因型HCV患者性別、年齡、ALT及AST比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HCV-RNA載量1b亞型與2a亞型比較，2a亞型與3a亞型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而1b亞型載量明顯高于3a亞型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1b型快速病毒學(xué)應(yīng)答(rapid virological response, RVR)比例較低，早期病毒學(xué)應(yīng)答(early virological response, EVR)、持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response, SVR)及無應(yīng)答(no response, NR)的比例較高；而2a亞型及3a亞型對(duì)藥物應(yīng)答的敏感性則相反，RVR比例較高，EVR、SVR及NR的比例較低。結(jié)論目前1b亞型是蘇州地區(qū)丙型肝炎的主要基因亞型，緊隨其后的是2a亞型和3a亞型，另外還有極少數(shù)的其他基因型。對(duì)HCV基因分型的了解有助于預(yù)估療程的長(zhǎng)短和患者對(duì)藥物的敏感性，是評(píng)估患者治療的一項(xiàng)重要因素。

丙型病毒性肝炎；基因分型；抗病毒治療；敏感性

丙型病毒性肝炎(hepatitis C virus, HCV)傳播途徑主要是吸毒和輸血[1]等。目前，HCV在全球范圍內(nèi)均有分布，感染慢性HCV的人數(shù)為1.7億～2億[2]，嚴(yán)重者可能會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(hepatitis cell cancer, HCC)[3]。目前已成為當(dāng)今嚴(yán)重的社會(huì)問題及公共衛(wèi)生方面的問題[4-5]。目前，HCV主要分為6個(gè)基因型，以及五十多個(gè)不同的亞型[6]。了解HCV的基因分型與治療敏感性的關(guān)系可以對(duì)臨床上實(shí)施個(gè)體化抗病毒治療方案提供幫助，從而從整體上提高HCV患者的臨床治愈率[7-8]。為此，本研究收集2014年1月-2016年2月在蘇州市第五人民醫(yī)院收治的HCV患者的基因型、主要肝功能指標(biāo)，以及患者的HCV-RNA載量，分析其之間的關(guān)系，為患者抗病毒治療的難易程度及制定個(gè)體化方案提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集2014年1月-2016年2月蘇州市第五人民醫(yī)院收治入院的HCV患者144例，男67例，女77例，平均年齡(41.712)歲，所有病例均確診為單純丙肝病毒感染，慢性丙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)修訂的《丙型肝炎防治指南》[9]?；颊呔驮\期間均接受肌肉注射INF-α-2b聯(lián)合口服利巴韋林的抗病毒治療，排除有禁忌證及無法堅(jiān)持治療者。

1.2標(biāo)本采集患者抽取靜脈血至少5 ml，收集于無菌管中，靜置時(shí)間不超過4 h，室溫下離心5～8 min分離血清(3 000 r/min)，離心半徑r=13.5 cm，用于HCV-RNA、肝功能及丙肝基因型的檢測(cè)。

1.3HCV-RNA載量的測(cè)定采用湖南圣湘生物科技公司提供的HCV核酸定量檢測(cè)試劑盒提取HCV-RNA，采用RT-PCR熒光探針法檢測(cè)，使用儀器為ABI7300。

1.4丙肝病毒的基因分型檢測(cè)檢測(cè)方法采用直接測(cè)序法，具體送至南京艾迪康第三檢測(cè)方檢測(cè)。

1.5ALT及AST的檢測(cè)采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，試劑來自湖南圣湘生物科技公司。

1.6HCV患者抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答的分類(1)快速病毒學(xué)應(yīng)答(RVR)：持續(xù)4周的抗病毒治療后患者血清中HCV-RNA載量為陰性(或低于檢測(cè)下限)；(2)早期完全病毒學(xué)應(yīng)答(EVR)：持續(xù)12周的抗病毒治療后患者血清中HCV-RNA載量為陰性(或低于檢測(cè)下限)；(3)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)：治療時(shí)程達(dá)標(biāo)(一般是24周，也可以是48周或72周)時(shí)，HCV-RNA載量為陰性(或低于檢測(cè)下限)；(4)無病毒學(xué)應(yīng)答(NR)：治療時(shí)程達(dá)標(biāo)后，HCV-RNA載量檢測(cè)結(jié)果仍然為陽性(或大于檢測(cè)下限)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同基因型患者血清HCV-RNA載量取對(duì)數(shù)后采用單因素方差分析，1b亞型與非1b亞型HCV-RNA載量、ALT和AST水平比較采用t檢驗(yàn)，HCV基因型在性別上的分布差異采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)，HCV基因型抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答差異用行×列表的χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1蘇州地區(qū)丙肝病毒的基因分型情況分析

2.1.1 基因型分布：144例HCV患者中主要基因分型是1b、2a、3a，1b亞型者101例(70.14%)，2a亞型29例(20.14%)，3a亞型14例(9.72%)。

2.1.2 不同性別基因分型情況：1b亞型與2a亞型比較(χ2=0.60)，1b亞型與3a亞型比較(χ2=0.94)，2a亞型與3a亞型比較(χ2=0.13)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1HCV不同性別基因分型[例數(shù)(%)]

Tab1TheHCVgenotypesofgender[n(%)]

基因型例數(shù)男女1b10151(50.50)50(49.50)2a2917(58.62)12(41.38)3a149(64.29)5(35.71)

2.1.3 HCV患者不同年齡基因分型情況：HCV患者中≤45歲者69例(47.9%)，>45歲者75例(52.1%)。1b亞型與2a亞型比較(χ2=0.53)，1b亞型與3a亞型比較(χ2=0.03)，2a亞型與3a亞型比較(χ2=0.10)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表2HCV各年齡段的基因分型[例數(shù)(%)]

Tab2TheHCVgenotypesofdifferentage[n(%)]

基因型例數(shù)≤45歲>45歲1b10150(49.50)51(50.50)2a2913(44.83)16(55.17)3a146(42.86)8(57.14)

2.2丙肝病毒基因分型與肝功能的關(guān)系不同基因型HCV患者主要肝功能指標(biāo)(ALT、AST)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1～圖2)。

2.3不同丙肝基因型患者HCV-RNA載量分析如圖3所示，將HCV-RNA的載量以對(duì)數(shù)形式表示，各基因型之間HCV-RNA定量結(jié)果的比較運(yùn)用t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示，1b亞型與2a亞型比較，2a亞型與3a亞型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而1b亞型載量明顯高于3a亞型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 不同丙肝基因型AST分析 Fig 1 AST analysis of different HCV genotypes

圖2 不同丙肝基因型ALT分析 Fig 2 ALT analysis of different HCV genotypes

圖3 不同基因型HCV-RNA載量Fig 3 HCV-RNA of different HCV genotypes

2.4丙肝病毒基因分型與抗病毒治療敏感性之間的關(guān)系根據(jù)應(yīng)用抗病毒藥物治療后應(yīng)答時(shí)間的長(zhǎng)短，不同基因型各自的治療轉(zhuǎn)歸分期比例見表3。1b型RVR比例較低，EVR、SVR及NR的比例較高；而2a及3a亞型的敏感性比例相反，RVR比例較高，EVR、SVR及NR的比例較低。HCV病毒的基因分型與患者的抗病毒治療療效差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3HCV不同基因型的治療敏感性[例數(shù)(%)]

Tab3ThesensitivityofdifferentHCVgenotypes[n(%)]

基因型例數(shù)RVREVRSVRNR1b10122(21.78)33(32.67)32(31.68)14(13.86)2a2912(41.38)13(44.83)3(10.34)1(3.45)3a146(42.86)2(14.29)3(21.43)3(21.43)

3 討論

目前，丙肝病毒有不同的基因分型，各基因分型之間有67%的核苷酸序列可供識(shí)別。全球最新的11個(gè)基因型和100個(gè)以上的丙肝病毒亞型存在不同的地理分布[7]。我國的丙肝基因分型主要包括6種，以及五十多個(gè)不同的亞型[8-9]。本文中即采用直接測(cè)序法分析了2014年1月-2016年2月144例蘇州地區(qū)的慢性HCV患者，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，1b亞型、2a亞型及3a亞型是本地區(qū)內(nèi)的主要基因亞型，其中1b亞型最多，這與我國主要流行的趨勢(shì)相一致，另外還有少量的其他型病例及極個(gè)別的混合型病例，由于受樣本量的限制，本篇論文暫不做討論。

患者的丙肝基因分型與患者性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果與張鳳馳等[10]研究結(jié)果相一致。同時(shí)，本文還分析了不同年齡階段基因型的分布，發(fā)現(xiàn)不同年齡基因分型的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，經(jīng)主要肝功能指標(biāo)ALT及AST檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，患者的丙肝基因分型與患者的肝功能損傷程度無顯著相關(guān)性，此結(jié)果與張紅梅等[11]研究結(jié)果一致，認(rèn)為肝病嚴(yán)重程度與基因型無關(guān)。

經(jīng)分析，HCV-RNA在不同基因型中的分布，3種基因型HCV-RNA載量1b型含量最高，2a型次之，3a型含量最低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)1b亞型與2a亞型、2a亞型與3a亞型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1b亞型HCV-RNA載量明顯高于3a亞型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明不同基因分型HCV感染與血液中HCV的病毒濃度相關(guān)，基因1b型患者HCV-RNA濃度高于非1b型患者，這同大多數(shù)研究結(jié)果相符[12-15]。

現(xiàn)階段，肌注干擾素和口服利巴韋林的治療依然是國內(nèi)對(duì)于HCV感染者治療的主要方案，本文中納入的HCV患者經(jīng)上述治療方案后應(yīng)答時(shí)間的長(zhǎng)短，將不同基因型各自的治療轉(zhuǎn)歸分期比例進(jìn)行比較，得出1b型RVR比例較低，EVR、SVR及NR的比例較高；而2a及3a亞型對(duì)藥物的敏感性則相反，RVR比例較高，EVR、SVR及NR的比例較低，將其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)丙肝病毒的基因分型與患者的抗病毒治療療效差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)論與多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致[11,16]，提示不同的基因型對(duì)抗病毒藥物的敏感性不同。此外，有學(xué)者認(rèn)為HCV基因分型不僅與抗病毒藥物的療效相關(guān)，而且與肝臟組織的病理損傷相關(guān)[17]。

本文中納入的標(biāo)本量存在一定的局限性，特別是在蘇州地區(qū)分布較少的2a及3a亞型。為提高基因型HCV感染者對(duì)藥物治療敏感性的統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確性，有待此項(xiàng)目開展時(shí)間更久，擴(kuò)大樣本量和基因的分型種類，以減少因樣本量導(dǎo)致的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Analysis of the sensitivity of antiviral therapy in different genotypes of HCV infection in Soochow

ZHU Xiaoyan1, GAO Yuanyuan2, SHI Cuilin1, XU Junchi1, SONG Huafeng1, ZHU Jie1, XU Ping1

1.Department of Clinical Laboratory, the Fifth People’s Hospital of Suzhou, Soochow 215007; 2.Medical College of Soochow University, China

ObjectiveTo investigate the epidemicity of different hepatitis C virus (HCV) genotypes in Soochow, and to expose the difference of HCV-RNA load among different genotypes, and to analyze the difference of the sensitivity of polyethylene glycol interferon (INF-2b) and ribavirin combination antiretroviral treatment among different HCV genotypes in Soochow.MethodsOne hundred and forty-four patients diagnosed as HCV were collected, the HCV-RNA load was detected by the method of polymerase chain reaction (PCR), the ALT and AST were detected by automatic biochemical analyzer, the HCV genotype and subgenotype were analyzed by direct gene sequencing method. The sensetivity was classified according to the time spending in waiting HCV-RNA load to become negative (or below the limit of detection sensitivity) during antiviral therapy.ResultsIn the 144 patients, the majority was subgenotype 1b (70.14%), subgenotype 2a (20.14%) and subgenotype 3a (9.72%) shared low proportion. Among different HCV genotypes, there were no significant differences in many aspects, such as ALT, AST, sex and age. Neither the subgenotype 1b and subgenotype 2a had statistical significance in HCV-RNA, nor the subgenotype 2a and subgenotype 3a. But there was significant difference of HCV-RNA load between subgenotype 1b and subgenotype 3a. Patients with subgenotype 1b had lower chance to acquire rapid virological response (RVR) and higher chance to acquire early virological response (EVR), sustained virological response (SVR) and no response (NR); compared with subgenotype 1b, patients with subgenotype 2a and subgenotype 3a had higher chance to achieve EVR and lower chance to achieve EVR, SVR and NR.ConclusionSubgenotype 1b is the mainly genotype in Soochow, followed by subgenotype 2a and subgenotype 3a.

Hepatitis C virus; Gene type; Antiviral therapy; Sensitivity

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.016

R512.6+3

：A

：1006-5709(2017)09-1026-04

：2016-11-03

蘇州科技計(jì)劃項(xiàng)目(SYS201433)；蘇州市感染免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(SZS201006)

朱曉燕，主管技師，研究方向：感染免疫學(xué)。E-mail：zhuxiaoyan1482@163.com

胥萍，碩士研究生，主任技師，研究方向：感染免疫學(xué)。E-mail：573311485@qq.com