珍稀瀕危植物阜康阿魏的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)

楊 磊 曹秋梅 馮 纓 李文軍*

（1. 荒漠與綠洲生態(tài)國家重點實驗室，中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，烏魯木齊 830011；2. 中國-塔吉克斯坦生物資源保育與利用聯(lián)合實驗室，中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，烏魯木齊 830011；3. 資源與環(huán)境學(xué)院，中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

阜康阿魏（Ferula fukanensis）是傘形科（Apiaceae）多年生一次結(jié)果的草本植物，全株有強(qiáng)烈的蔥蒜樣臭味。該種為新疆特有種，珍稀瀕危的國家二級保護(hù)野生植物［1-2］，僅見于新疆阜康和烏魯木齊有黏質(zhì)土壤的沖溝和前山帶，是典型的小種群野生植物。阜康阿魏分泌的具有特殊蔥蒜樣臭味的油膠樹脂，具有重要藥用價值，被作為藥用阿魏的基原植物收載于《中華人民共和國藥典》［3-4］。近年來，濫采盜挖、過度放牧和土地開發(fā)等因素對阜康阿魏的原生生境造成破壞，該種種群數(shù)量快速下降，瀕臨滅絕［5-6］。目前有關(guān)阜康阿魏的研究主要集中在資源調(diào)查［5-7］，鮮見有關(guān)阜康阿魏遺傳多樣性的報道，這一定程度上限制了針對該種有效的保護(hù)管理措施的制定。

遺傳多樣性評價是對珍稀瀕危物種自然種群管理的關(guān)鍵性步驟之一［8-10］。野生物種的遺傳分析有助于掌握物種的遺傳變異，預(yù)測種群棲息地喪失和破碎化［9，11］。理論上認(rèn)為：廣布物種比種群規(guī)模小、分布范圍窄的稀有瀕危物種的遺傳多樣性更大［12-16］。小種群由于近親繁殖概率增加、種群結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和遺傳漂變等因素加速了遺傳多樣性的喪失，進(jìn)而導(dǎo)致其適應(yīng)環(huán)境變化的能力和進(jìn)化能力下降［8，13，16］。但最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，種群規(guī)模較小的瀕危物種有時也存在相對較高的遺傳多樣性［17-21］。阜康阿魏作為瀕危的小種群野生植物，很有必要對其現(xiàn)有種群開展遺傳多樣性評價，以更好地對其開展保護(hù)。

本研究采用Li［20］等開發(fā)的阿魏屬的微衛(wèi)星引物（Simple sequence repeat，SSR），對采集于現(xiàn)存的3 個阜康阿魏居群的87 個個體進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)檢測，以期厘清該種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，提出針對小種群阜康阿魏的保護(hù)和恢復(fù)建議，為有效保護(hù)和管理這種珍稀瀕危的藥用植物提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)標(biāo)本館館藏標(biāo)本資料和野外實地調(diào)查，在現(xiàn)有分布居群阜康西泉（XQ，44°20′38.06″N，88° 25′2.66″E）、烏 魯 木 齊 赤 焰 嶺（CYL，43°49′16.01″N，87°25′38.41″E）和阜康小紅溝（XHG，44°6′46.86″N，87°54′27.51″E）分別采集了30 株、22 株和35 株個體的新鮮健康葉片，在采樣的過程中保證2 個個體間間隔不少于20 m，取每個個體20 g 以上新鮮葉片單獨裝袋，硅膠干燥后帶回實驗室備用。憑證標(biāo)本保存在中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所標(biāo)本館（XJBI）。

1.2 DNA提取、引物篩選及PCR擴(kuò)增

每個樣本取2 g 左右的干燥葉片，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，利用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組提取試劑盒（DP320）進(jìn)行DNA提取，提取方法參照隨試劑盒攜帶的操作指南。篩選出10 對高多態(tài)性引物對所有DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL：模板DNA 1.0 μL 30 ng），上下游引物各0.5 μL（10 pmol·L-1），10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 0.5 μL（0.5 mmol·L-1），TaqDNA 聚合酶0.2 μL（0.5 U），DMSO 0.5 μL，H2O 14.8 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)熱5 min，之后分兩個階段，第一階段10 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s），第二階段32 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s），最后一次循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸5 min［20-21］。擴(kuò)增產(chǎn)物利用QIAxcel全自動電泳系統(tǒng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。電泳結(jié)果輸出在QI Axcel Biocalculator 進(jìn)行片段長度讀取和預(yù)處理。PCR 產(chǎn)物在ABI 3730 自動測序儀上進(jìn)行基因分型，使用混合分子大小標(biāo)記（10 μL LIZ500：1 000 ulhi-di，Applied Biosystems，USA）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用CERVUS v3.0.7［22］、POPGENE v1.32［23］和GenALEx 6.5［24］統(tǒng)計出每個位點水平和居群水平的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon信息指數(shù)（I）、多態(tài)信息含量（PIC）、多態(tài)位點百分率（PPB）、近交系數(shù)或固定指數(shù)（F）、基因分化指數(shù)（Fst）。Nei’s基因多樣性指數(shù)（h）通過FSTAT v1.2［25］計算。Hardy-Weinberg平衡通過1 000個隨機(jī)分組進(jìn)行評估，通過GENEPOP 網(wǎng)絡(luò)版中的連續(xù)Bonferroni 校正調(diào)整P值［26-27］。采用GenAlEx 6.5［24］軟件進(jìn)行分子方差分析（AMOVA），并基于遺傳距離矩陣對所有居群的遺傳關(guān)系進(jìn)行主成分分析（PCoA）。遺傳結(jié)構(gòu)采用Structure v2.3.4和Structure HARVESTER［28］軟件進(jìn)行分析，K分別設(shè)置為1～20，每個K值重復(fù)運算20 次。100 000 次的馬爾科夫鏈蒙特卡羅（MCMC）重復(fù)之后進(jìn)行30 000 次burn-in。使用CLUMPP v2.0［29］合 并 運 算 結(jié) 果，采 用Distruct v1.1［30］軟件繪制居群遺傳結(jié)構(gòu)圖。通過IBD v1.53對遺傳距離與地理距離進(jìn)行Mantel 相關(guān)性檢驗［31］，采用BOTTLENECK v1.2.02［32］對阜康阿魏居群進(jìn)行瓶頸效應(yīng)檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

各位點以及3 個居群遺傳多樣性指數(shù)見表2～3。來自3個居群的87個個體共有39個等位基因，每個位點的等位基因（Na）從3 個（FS9、FS41、FS45）到6個（FS6）不等，平均等位基因為3.900，居群XQ、CYL 和XHG 的等位基因（Na）分別為3.100、2.900、3.700。平均有效等位基因（Ne）為2.205，各位點從1.115（FS2）到2.902（FS18）不等，XQ、CYL 和XHG 分別為2.250、2.118、2.247。平均觀測雜合度（Ho）為0.881，高于平均期望雜合度（He）0.512，且各居群的觀測雜合度也都高于期望雜合度（見表2～3）。3個居群多態(tài)位點百分率（PPB）均為100.00%。1個位點（FS2）多態(tài)信息含量比較低（PIC＜0.2），5 個位點（FS1、FS9、FS21、FS41 和FS45）多態(tài)信息含量中等（0.2≤PIC＜0.5），4 個位點（FS6、FS12、FS18 和FS36）多態(tài)信息含量比較高（PIC≥0.5）。除FS2外所有位點經(jīng)Bonferroni 校正后顯著偏離哈溫平衡。居群間Nei’s 基因多樣性指數(shù)（hS）和總的Nei’s 基因多樣性指數(shù)（hT）分別為0.514 和0.516。3 個居群的近交系數(shù)均為負(fù)值，平均值為-0.693。

2.2 遺傳分化和遺傳結(jié)構(gòu)分析

3 個居群的居群內(nèi)分化系數(shù)（Fst）為0.007（見表2），平均基因流非常高（Nm=5.874）。AMOVA 分析顯示，群體間變異僅占總遺傳變異的4.1%，而群體內(nèi)變異占95.9%。居群間基因分化系數(shù)（PhiPT）為0.041（見表4）。貝葉斯聚類分析結(jié)果如圖1 所示，選擇K=2作為最優(yōu)K值，因為K=2時ΔK的值最大。Mantel 相關(guān)性檢驗也表明，不同種群間的地理距離和遺傳距離（R2=0.136，P=0.669）無顯著相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。PCoA 分析的第2、第3主成分分別解釋累計總變量的30.43%和43.37%（見圖2）。

圖1 阜康阿魏遺傳結(jié)構(gòu)分析A.基于20 次重復(fù)的Delta K 的對數(shù)似然函數(shù)值；B.根據(jù)10 個SSR位點變異推斷3個居群的遺傳結(jié)構(gòu)（任何一個K值顯示的3個種群都是完全相同，此處僅展示K=2）Fig.1 Genetic structure analysis of F.fukanensis A.Log-likelihood function values of Delta K based on 20 replicates；B.The genetic structure of based on the variation of 10 SSR loc（iAny value of K showed that the three populations were exactly the same，and only K=2 was shown here）

圖2 阜康阿魏遺傳距離的主成分聚類分析Fig.2 PCoA clustering analysis of paired genetic distance of F.fukanensis

表2 各位點遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Index of genetic diversity for all loci

表3 各居群遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Index of genetic diversity of F.fukanensis populations

表4 居群間和居群內(nèi)的分子方差分析Table 4 Results of AMOVA between and within populations of F.fukanensis

2.3 瓶頸效應(yīng)檢測

3 個居群在無限等位基因模型（IAM）和雙相突變模型（TPM）均顯示存在顯著的雜合度過剩（P＜0.05），在逐步突變模型（SMM）下不顯著（P＞0.05），只有XHG居群呈L形分布（見表5）。

表5 阜康阿魏瓶頸效應(yīng)檢測Table 5 Detection of bottleneck effect for F.fukanensis

3 討論

3.1 阜康阿魏遺傳多樣性

本研究通過前期開發(fā)的10對SSR引物對阜康阿魏進(jìn)行遺傳多樣性評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阜康阿魏表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性（hS=0.514，hT=0.516，Ho=0.881，He=0.512，I=0.836，PPB=100%）。低于廣布物種的平均值（He=0.58），卻高于其他瀕危物種的平均值（He=0.42）［16］。相較阿魏屬其他物種的遺傳多樣 性 也 要 高 很 多，如F. loscosii（He=0.125，hT=0.152）［33］，F(xiàn). communis（Hpop=0.320）［34］，F(xiàn). communiscomplex（Hw=0.263，hT=0.317）［35］，F(xiàn). arrigonii（Hw=0.317，hT=0.336）［36］和F. asafoetida（hT=0.34，I=0.51）［37］。與其他瀕危物種相比，如Nuphar submersa（He=0.42）［38］，Ottelia acuminatavar.jingxiensis（He=0.441，I=0.781）［39］，Ruta oreojasme（He=0.687）［40］，Vincetoxicum atratum（He=0.67）［41］，Ammi seubertianum（He=0.66，I=1.28）和A. trifoliatum（He=0.67，I=1.35）［42］，Tapiscia sinensis（He=0.690 4，I=1.436 8）［43］，也具有中等的遺傳多樣性。理論上，由于近交衰退和基因漂變的原因，瀕危物種與廣布物種相比有較低的遺傳多樣性［44-45］，而阜康阿魏相對較高水平遺傳多樣性的結(jié)果明顯不符合小種群、狹窄分布物種表現(xiàn)出低水平遺傳多樣性的普遍假設(shè)［14，46-48］。

影響珍稀瀕危植物遺傳多樣性的因素主要包括物種自身因素（繁育系統(tǒng)、瓶頸效應(yīng)、生活史等）和人為因素（自然資源過度開發(fā)、棲息地退化、土地利用等）［12，17，47，49-51］。理論上認(rèn)為異交物種通常比自交物種具有更高的遺傳多樣性水平［15，52］。關(guān)于阿魏屬植物繁育系統(tǒng)和傳粉生物學(xué)的相關(guān)研究表明，異交可能是阿魏屬植物的主要交配方式［53-54］。阿魏屬植物異交為主的繁育方式可能是保留較高水平遺傳多樣性的主要因素。本研究中涉及的3 個居群具有非常高的平均基因流（Nm=5.874）也一定程度上驗證了居群間存在廣泛的交流。阜康阿魏較高水平的遺傳多樣性很大程度是由于短時間內(nèi)對阜康阿魏過度破壞（濫采盜挖、過度放牧等因素）導(dǎo)致種群數(shù)量減少的速率遠(yuǎn)高于其遺傳多樣性降低的速率，現(xiàn)存的阜康阿魏繼承了原來大種群的部分遺傳變異。但現(xiàn)有小種群可能會增加阜康阿魏近親繁殖和遺傳漂變的概率，并增加衰退風(fēng)險［55］。

3.2 阜康阿魏遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化

本研究發(fā)現(xiàn)3 個居群間的遺傳變異和分化程度較低（Fst=0.007），PCoA、AMOVA 和Structure 分析也支持了這一結(jié)論。AMOVA 分析顯示阜康阿魏95.9%的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)，僅4.1%的變異發(fā)生在居群間，可能是由于巨大的基因流（Nm=5.874）抵消了遺傳漂變的影響，減少了居群間的遺傳變異［20-21］。Structure 結(jié)果顯示，當(dāng)K=2 時，ΔK值最大，3 個居群劃分了2 個基因庫，隨著K值的增加，仍有多個拐點出現(xiàn)，說明出現(xiàn)了新的基因庫，表明阜康阿魏雜合性很高，遺傳背景復(fù)雜［56］。Structure 未能將居群分組，Mantel 相關(guān)性檢驗也顯示了不同種群間的地理距離和遺傳距離（R2=0.136，P=0.669）無顯著相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）?；蚱款i效應(yīng)檢測顯示，XHG 居群為正常L 分布，還未經(jīng)歷遺傳瓶頸，而XQ 和CYL 居群，都為shifted 分布，說明它們最近經(jīng)歷了遺傳瓶頸，該結(jié)果可能也是由于對阜康阿魏種群的過度破壞造成的。

3.3 保育策略

研究結(jié)果表明阜康阿魏具有相對可觀的遺傳多樣性和進(jìn)化潛力，遺傳因素并不是該種瀕危的主要原因。通過野外調(diào)查推測，人為濫采和土地開發(fā)使得阜康阿魏物種棲息地破碎、縮減，種群數(shù)量急劇下降，可能是阜康阿魏當(dāng)前面臨的最大挑戰(zhàn)?？紤]到小種群會增加近親繁殖和遺傳漂變的風(fēng)險，建議開展就地保護(hù)和遷地保護(hù)工作等加強(qiáng)對阜康阿魏的保護(hù)：（1）建立阜康阿魏保護(hù)區(qū)，保護(hù)阜康阿魏的原生境；（2）加強(qiáng)監(jiān)管力度，防范原生境農(nóng)田開墾和盜采盜挖等人為活動破壞種群更新；（3）采集種子或幼苗進(jìn)行種質(zhì)資源的保存和遷地保育；（4）加強(qiáng)種群動態(tài)監(jiān)測，并開展相關(guān)基礎(chǔ)研究工作，輔助阜康阿魏種群復(fù)壯；（5）加強(qiáng)宣傳教育，提高公眾的保護(hù)意識，形成全民參與的社區(qū)保護(hù)模式。