EGCG對氧化誘導的心肌細胞凋亡的保護作用研究

楊睿+董卓+王夢琪

[摘要] 目的 探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對氧化應激誘導的大鼠H9C2凋亡的細胞保護作用及機制。方法 H9C2細胞傳代培養(yǎng)后進行隨機分組。陰性對照組（正常培養(yǎng)液培養(yǎng)），H2O2損傷組（100 μmol/L H2O2作用12 h），EGCG低濃度組（10 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h），EGCG高濃度組（100 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h）。MTT比色法檢測細胞活力，Hochest33258染色觀察凋亡細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，比色法檢測凋亡相關因子Caspses-3及Caspase-9的表達。 結果 10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG作用于H9C2細胞后，細胞存活率分別提高到66.68%和78.63%，與H2O2損傷組（57.33%）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；Hoechst33258染色及流式細胞技術結果顯示，不同濃度的EGCG作用于H9C2細胞后，細胞凋亡率逐漸下降，與氧化損傷組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；此外，EGCG能夠有效抑制H9C2細胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9的表達。 結論 EGCG通過抑制Caspses-3及Caspase-9的表達有效抑制了H9C2細胞的氧化損傷，從而為其用于治療心肌細胞損傷提供可靠的實驗依據(jù)。

[關鍵詞] 表沒食子兒茶素沒食子酸酯；H9C2細胞；Caspses-3；Caspase-9；凋亡

[中圖分類號] R54 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0034-04

[Abstract] Objective To discuss the protective effects and possible mechanisms of epigallocatechin gallate （EGCG） in oxidative damage of rat H9C2 cells induced by oxidative stress. Methods H9C2 cells were random grouped after subcultured. There were negative control group （cultured with normal nutrient solution）， H2O2 injury group （incubated with 100 μmol/L H2O2 for 12 h）， EGCG low dose group （incubated with 10 μmol/L EGCG for 24 h then cultured with 100 μmol/L H2O2 for 12 h） and EGCG high dose group （incubated with 100 μmol/L EGCG for 24 h then cultured with 100 μmol/L H2O2 for 12 h）. Cell viability were tested by MTT colorimetric detection， apoptotic cell morphology was observed by Hochest33258 staining， apoptosis rate was detected by flow cytometry， expression of apoptosis-related factors Caspses-3 and Caspase-9 were tested by colorimetric detection. Results The cell survival rate increased to 66.68% and 78.63% after treated with 10 μmol/L and 100 μmol/L EGCG compared with H2O2 injury group （57.33%）， with statistically significant difference （P < 0.05）. Hoechst33258 dying and flow cytometry technology results showed that cell apoptosis rate dropped gradually after treated with different concentration of EGCG with H2O2 injury group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Besides， the expression of Caspase-3 and Caspase-9 were inhibited after treated with EGCG. Conclusion EGCG effective inhibit H9C2 cells oxidative damage by inhibiting the expression of Caspses-3 and Caspase-9， which provide reliable experimental basis for the treatment of injuries in myocardial cells.

[Key words] Epigallocatechin gallate； H9C2 cells； Caspses-3； Caspase-9； Apoptosis

人體的許多疾病都與細胞的氧化損傷和凋亡密切相關，其中，氧化應激損傷誘導的心肌細胞凋亡與心肌缺血、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等多種疾病的發(fā)生有關[1-4]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是從天然植物綠茶中提取的一種兒茶素單體。EGCG具有很強的抗氧化能力，長期飲用綠茶可以明顯改善心肌細胞功能，降低心肌的缺血再灌注損傷[5-6]。本研究通過在培養(yǎng)基中加入外源性活性氧H2O2誘導鼠H9C2心肌細胞凋亡，探索EGCG對氧化應激引起細胞凋亡保護作用及機制。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠H9C2心肌細胞株（中國科學院上海細胞庫），EGCG（分子量：458.37832，純度≥99%，購自美國Sigma公司，批號50299），DMEM培養(yǎng)基（Sigma公司，批號D0819），30% H2O2（天津基準化學試劑有限公司，批號20131016），CCK-8試劑盒（廣州研創(chuàng)生物技術發(fā)展有限公司，批號C0038），Hoechst33258試劑盒（南京碧波生物科技有限公司，批號BA50），Annexin V FITC/PI（美國BD公司，批號556570），Caspase-3、Caspase-9試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號G015、G018）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H9C2細胞培養(yǎng)在100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含15%胎牛血清，培養(yǎng)箱溫度為37℃。

1.2.2 實驗分組 H9C2細胞接種于96孔板后進行分組。①陰性對照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；②H2O2損傷組：將培養(yǎng)融合狀態(tài)達到80%的H9C2細胞每孔加入100 μmol/L H2O2作用12 h；③EGCG低濃度組：10 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h；④EGCG高濃度組：100 μmol/L EGCG孵育24 h后，加入H2O2作用12 h。

1.2.3 CCK-8法測定細胞活力 H9C2細胞培養(yǎng)于96孔板中，隨機分為4組。細胞接種于96孔板（細胞密度5×104/mL，每孔120 μL），按上述分組方法培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)結束后棄培養(yǎng)液，PBS沖洗細胞，每個培養(yǎng)孔按1∶10比例加入CCK-8液，孵育4 h，酶標儀測定492 nm的吸光度值。每組設3復孔，取平均值。

1.2.4 Hoechst33258核染色檢測細胞凋亡 各組H9C2細胞六孔板內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過相應處理后，PBS沖洗3次并在空氣中干燥，每孔加入5 g/L的Hoechst33258染色液1 mL，室溫下于暗室內(nèi)固定20 min，吸掉染色液后空氣中干燥，于倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞形態(tài)（400×）?；罴毎示鶆虻{色熒光，凋亡細胞的細胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，熒光顯微鏡下可見濃染致密的顆粒狀熒光，呈亮藍色熒光。

1.2.5 Annexin V-FITC染色流式細胞技術細胞凋亡檢測 各組H9C2細胞六孔板內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過相應處理后，用0.1%胰酶消化后制備細胞懸液。1000 r/min離心（離心半徑500 mm） 20 min后收集細胞，用Annexin V-FITC試劑盒中binding buffer懸浮細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為5×104/mL，分別加入Annexin和PI，混勻后用流式細胞儀檢測細胞凋亡，以上操作均在暗室內(nèi)避光進行。

1.2.6 Caspase活性檢測 胰酶消化后收集細胞，1200 r/min離心（離心半徑500 mm）10 min，PBS沖洗2次后加入30 μL細胞裂解液，置于冰上低溫孵育20 min，3000 r/min離心10 min，按試劑盒說明書，進行Caspase活性檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EGCG對H9C2細胞存活率的影響

通過用CCK-8法進行EGCG對H9C2細胞活性分析，發(fā)現(xiàn)H2O2損傷組H9C2細胞經(jīng)氧化損傷處理后，細胞存活率明顯下降，加入10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG后細胞存活率分別提高到66.68%和78.63%，與H2O2損傷組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 EGCG對H2O2誘導H9C2細胞凋亡的影響

Hoechst33258染色法是一種檢查凋亡細胞數(shù)量的形態(tài)學染色方法，陰性對照組見正常細胞核呈均勻的藍黑色彌散低熒光，未見明顯凋亡染色的細胞核，H2O2損傷組見散在的亮藍色類圓形高熒光，為凋亡的細胞核；給予10 μmol/L及100 μmol/L的EGCG作用后，亮藍色細胞核數(shù)量減少，證明凋亡細胞數(shù)量逐漸減少。見圖1（封三）。

2.3 EGCG對H9C2細胞凋亡的抑制作用

流式細胞技術結果顯示，H2O2誘導H9C2細胞發(fā)生凋亡，H2O2損傷組細胞凋亡率顯著高于陰性對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。結果表明H2O2可以導致H9C2細胞凋亡的發(fā)生，經(jīng)10 μmol/L及100 μmol/L EGCG處理后，其凋亡率分別下降至（23.23±3.29）%和（16.23±1.94）%，與H2O2損傷組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2。

2.4 EGCG對H9C2細胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9活性的影響

H2O2可以誘導H9C2細胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9表達增加，EGCG能夠有效抑制H9C2細胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9的表達，進而抑制凋亡反應的發(fā)生。經(jīng)10 μmol/L及100 μmol/L EGCG處理后，H9C2細胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9活性均下降，與H2O2損傷組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表2。

3 討論

細胞的氧化損傷與凋亡反應互相影響，互相關聯(lián)[7-8]。當體內(nèi)活性氧升高并打破機體平衡時，大量生成的自由基對機體細胞產(chǎn)生毒性作用，誘導細胞凋亡[9-10]。大量證據(jù)表明，氧化應激損傷與多種心血管疾病的發(fā)生密切相關[11-13]。過量的活性氧可直接攻擊細胞膜及細胞器影響細胞的正常生理功能。endprint

CCK-8法是一種常用的檢測細胞生長存活的方法。本研究利用100 μmol/L H2O2建立細胞氧化損傷模型，檢測結果顯示，H2O2 可以引起H9C2細胞存活率下降，EGCG能夠劑量依賴性的抑制H2O2誘導的細胞損傷。Hoechst33258核染色法是一種快速簡單的檢測貼壁生長細胞的凋亡染色方法，正常未發(fā)生凋亡的細胞核呈均勻的藍黑色彌散低熒光，凋亡細胞的胞膜通透性發(fā)生改變，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒狀高熒光。本實驗中的凋亡染色結果同樣表明，EGCG有效抑制了H2O2誘導的凋亡反應的發(fā)生。流式細胞技術通過定量分析凋亡細胞比例檢測細胞凋亡率，本實驗中的流式細胞技術進一步驗證了CCK-8及Hoechst33258核染色法結果。

EGCG天然無毒，其抗氧化活性是維生素E的20倍，使其具有了較強的藥用價值，將其作為藥物應用于人體，具有很高的安全性[14-15]。國內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實EGCG在清除體內(nèi)自由基、抗炎、抗衰老、抑制細胞凋亡方面有一定作用[16-17]。本實驗的研究結果進一步證實了EGCG對H9C2細胞氧化損傷的保護作用。

細胞代謝過程中會不斷生成氧化代謝產(chǎn)物，當細胞活性下降或者細胞功能受損時，氧化代謝產(chǎn)物會在細胞內(nèi)聚集進一步引起細胞結構破壞。這些積累性氧化損傷是導致的心肌細胞凋亡是心肌病變發(fā)生的一個重要原因[18]。細胞凋亡由Caspase家族的蛋白酶介導，對維持生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。Caspase-3和Caspase-9是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶[19-20]。本研究結果顯示，100 μmol/L H2O2作用于H9C2細胞后，Caspase-3及Caspase-9的表達量均明顯上升，EGCG有效抑制了Caspase-3及Caspase-9的表達，提示EGCG可能通過減少凋亡因子的表達發(fā)揮細胞保護作用。

綜上所述，EGCG可在體外發(fā)揮較好的抗心肌細胞氧化損傷所導致的凋亡作用，并且能通過調(diào)控凋亡相關蛋白來保護心肌細胞。

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（收稿日期：2017-05-17 本文編輯：李岳澤）endprint