基于乳酸-LDH的牦牛肉NADH線粒體介導再生研究

張玉斌 李丙子 雷 蕓 魏紅艷 韓 鋆 余群力

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院， 蘭州 730070; 2.蘭州文理學院化工學院， 蘭州 730000)

0 引言

牦牛獨特的高海拔生長環(huán)境和較長的飼養(yǎng)周期使屠宰后的肉色表現(xiàn)出比普通牛肉更暗、消費者更不易接受的深紅色，且在冷藏成熟過程中往往伴隨著肉色劣變[1-2]。牛肉冷藏和零售過程中的色澤穩(wěn)定性至關(guān)重要[3]。有研究表明，乳酸鹽注射增強技術(shù)可有效控制有氧貯藏期間冷卻肉的褪色[4-5]。乳酸-LDH體系會促進煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的再生，從而使MetMb的還原能力提高，改善貨架期肉色[6]，但具體還原機理尚不明晰。因此，有必要基于乳酸-LDH體系對牦牛肉色澤穩(wěn)定性進行系統(tǒng)研究。

有研究證實，屠宰后的肌肉是有生物化學活性的，并且其有能力通過向被氧化的三價鐵肌紅蛋白(Mb)增加一個電子來還原高鐵肌紅蛋白(MetMb)。參與MetMb還原的電子來自NADH或線粒體介導的電子轉(zhuǎn)移[7-8]。在添加了特定的底物后，NADH可以通過在宰后肌肉細胞質(zhì)[9]中的LDH(cLDH)或線粒體中的LDH(mLDH)再生[10]，說明NADH的宰后再生對于延緩肉色劣變至關(guān)重要。在分離出的牛心肌線粒體中，添加乳酸鹽、LDH和NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài))后產(chǎn)生NADH，這可能是導致耗氧量同時增加的原因[11]，NADH可以進入復合物I(NADH脫氫酶)并導致電子傳遞鏈中的電子運動。但目前尚無法確定NADH通過乳酸鹽-LDH-NAD途徑形成后能否被骨骼肌線粒體用于MetMb還原。文獻[12]認為，肉類劣變與肌肉線粒體酶活性的關(guān)系比與線粒體含量的關(guān)系更大，利用TCA(三羧酸循環(huán))循環(huán)酶(脫氫酶類)的底物，有助于在宰后骨骼肌中再生還原NADH。文獻[13]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠骨骼肌和心肌中分離出來的線粒體具有不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以適應(yīng)每個組織的特定功能。這些研究表明，線粒體在肉色穩(wěn)定中起著重要的作用。

目前，關(guān)于線粒體電子傳遞鏈(ETC)與高鐵肌紅蛋白還原和肉色穩(wěn)定性的體外孵化研究幾乎沒有得出確定的結(jié)論。此外，由線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)中間代謝物誘導引起的NADH再生過程，通過區(qū)分如蘋果酸脫氫酶(MDH)和LDH等酶類，進而可以調(diào)節(jié)MetMb還原、影響Mb氧化還原穩(wěn)定性，這方面的報道也很少。在線粒體和細胞質(zhì)之間，由MDH或LDH活性造成的NADH再生在肉色穩(wěn)定性方面可能起到重要作用。因此，本文假設(shè)在LDH中產(chǎn)生的NADH具有改善Mb氧化還原穩(wěn)定性的潛力，將分離提取出的線粒體和牦牛背最長肌Mb作為研究對象，探究乳酸-LDH模型中乳酸鹽對牦牛肉色穩(wěn)定性的影響，以及肌肉線粒體在ETC中NADH再生和MetMb還原能力，并對體外模型的研究結(jié)果進行驗證，以期為延緩牦牛肉色澤劣變、保持冷藏期間肉色穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預處理

試驗牦牛肉樣品由甘肅天瑪生態(tài)食品科技股份有限公司提供。選取36～48月齡、生長發(fā)育良好、健康無病的甘南牦牛6頭，屠宰后立即對胴體進行熱蒸汽減菌處理，取左胴體背最長肌，剔除表面結(jié)締組織，避光、真空包裝后置于冰盒運送回實驗室，將運回實驗室的樣品分為兩份，第1份分成4份，在0～4℃條件下分別冷藏1、3、5、7 d，用于測定線粒體膜通透性、膜電位；第2份在24 h內(nèi)進行肌紅蛋白的分離純化，用于體外孵化試驗。

1.2 設(shè)備與試劑

TGL-24M型臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)、JY92-IIDN型超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)、SP-756P型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)、AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、抗霉素A(南京森貝伽生物科技有限公司)、K3[Fe(CN)6](上海源葉生物科技有限公司)、NAD(上海源葉生物科技有限公司)、NADH(上海源葉生物科技有限公司)、草氨酸鈉(上海源葉生物科技有限公司)、乳酸脫氫酶(美國Sigma公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1線粒體提取

參照文獻[14]的方法提取線粒體。切取適量肉樣，用冷藏(4℃)生理鹽水洗去表面殘血，濾紙吸干后迅速切碎，稱取10 g切碎樣品，加入100 mL分離液(250 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，pH值 7.4)，在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下勻漿2 min，然后1 500g、4℃離心 15 min，上清液再次在12 000g、4℃條件下離心20 min，沉淀用分離液清洗兩次后溶于緩沖液(250 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.4)即為線粒體懸浮液(詹納斯綠B染色鑒定線粒體)。全程低溫操作，以上過程均在0～4℃條件下完成。

1.3.2線粒體膜通透性

參照文獻[15]的方法測定線粒體膜通透性，測定已制備好的線粒體懸浮液在520 nm波長下的吸光度，依據(jù)吸光度的變化來判定線粒體膜通透性的改變。如果溶液在520 nm 處吸光度A520降低，表明線粒體膜通透性增加，反之則表明線粒體膜通透性降低。

1.3.3線粒體膜電位

采用試劑盒測定。線粒體提取試劑盒來自上海索萊寶科技有限公司，線粒體膜電位檢測試劑盒(以JC-1為熒光探針)來自北京泛博生物化學有限公司。

線粒體提取試劑盒用于從動物組織中分離出完整而純化的線粒體。肉樣通過冰浴研磨后，添加試劑盒所提供的試劑進行幾次離心沉淀后得到重懸線粒體沉淀，立即使用或-70℃保存。熒光探針JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；膜電位較低時，JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降。將0.9 mL 5倍稀釋的JC-1染色工作液加入0.1 mL純化的線粒體中，孵育20 min，立即用熒光分光光度計檢測。加測JC-1單體時激發(fā)光波長設(shè)置為490 nm，發(fā)射光波長設(shè)置為530 nm；檢測JC-1聚合物時激發(fā)光波長設(shè)置為525 nm，發(fā)射光波長設(shè)置為590 nm。

1.3.4牦牛背最長肌Mb的分離純化

參照文獻[16]的方法稍加改進。取切碎后的肉樣100 g，在4℃預冷的300 mL提取液(含1 mmol/L EDTA、10 mmol/L pH值 8.0 Tris-HCl、25 g/L Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚))中混合，在低溫高速冷凍離心機中13 000 r/min均質(zhì)30 s，取出勻漿液，將其在9 500g、4℃下離心10 min，取上清液，用濾紙過濾后得到Mb粗提液。采用硫酸銨溶液對粗提液進行分級沉淀，飽和度梯度由65%至95%，然后4℃條件下3 000g離心10 min后棄去上清液，將沉淀物在5 mmol/L pH值8.5的Tris-HCl緩沖液中溶解。用提前預冷至4℃的相同緩沖液透析10 h，透析液每隔1 h換一次，透析結(jié)束后在4℃下5 000g離心10 min，得到Mb初級純化液。接下來的精細純化采用Sephadex G-100型凝膠層析分離柱進行。收集540 nm波長下吸光度較高的蛋白溶液，參照文獻[17]的方法對分離得到的Mb進行光譜特性和SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定，如表1所示。

表1 SDS-PAGE電泳凝膠各組分質(zhì)量分數(shù)Tab.1 Formula of SDS-PAGE gel %

1.3.5牦牛背最長肌MetMb制備

參照文獻[16]的方法稍作調(diào)整。取1.3.4節(jié)中分離純化的Mb溶液5 mL，添加K3[Fe(CN)6]50 mg反應(yīng)10 min即得到MetMb溶液。上述反應(yīng)結(jié)束后，溶液在3 500g、4℃條件下離心10 min，上清液中多余的Na2S2O4和K3[Fe(CN)6]采用提前預冷至4℃的50 mmol/L、pH 值7.0的Tris-HCl緩沖液透析除去。MetMb溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配，并用Tris-HCl緩沖液按照試驗要求調(diào)整溶液中蛋白的濃度。

1.3.6線粒體對MetMb還原的影響

參照文獻[18]的方法在340 nm處測定吸光度，提取的牦牛背最長肌線粒體(3 mg/mL)與處理好的MetMb(2.5 mg/mL)結(jié)合的基礎(chǔ)上添加NAD、乳酸鈣、乳酸鈣-NAD、乳酸鈣-LDH-NAD或乳酸鈣-LDH-NAD(在加入乳酸鈣-LDH-NAD體系之前，線粒體首先和抗霉素A預孵化10 min)。對照組樣品只由線粒體(MT)和MetMb組成，不添加乳酸鈣或乳酸-LDH-NAD。反應(yīng)組分的濃度為乳酸鈣40 mmol/L，LDH(100活性單位)40 mmol/L，NAD 0.2 mmol/L，所有樣品都裝在帶蓋密封的旋口瓶中，以免外部氧氣進入線粒體-高鐵肌紅蛋白反應(yīng)混合物。各處理組具體情況如表2所示。

表2 添加到牦牛背最長肌線粒體(MT)和MetMb中的不同組合Tab.2 Treatment combinations added to bovine skeletal mitochondria (MT) and myoglobin

注：LLN代表CaL+LDH+NAD；AA代表抗霉素A；SO代表草氨酸鈉；“+”表示底物/抑制劑存在，“-”表示不存在。

MetMb(2.5 mg/mL)還原是在pH值 5.6的緩沖液(120 mmol/L KCl，30 mmol/L KH2PO4，30 mmol/L順丁烯二酸)中使用石英比色皿持續(xù)3 min，然后樣品在4℃下孵育10 h。在孵育期間的特定時間點(0、4、8、12 h)，取出樣品并用離心機以10 800 r/min離心5 min，得到的上清液用分光光度計在500～650 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，采用文獻[19]的方法計算氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白的含量。

1.3.7氧消耗速率的測定

參照文獻[20]的方法并略作修改。樣品耗氧率利用Clark型氧電極進行測量。在 25℃下校正Oxytherm型液相氧電極，用連二亞硫酸鈉(高濃度)校正零氧基線，現(xiàn)用現(xiàn)配，然后用去離子水清洗反應(yīng)室6次以上。再用反應(yīng)緩沖液沖洗幾次，向反應(yīng)室加入2 mL氧飽和的緩沖液，蓋好反應(yīng)室蓋子(保持密閉，以免外界氧氣進入反應(yīng)室)。開啟轉(zhuǎn)子，開始記錄氧含量，等待2 min使氧含量平穩(wěn)。取提取的線粒體及反應(yīng)物質(zhì)加入反應(yīng)室，立即計時，記錄5 min內(nèi)的呼吸速率，即樣品的OCR值。測量溫度分別保持在4℃以及25℃，即得到肌肉組織在兩種不同溫度下的氧消耗速率。對照樣品只有線粒體和高鐵肌紅蛋白，沒有添加底物或抗霉素A。為了評價復合物Ⅲ(泛醌+細胞色素c氧化還原酶)抑制劑對線粒體呼吸作用的效果，線粒體和抗霉素A提前預孵化2 min，其他沒有添加抗霉素A的處理組，添加等量的乙醇，其次添加底物，計算氧消耗速率。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件(美國IBM公司)進行試驗數(shù)據(jù)處理，顯著性差異(P<0.05)通過LSD法進行比較分析。采用Origin 8.0軟件進行圖形繪制。試驗中所有測定做3次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鈣處理對線粒體膜通透性的影響

圖1(圖中不同字母表示同種處理冷藏時間內(nèi)差異顯著(P<0.05)，下同)為線粒體膜通透性的變化趨勢，從圖1可以看出，隨著冷藏時間的延長，線粒體膜通透性呈現(xiàn)下降的趨勢，且1～3 d下降緩慢，從第5天開始下降速度加快，冷藏結(jié)束與開始具有極顯著的差異性(P<0.05)。線粒體結(jié)構(gòu)損傷的表現(xiàn)之一就是膜通透性的變化，雙層膜通透性轉(zhuǎn)換孔增大，膜的流動性改變，導致其失去對線粒體內(nèi)部與細胞液中物質(zhì)交換的調(diào)控能力。在520 nm波長下吸光度的下降表明線粒體發(fā)生腫脹，同時，線粒體內(nèi)部小分子物質(zhì)向外釋放的過程引起了滲透壓的變化，從而升高基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度，促使線粒體大面積發(fā)生腫脹。線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開啟能夠引起線粒體膜通透性的改變，因此通過測定線粒體膜通透性能有效反映線粒體膜的損傷情況。膜通透性增大可直接導致其內(nèi)部的生理環(huán)境急劇變化，進而造成其生理功能損傷，最終可能對其還原MetMb的能力造成一定的影響。

圖1 成熟過程中牛肉線粒體膜通透性的變化Fig.1 Changes in mitochondria membrane permeability of beef during aging

2.2 乳酸鈣處理對線粒體膜電位的影響

由圖2可知，在冷藏期間線粒體的膜電位呈現(xiàn)出逐漸下降趨勢，1～3 d下降緩慢，5～7 d下降較快。乳酸鈣處理與對照組在第7天時線粒體膜電位分別為0.59 mV和0.47 mV，與第1天相比分別下降了52.03%和60.50%。在冷藏結(jié)束時線粒體膜電位降到最低，這與線粒體膜通透性的變化趨勢相似，表明MPTP的大量開啟能引起線粒體膜通透性的改變，從而造成線粒體內(nèi)分子質(zhì)量低于1.5 ku的溶質(zhì)通透性突劇增，使得膜電位下降瓦解。

圖2 成熟過程中乳酸鈣處理對牛肉線粒體膜電位的影響Fig.2 Effects on mitochondrial membrane potential activity of beef during aging

2.3 體外乳酸鹽對氧消耗速率的影響

在典型的肉品指標pH值5.6、4℃條件下，與沒有添加底物的線粒體組相比，添加了乳酸鈣的處理組氧消耗速率有所增加(P<0.05)，而LLN組的樣品氧消耗速率在所有的試驗組中是最高的(P<0.05)。這也與之前的一些研究報道的結(jié)果一致，即在生理指標pH值7.4條件下，利用從老鼠骨骼肌和牛心肌中分離出來的線粒體，有能力使用乳酸作為氧氣消耗的底物，由LDH活性形成的NADH可以被用于電子傳遞和還原酶介導的MetMb還原[21]。

2.4 體外乳酸鹽對NADH形成的影響

沒有添加底物的線粒體對照組和添加了乳酸鈣的處理組并沒有導致NADH的生成，但CaL-LDH-NAD組合的處理組340 nm處的吸光度增加，這說明NADH的生成能夠被電子傳遞鏈的復合物Ⅰ所利用?？姑顾谹處理組在340 nm處的吸光度比對照組的顯著增加(P<0.05)，這說明抗霉素A并沒有明顯阻止NADH的生成，這與本研究中抗霉素A處理后耗氧量顯著降低的變化情況不一致，可能是由于乳酸-LDH-NAD形成的NADH被用于酶促的高鐵肌紅蛋白還原，而不是線粒體氧消耗，因為抗霉素A抑制了電子傳遞鏈的復合物Ⅲ[22]。

2.5 體外乳酸鹽對線粒體-高鐵肌紅蛋白還原的影響

圖3 乳酸-LDH-NAD體系體外孵化模型中線粒體介導的電子傳遞對MetMb還原的影響Fig.3 Effects of lactate-LDH-NAD on electron transport linked mitochondria-mediated metmyoglobin reduction in vitro

由圖3可以看出，當不添加乳酸鹽等底物時，體系內(nèi)的Mb氧化還原狀態(tài)幾乎未發(fā)生改變(P>0.05)。這說明由LDH形成的NADH不能在沒有還原酶或電子載體的情況下還原MetMb[23]，與對照組相比，添加乳酸鈣到MetMb和線粒體的組合中后對MetMb的還原也有一定的影響(P<0.05)?？姑顾谹組顯著降低了與CaL-LDH-NAD相關(guān)的MetMb還原(P<0.05)，和其它所有處理組相比，添加到分離的線粒體中的CaL+LDH+NAD體系引起的MetMb還原在所有的試驗組中是最高的(P<0.05)。說明當宰后NADH再生時，由CaL-LDH相互作用產(chǎn)生的NADH可以用于ETC介導的非酶促或酶促反應(yīng)下的MetMb還原。

3 討論

線粒體膜通透性的變化是用來衡量線粒體結(jié)構(gòu)變化以及功能損傷的一個重要指標[24]，主要以提取線粒體懸浮液在520 nm波長下的吸光度變化來判斷線粒體膜通透性的變化。線粒體膜通透性改變是線粒體結(jié)構(gòu)損傷的標志，會引起膜流動性、跨膜電位、膜蛋白構(gòu)象變化等現(xiàn)象，而線粒體中電子傳遞、氧化磷酸化等重要的生化反應(yīng)均發(fā)生在線粒體膜中，線粒體膜的損傷勢必導致線粒體的生理功能衰退[25-26]。具體表現(xiàn)為線粒體膜通透性的增大、線粒體形狀、大小改變以及線粒體數(shù)目減少，導致的生理損傷主要表現(xiàn)為線粒體標志酶活性的喪失、代謝產(chǎn)物濃度降低和氧消耗速率的減小[27]。文獻[8]研究了用琥珀酸鹽作為底物的電子傳遞鏈介導的MetMb還原。將琥珀酸鹽添加到分離提取出的線粒體后，通過復合物Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)進入電子傳遞鏈，從而使MetMb還原。在添加琥珀酸后，線粒體介導的MetMb還原在宰后45 d內(nèi)仍然保持活躍。這一觀點支持了琥珀酸鹽和乳酸鹽等底物在電子傳遞鏈介導的MetMb還原過程中的作用。在本研究中，添加乳酸鈣或者CaL+LDH+NAD組合體系都不同程度地增加了線粒體介導的氧消耗速率和MetMb還原。

文獻[28]研究發(fā)現(xiàn)，電子傳遞鏈介導的MetMb還原發(fā)生在較低的氧分壓下，這是由氧消耗增加所致。本研究中，與沒有添加底物的線粒體組相比，添加了乳酸鈣的處理組氧消耗速率有所增加(P<0.05)，和線粒體結(jié)合的LLN組的樣品氧消耗速率在所有的試驗組中是最高的(P<0.05)。CaL-LDH-NAD體系增加了耗氧量，創(chuàng)造了一個氧分壓以支持電子傳遞鏈中電子的可用性。這些電子能夠通過在線粒體中存在的電子載體來減少Mb的氧化。降低分壓有助于MetMb還原。文獻[29]的研究結(jié)果表明MetMb的還原是在NADH直接添加到線粒體后。文獻[30]報道了在絞碎的羊肉半膜肌直接添加NADH可以增加耗氧量，宰后肉的耗氧量取決于NADH的水平。因此，CaL+LDH+NAD系統(tǒng)增加MetMb還原和氧消耗的能力可能是由于NADH的形成，這一點在本研究中通過在340 nm處的吸光度增加也得到了證實。

有些特異性的抑制劑能夠使MetMb還原更有效的電子位點，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)異戊巴比妥、普羅黃素、抗霉素A、阿霉素、雙香豆素等的抑制位點[31]。抗霉素A對幾乎所有生物的線粒體呼吸鏈都有抑制作用，通過作用于細胞色素c將有限的電子傳遞給三價鐵Mb[32]。在乳酸鹽的氧化過程中，由ETC產(chǎn)生的電子是導致MetMb還原的原因。Mb作為一種肌漿蛋白，其分子過大不能穿過線粒體外膜，因此，需要一個電子傳遞介質(zhì)將電子從ETC轉(zhuǎn)移到MetMb。細胞色素c是一種能將電子從線粒體復合物Ⅲ轉(zhuǎn)移到復合物Ⅳ(細胞色素c氧化酶)，并可釋放到膜間隙中的功能蛋白質(zhì)[33]。細胞色素c被認為是在胞質(zhì)NADH的有氧氧化過程中在線粒體內(nèi)、外膜之間的電子穿梭體[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，預孵育之后的線粒體與抗霉素A組顯著降低了與CaL-LDH-NAD相關(guān)的耗氧量，同時顯著降低了與CaL-LDH-NAD相關(guān)的MetMb還原，說明抗霉素A能特異性地阻斷電子傳遞鏈的復合物Ⅲ，阻止電子從細胞色素b傳遞到細胞色素c，只能通過細胞色素c傳遞有限的電子給三價鐵Mb，抑制了MetMb還原。至于牦牛肉在冷藏過程中體內(nèi)的MetMb還原是否也是這一途徑還需要進一步研究。

4 結(jié)論

(1)抗霉素A能特異性地阻斷線粒體電子傳遞鏈的復合物Ⅲ，阻止電子從細胞色素b傳遞到細胞色素c，顯著降低與CaL-LDH-NAD相關(guān)的耗氧量及MetMb還原能力，但并未明顯阻止NADH的生成。NADH可以通過充當電子傳遞鏈的復合物Ⅰ的底物,進而啟動氧消耗，CaL-LDH-NAD體系增加了NADH依賴的還原酶活性。

(2)添加LDH抑制劑草氨酸鈉可以降低CaL-LDH-NAD體系對MetMb的還原，但卻并未完全抑制MetMb還原，說明除了電子傳遞鏈介導的非酶促還原外，CaL-LDH-NAD體系產(chǎn)生的NADH也可用于線粒體內(nèi)的酶促MetMb還原。

(3)由乳酸-乳酸脫氫酶體系產(chǎn)生的NADH將導致線粒體氧消耗和MetMb向氧合肌紅蛋白的轉(zhuǎn)化。因此，當乳酸鹽(CaL)底物存在時，線粒體有能力再生出相應(yīng)的還原物，這些還原能力可以影響氧消耗、MetMb還原以及Mb氧化還原狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，進而起到穩(wěn)定牦牛肉色澤的作用。