基于宏基因組的青海農(nóng)用沼氣池微生物組成和功能分析

韓 睿 陳來(lái)生 李全輝 李 屹 鐘啟文 朱德銳

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西寧 810016；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心， 西寧 810016)

0 引言

發(fā)展沼氣是一種極具應(yīng)用前景、可解決農(nóng)村能源供應(yīng)問(wèn)題和環(huán)保問(wèn)題，以及實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑[1]。溫度是制約沼氣發(fā)酵效率的關(guān)鍵因素之一[2-3]。青海省自2003年實(shí)施農(nóng)村沼氣能源建設(shè)項(xiàng)目以來(lái)，在開(kāi)發(fā)和建設(shè)方面取得了一定成效，但受溫度的影響，絕大多數(shù)沼氣池存在產(chǎn)氣量少、產(chǎn)氣率低、運(yùn)行狀況差和利用效率低等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了沼氣的推廣普及[4]。為解決此問(wèn)題，沼氣用戶曾采用覆蓋塑料薄膜、畜禽舍下建造沼氣池及池體進(jìn)出口加蓋等措施給沼氣池升溫和保溫，但仍不能增加產(chǎn)氣量和提高利用率，無(wú)法滿足農(nóng)戶基本需求，亟需開(kāi)發(fā)出針對(duì)沼氣發(fā)酵工藝的新技術(shù)。高效穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng)是沼氣池穩(wěn)定運(yùn)行和提高沼氣產(chǎn)氣率的保證。文獻(xiàn)[5]研究顯示，小容量沼氣池中不同底物對(duì)微生物群落分布變化及甲烷產(chǎn)生具有影響；文獻(xiàn)[6]對(duì)沼氣生產(chǎn)過(guò)程中微生物群落的原位活動(dòng)及多樣性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Thermotogae和Spirochaetes菌群有活性糖基代謝功能，F(xiàn)usobacteria和Cloacimonetes菌群有活性氨基酸基代謝功能；文獻(xiàn)[7]對(duì)生物沼氣池的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果表明，產(chǎn)甲烷的代謝途徑中多含有酸化酶、水解酶、醋酸化酶和產(chǎn)甲烷酶的微生物菌群，認(rèn)為后期生產(chǎn)中可以通過(guò)對(duì)微生物群落的監(jiān)控實(shí)現(xiàn)優(yōu)化生產(chǎn)。因此，深入解析沼氣發(fā)酵過(guò)程中微生物的群落組成以及群落的功能、發(fā)掘新的重要微生物功能類(lèi)群、優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)并調(diào)節(jié)應(yīng)用，是解決青海沼氣池產(chǎn)氣量少、產(chǎn)氣率低、運(yùn)行狀況差和利用效率低等問(wèn)題的有效途徑。

絕大多數(shù)沼氣發(fā)酵微生物難以培養(yǎng)，無(wú)法采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法研究微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝關(guān)系。宏基因組技術(shù)是以環(huán)境中所有微生物基因組DNA為研究對(duì)象，利用分子與信息技術(shù)系統(tǒng)研究微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)以及微生物-環(huán)境的互作關(guān)系[8]。該技術(shù)無(wú)需進(jìn)行繁瑣的常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，有效降低了實(shí)驗(yàn)偏差。同時(shí)，從微生物群落結(jié)構(gòu)水平上，宏基因組技術(shù)可全面認(rèn)識(shí)微生物的生態(tài)特征和功能，尤其是涉及各種復(fù)雜環(huán)境的微生物群落的鑒定[9-14]。迄今為止，針對(duì)高海拔、高寒地區(qū)農(nóng)用沼氣池微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究報(bào)道較少，尚缺乏足夠的理論參考依據(jù)。本文借助Illumina HiSeq 3000高通量測(cè)序技術(shù)，獲得青海省典型農(nóng)用沼氣池污泥樣品的宏基因組數(shù)據(jù)，對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)和潛在的功能類(lèi)群進(jìn)行系統(tǒng)分析，旨在為后續(xù)改進(jìn)青海沼氣發(fā)酵工藝、提高沼氣利用效率和實(shí)現(xiàn)沼氣發(fā)酵的穩(wěn)定運(yùn)行提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 農(nóng)用沼氣池

沼氣池選自青海省樂(lè)都縣蒲臺(tái)鄉(xiāng)李家臺(tái)村(36°21′14″N，102°27′22″E)。該村為青海省沼氣池普及和推廣效果較好的地區(qū)之一，池容積為8 m3，采用“一池三改”的模式。選取投料、進(jìn)出料狀況及管護(hù)情況基本一致，且運(yùn)行穩(wěn)定的2戶沼氣池為研究對(duì)象。其中一戶沼氣池產(chǎn)氣好，全年產(chǎn)氣不中斷，保證農(nóng)戶的三餐需求，為青海極少數(shù)沼氣池的典型代表(記為L(zhǎng)D-G)；另一戶沼氣池產(chǎn)氣差，全年僅5—10月使用(11月至翌年4月基本無(wú)法使用)，為青海絕大多數(shù)的沼氣池代表之一(記為L(zhǎng)D-B)。2戶投料均為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%～90%豬糞+質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～20%人糞。

1.2 樣品采集

前期研究表明，青海農(nóng)用沼氣池產(chǎn)氣量與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)[4,15]。分別采集上述2戶全年溫度最高時(shí)期(9月上旬，即全年月平均產(chǎn)氣量最高)和最低時(shí)期(3月中旬，即全年月平均產(chǎn)氣量最低)的污泥樣品進(jìn)行分析。編號(hào)如下：LD-G溫度最高和最低時(shí)期的樣品分別記為L(zhǎng)D-GH和LD-GL，LD-B則分別記為L(zhǎng)D-BH和LD-BL。所有樣品均來(lái)自沼氣池底部，采集后4℃封存，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即對(duì)樣品進(jìn)行處理。采集LD-GH、LD-GL、LD-BH和LD-BL樣品的發(fā)酵溫度分別為15.9、5.7、12.3、3.1℃。

1.3 宏基因組DNA的提取和檢測(cè)

沼氣池污泥樣品的基因組DNA采用Qiagen公司的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit進(jìn)行提取，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在所有DNA樣本送交測(cè)序公司前，均經(jīng)過(guò)NanoDrop2000型超微量分光光度計(jì)檢查DNA的含量及純度。要求樣品質(zhì)量濃度大于10 ng/μL，樣品總質(zhì)量大于500 ng，樣品純度(OD260/280)介于1.8～2.0之間。

1.4 宏基因組測(cè)序及基因預(yù)測(cè)分析

采用Illumina HiSeq 3000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)分別經(jīng)拼接、過(guò)濾、質(zhì)量剪切等優(yōu)化處理，得到的reads用于操作分類(lèi)和功能分析；各reads經(jīng)IDBA-UD (http:∥i.cs.hku.hk/～alse/hkubrg/projects/idba_ud/)軟件組裝成contigs后，利用MetaGene (http:∥metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，并利用cd-hit算法比較相似性獲得聚類(lèi)后的基因序列。選擇核酸長(zhǎng)度大于等于100bp的基因，并將其翻譯為氨基酸序列。

1.5 物種分析與功能分析

使用BLASTP (BLASTVersion 2.2.28+，http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將基因集序列分別與NR數(shù)據(jù)庫(kù)(Amino acid sequence of non-redundant protein，非冗余蛋白質(zhì)的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù))、eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)(evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups，http:∥eggnog.embl.de/)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http:∥www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行比對(duì)，即可分別獲得物種、COG功能和KEGG 功能注釋。比對(duì)參數(shù)e-value 均設(shè)置為1×10-5。

2 結(jié)果與討論

2.1 農(nóng)用沼氣池宏基因組數(shù)據(jù)分析與基因預(yù)測(cè)

由表1可知，宏基因組測(cè)序得到的原始序列經(jīng)過(guò)堿基質(zhì)量動(dòng)態(tài)去除處理和長(zhǎng)度篩選，并經(jīng)pair-end信息修正后(表1)，青海農(nóng)用沼氣池4個(gè)樣品共獲得2.29億的reads用于操作分類(lèi)和功能分析。微生物宏基因組共獲得2 604 356條組裝序列(contigs)。

表1 組裝及基因預(yù)測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of metagenome assembly and predicted genes

2.2 農(nóng)用沼氣池微生物群落組成

根據(jù)宏基因組序列分析，共得到4域83門(mén)158綱364目674科2 299屬10 632種。由表2可知，在域分類(lèi)水平上，所有樣品中相對(duì)豐度最大的均是細(xì)菌，相對(duì)豐度為56.41%～86.03%，其次為古菌，相對(duì)豐度為3.91%～4.31%。細(xì)菌與古菌的總相對(duì)豐度為60.32%～90.34%，說(shuō)明細(xì)菌和古菌是青海農(nóng)用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中的主要微生物類(lèi)群。病毒和真核生物含量較低，相對(duì)豐度分別為0.07%～0.11%和0.12%～0.16%。所有樣品還包含分類(lèi)地位尚未明確的微生物類(lèi)群，相對(duì)豐度為9.42%～39.45%，與現(xiàn)有生物數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列無(wú)相關(guān)性，也說(shuō)明青海農(nóng)用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中生物多樣性豐富。綜合分析細(xì)菌和古菌的相對(duì)豐度，同一時(shí)期產(chǎn)氣好的樣品微生物豐度占比均大于產(chǎn)氣差的樣品，即LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL。另外，在各樣品中病毒均存在，雖然豐度偏低，但可能參與維持沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)的平衡，也可能會(huì)對(duì)系統(tǒng)中底物降解的效果產(chǎn)生一定影響[16]。因此，青海農(nóng)用沼氣池污泥樣品中的病毒類(lèi)群值得后續(xù)深入研究。

2.3 細(xì)菌的群落組成

圖1顯示了青海農(nóng)用沼氣池各樣品中細(xì)菌在門(mén)和屬分類(lèi)水平上的物種組成情況，其中其他類(lèi)群組(others)表示分別將相對(duì)豐度小于1%的門(mén)類(lèi)和屬類(lèi)合并后得到的物種類(lèi)別。由圖1a可知，青海農(nóng)用沼氣池4個(gè)樣品共計(jì)注釋門(mén)分類(lèi)13個(gè)。所有樣品之中，優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)群依次為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)，總相對(duì)豐度(72.37%～74.00%)趨向恒定。通常，上述的3種菌類(lèi)群是沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，在水解大分子物質(zhì)、產(chǎn)酸等方面發(fā)揮著重要的作用[17-19]。此外，互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)的相對(duì)豐度偏低(1.62%～4.73%)，在4個(gè)樣品中呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化，產(chǎn)氣好的樣品高于產(chǎn)氣差的樣品，即LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL，此與沼氣產(chǎn)氣的變化規(guī)律相一致，可能是青海農(nóng)用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中重要的產(chǎn)氣功能類(lèi)群?；ヰB(yǎng)菌門(mén)中的所有物種均為嚴(yán)格厭氧菌，廣泛分布于胃腸道、污水處理系統(tǒng)、土壤、口腔、厭氧污泥消化器等各種環(huán)境中，所占相對(duì)豐度較低。早期研究表明其是積極參與厭氧污泥消化的核心細(xì)菌類(lèi)群之一[20-21]，可以降解丙酸、丁酸等小分子物質(zhì)，并能與產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行互營(yíng)代謝[22-24]。文獻(xiàn)[25]在選育耐低溫產(chǎn)沼氣菌群的過(guò)程中，獲得一組產(chǎn)沼氣菌群5號(hào)，將其用厭氧污水馴化后獲得另一組菌群Y5S。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)比較分析產(chǎn)沼氣菌群5號(hào)、馴化菌群Y5S和厭氧污水原始菌群YJ，結(jié)果顯示3個(gè)菌群均含有Firmicutes、Bacteroidetes、Synergistetes、Proteobacteria、Spirochaetes和Verrucomicrobia。然而，在馴化菌群Y5S中，互養(yǎng)菌門(mén)Synergistetes所含豐度最高，是產(chǎn)沼氣菌群5號(hào)的9.44倍，由此表明Synergistetes門(mén)可能是沼氣系統(tǒng)中甲烷生產(chǎn)效率的一個(gè)重要影響因素。本文的研究結(jié)果也證實(shí)這一觀點(diǎn)，此結(jié)論為后續(xù)挖掘青海農(nóng)用沼氣池的功能微生物，提供了新的研究方向和思路。

表2 4個(gè)樣品在域水平上物種的相對(duì)豐度Tab.2 Relative abundance of species at domain level in four samples %

圖1 4個(gè)樣品細(xì)菌門(mén)和屬分類(lèi)水平統(tǒng)計(jì)Fig.1 Bacterial taxonomic classification at phylum and genus level in four samples

青海農(nóng)用沼氣池4個(gè)樣品共計(jì)注釋28個(gè)屬分類(lèi)(圖1b)。在LD-GH、LD-BH、LD-GL和LD-BL樣品中，其他類(lèi)群組(others)的總相對(duì)豐度分別為41.70%、39.57%、38.72和38.46%。除其他類(lèi)群組以外，優(yōu)勢(shì)屬類(lèi)群依次為海螺菌屬(Marinospirillum，相對(duì)豐度6.75%)、梭菌屬(Clostridium，相對(duì)豐度4.56%)、密螺旋體屬(Treponema，相對(duì)豐度3.60%)和假單胞菌屬(Pseudomonas，相對(duì)豐度3.01%)。平行比較分析4個(gè)樣品，海螺菌屬的相對(duì)豐度波動(dòng)變化較大(2.30%～12.46%)。在LD-BL中，海螺菌屬的相對(duì)豐度(12.46%)最高，其豐度變化與產(chǎn)氣存在明顯的相關(guān)性，豐度越高則產(chǎn)氣越差，反之亦然，即LD-GH小于LD-BH，LD-GL小于LD-BL。至此，海螺菌屬可能對(duì)沼氣產(chǎn)氣具有一定抑制作用，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4 古菌的群落組成

分別將相對(duì)豐度小于1%的目類(lèi)和屬類(lèi)合并到其他類(lèi)群組(others)后，青海農(nóng)用沼氣池4個(gè)樣品中，共計(jì)注釋到古菌類(lèi)群為5目14屬(圖2)。在目分類(lèi)水平上，甲烷微菌目(Methanomicrobiales)的相對(duì)豐度最高(大于84.90%)，且LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL(圖2a)。由圖2b可知，14個(gè)分類(lèi)屬中，產(chǎn)甲烷菌屬(Methanogenium)是優(yōu)勢(shì)古菌類(lèi)群(相對(duì)豐度25.41%～31.65%)，且豐度變化規(guī)律與甲烷微菌目的變化規(guī)律相一致。由此表明，在青海農(nóng)用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中，產(chǎn)甲烷菌屬是最主要的產(chǎn)氣功能類(lèi)群。產(chǎn)甲烷菌屬分類(lèi)隸屬甲烷微菌科，分布廣泛，其成員均為氫代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，利用H2/CO2代謝并產(chǎn)生CH4，且大多數(shù)屬于中溫菌(生長(zhǎng)溫度為30～40℃)[26-27]。極個(gè)別產(chǎn)甲烷菌屬成員的生長(zhǎng)溫度寬泛，最低可達(dá)到0℃左右，如嗜冷產(chǎn)甲烷菌Methanogeniumfrigidum[28]。本研究中，4個(gè)沼氣池發(fā)酵溫度為3.1～15.9℃，屬于低溫范疇，比甲烷微菌科大多數(shù)古菌的正常生長(zhǎng)溫度要低。在LD-BL樣品中，發(fā)酵溫度僅3.1℃，但產(chǎn)甲烷菌屬的豐度仍有25.41%，說(shuō)明產(chǎn)甲烷菌屬可能具有特殊的生理特性和低溫適應(yīng)性。在長(zhǎng)期寒冷或溫度季節(jié)性交替條件下，甲烷菌屬參與甲烷的生產(chǎn)，發(fā)揮至關(guān)重要的作用，可能是青海農(nóng)用沼氣池中最為優(yōu)勢(shì)的古菌功能類(lèi)群[29]。

圖2 4個(gè)樣品古菌目和屬分類(lèi)水平統(tǒng)計(jì)Fig.2 Archaeal taxonomic classification at order and genus level in four samples

此外，青海農(nóng)用沼氣池還存在幾種次優(yōu)勢(shì)屬群，參與甲烷生產(chǎn)，如甲烷囊菌屬(Methanoculleus，相對(duì)豐度14.71%)、甲烷粒菌屬(Methanocorpusculum，相對(duì)豐度11.42%)、甲烷盤(pán)菌屬(Methanoplanus，相對(duì)豐度8.73%)、甲烷裂葉菌屬(Methanolacinia，相對(duì)豐度8.23%)和甲烷泡菌屬(Methanofollis，相對(duì)豐度4.19%)。上述這些屬群和產(chǎn)甲烷菌屬一樣，都屬于氫代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，參與CO2還原代謝途徑，由此表明氫代謝-產(chǎn)甲烷菌可能是青海農(nóng)用沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中重要的甲烷生產(chǎn)參與者。值得注意的是，甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)僅出現(xiàn)在產(chǎn)氣好的樣品中，如在LD-GH樣品中相對(duì)豐度為3.47%，在LD-GL樣品中相對(duì)豐度僅為0.93%，總體相對(duì)豐度偏低，且因樣品存在差異；但在產(chǎn)氣差的LD-BH和LD-BL樣品中，均未曾檢出。

2.5 COG功能注釋

將基因產(chǎn)物與eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得對(duì)應(yīng)的直系同源序列聚類(lèi)(COG)，得到所有樣本COG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖(圖3)。4個(gè)樣品中注釋到一般功能基因(General function prediction only，R)的相對(duì)豐度最高，其次為碳水化合物運(yùn)輸和代謝(Carbohydrate transport and metabolism，G)，復(fù)制、重組與修復(fù)(Replication, recombination and repair，L)，氨基酸運(yùn)輸和代謝(Amino acid transport and metabolism，E)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成(Translation, ribosomal structure and biogenesis，J)，能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換(Energy production and conversion，C)，細(xì)胞壁/膜生物發(fā)生(Cell wall/membrane/envelope biogenesis，M)。此外，未知功能(Function unknown，S)的相對(duì)豐度也較高，說(shuō)明青海農(nóng)用沼氣池樣品中可能存在大量未知功能的新型代謝基因。整體而言，注釋到各模塊的基因豐度，在各樣品中分布的變化趨勢(shì)相對(duì)一致，LD-GH略大于LD-BH，LD-GL略大于LD-BL，表明產(chǎn)氣好沼氣池的樣品比產(chǎn)氣不好的樣品具有更多的有效基因。

圖3 COG功能注釋圖Fig.3 COG function annotation diagram

2.6 微生物群落參與的甲烷代謝關(guān)系解析

圖4 基于甲烷代謝的不同樣品KEGG路徑熱圖Fig.4 Heatmaps of KEGG pathways in different samples based on methane metabolism

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路分析，共注釋獲得代謝通路301個(gè)，涵蓋涉及528 078個(gè)基因。參與基因數(shù)較多的代謝通路主要集中在氨基酸的生物合成(ko01230)、碳代謝(ko01200)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)(ko02010)、嘌呤代謝(ko0230)及嘧啶代謝(ko00240)。關(guān)聯(lián)分析甲烷代謝相關(guān)的代謝路徑，并繪制成熱圖(圖4)。結(jié)果顯示，4個(gè)樣品中甲烷代謝(Methane metabolism，ko00680)、原核生物碳固定(Carbon fixation pathways in prokaryotes，ko00720)和糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogenesis，ko00010)的代謝路徑較為突出。在4個(gè)樣品中，上述熱點(diǎn)代謝通路的相對(duì)豐度均呈現(xiàn)LD-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL，直接反映了產(chǎn)氣好的沼氣池樣品具有更強(qiáng)的甲烷代謝能力。

圖5 甲烷代謝途徑Fig.5 Methane metabolism pathway

在甲烷代謝路徑中，產(chǎn)甲烷菌參與的甲烷代謝途徑，最終會(huì)形成甲基輔酶M(CH3-S-CoM)，其在甲基輔酶M還原酶(Mcr，Enzyme commission[縮寫(xiě)為EC]2.8.4.1)的催化下，以CoB為直接的電子供體還原CH3-S-CoM，最終形成CH4[30]。Mcr是甲烷代謝中的關(guān)鍵功能酶，也是產(chǎn)甲烷菌所特有的一種酶，對(duì)沼氣的產(chǎn)生發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[31-34]。由圖5可知，4個(gè)樣品中產(chǎn)甲烷菌Mcr基因貢獻(xiàn)值為L(zhǎng)D-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL，說(shuō)明產(chǎn)氣好的樣品中產(chǎn)甲烷菌Mcr的活性更高。

本研究中，單獨(dú)分析2種不同類(lèi)型產(chǎn)甲烷菌參與的甲烷代謝途徑。由圖5可知，在4個(gè)樣品中，氫代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌參與CO2還原途徑的所有通路非常完整。參與這些通路的重要酶，主要涉及四氫甲烷蝶呤甲酰轉(zhuǎn)移酶(EC2.3.1.101)、甲酰四氫甲烷蝶呤環(huán)化水解酶(EC3.5.4.27)、甲酰四氫甲烷蝶呤脫氫酶(EC1.5.98.1)以及甲酰四氫甲烷蝶呤還原酶(EC1.5.98.2)等。在4個(gè)樣品中，基因的貢獻(xiàn)豐度為L(zhǎng)D-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL，表明在產(chǎn)氣好的樣品中，氫代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌以H2作為電子供體，還原CO2產(chǎn)生CH4的能力更強(qiáng)。通常情況下，乙酸代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌參與的乙酸代謝過(guò)程生產(chǎn)甲烷，首先以乙酸為底物，經(jīng)乙酸激酶(EC2.7.2.1，Ack)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(EC 2.3.1.8，Pta)或乙酰CoA合成酶(EC6.2.1.1，Acs)等酶催化生成乙酰CoA。然后，乙酰CoA再在一氧化碳脫氫酶/乙酰CoA合成酶復(fù)合體(Codh/Acs，關(guān)鍵酶)，再與四氫甲烷喋呤(H4MPT)經(jīng)一系列酶及輔酶的催化作用生成CH4。但從圖5可知，4個(gè)樣品中Codh/Acs基因均未檢出，說(shuō)明乙酸代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌參與乙酸生產(chǎn)甲烷的代謝通路不完整。本研究中，宏基因組檢測(cè)到兩種乙酸代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，即甲烷鬃菌屬(Methanothrix)和甲烷八疊球菌屬。前者的相對(duì)豐度很低(小于0.1%)，從數(shù)量上可能導(dǎo)致其能提供的酶基因豐度非常低，近似忽略；而后者盡管有所檢出(相對(duì)豐度0.93%～3.47%，圖3)，但由于其具有多細(xì)胞集聚，可同時(shí)擁有3種CH4合成途徑：利用H2/CO2、利用乙酸或利用甲基合成CH4[35]。本研究中，甲烷八疊球菌屬可能僅參與利用H2/CO2生成甲烷的代謝途徑，而未通過(guò)利用乙酸生成甲烷的代謝途徑。

此外，青海農(nóng)用沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中，可能還存在其他微生物參與乙酸的各類(lèi)生化代謝，從圖5可知其代謝過(guò)程。首先，乙酰CoA在丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(EC1.2.7.1)的催化作用下生成丙酮酸，再在一系列酶的作用下丙酮酸生成亞甲基四氫甲烷蝶呤。然后，由氫代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌經(jīng)CO2還原途徑最終生成CH4。對(duì)比分析4個(gè)樣品，其他微生物參與的乙酸代謝通路，涉及所有酶基因的相對(duì)豐度為L(zhǎng)D-GH大于LD-BH，LD-GL大于LD-BL。通常情況下，沼氣系統(tǒng)中所生成的CH4，60%～70%來(lái)自乙酸鹽的轉(zhuǎn)化，約30%源自H2氧化和CO2還原。本研究發(fā)現(xiàn)青海農(nóng)用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)與目前的主流觀點(diǎn)不一致，可能是因?yàn)榍嗪＊?dú)特的氣候類(lèi)型和地理環(huán)境所致，特別是這種特殊的低溫發(fā)酵條件不利于乙酸代謝-營(yíng)養(yǎng)型菌株行使功能[36]。因此，青海農(nóng)用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中，甲烷產(chǎn)生的生化代謝過(guò)程可能主要依賴(lài)于H2/CO2合成途徑。

3 結(jié)論

(1)基于宏基因組技術(shù)獲得的物種注釋表明，青海農(nóng)用沼氣池發(fā)酵系統(tǒng)中蘊(yùn)藏著豐富的微生物種群。細(xì)菌可劃分為13門(mén)28屬，優(yōu)勢(shì)門(mén)分類(lèi)類(lèi)群依次是擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，在發(fā)酵系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?；ヰB(yǎng)菌門(mén)可能是沼氣生產(chǎn)重要的功能類(lèi)群。在屬水平上，優(yōu)勢(shì)類(lèi)群是海螺菌屬、梭菌屬、密螺旋體屬和假單胞菌屬。古菌可劃分為5目14屬，隸屬甲烷微菌目的產(chǎn)甲烷菌屬是最優(yōu)勢(shì)古菌類(lèi)群，也是產(chǎn)甲烷的最主要功能類(lèi)群。

(2)基于代謝功能注釋結(jié)果表明，產(chǎn)氣好比產(chǎn)氣差的樣品具有更多的有效基因，參與甲烷代謝相關(guān)路徑的功能基因豐度更高。在所有樣品的甲烷代謝途徑中，氫代謝-營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌參與CO2還原途徑的全部通路，非常完整，但產(chǎn)氣好的樣品功能酶基因豐度更高，產(chǎn)甲烷的能力更強(qiáng)。在青海農(nóng)用沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中，甲烷產(chǎn)生的途徑主要依賴(lài)于H2氧化/CO2還原的合成。