死皮對橡膠樹樹皮線粒體超微結(jié)構(gòu)及活性氧代謝的影響

楊 洪 王立豐 代龍軍 郭冰冰

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，?？?571101；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；3. 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，?？?571101）

橡膠是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，根據(jù)來源不同分為天然橡膠和合成橡膠。天然橡膠在彈性、耐磨性和延展性等方面具有合成橡膠不可替代的優(yōu)勢，在一些重要工業(yè)領(lǐng)域（如航空、航天和重型汽車等制造業(yè)）具有廣泛的應(yīng)用。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis，簡稱橡膠樹）是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)生的膠乳是天然橡膠的主要來源。我國是天然橡膠消費(fèi)大國，但是適宜種植橡膠樹的地區(qū)和土地面積卻十分有限，使得我國的天然橡膠消費(fèi)不得不長期依賴進(jìn)口。隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，我國對天然橡膠的需求量還在逐年增加，供需缺口還將進(jìn)一步增加。目前，我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)面臨植膠區(qū)域有限且種植趨于飽和、天然橡膠價(jià)格持續(xù)低迷等問題，已很難通過擴(kuò)大種植面積來增加產(chǎn)量［1］。面對嚴(yán)峻的現(xiàn)實(shí)情況，大幅度提高橡膠樹單位面積產(chǎn)量是促進(jìn)我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展及緩解天然橡膠供需失衡壓力的最佳途徑。

死皮（tapping panel dryness，TPD）是一種橡膠樹所特有的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為橡膠樹產(chǎn)排膠過程割面部分或全部喪失排膠能力。與其他作物不同，橡膠樹的生產(chǎn)周期長達(dá)30 年［2］。死皮是影響橡膠樹高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素之一，也是世界天然橡膠產(chǎn)業(yè)面臨的共性問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國主要植膠區(qū)域死皮發(fā)生率高達(dá)24.71%，停割率為14.55%［3］。此外，隨著高產(chǎn)無性系（一般表現(xiàn)為耐割耐刺激能力差）和乙烯刺激采膠技術(shù)的推廣，死皮發(fā)生率和嚴(yán)重程度呈逐年上升趨勢［4-5］。死皮已成為橡膠樹單位面積產(chǎn)量提高的主要限制因子。死皮是一種多因素引起的復(fù)雜的生理綜合癥，至今對其發(fā)生發(fā)展規(guī)律的認(rèn)知還十分有限。已有研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝失衡是橡膠樹死皮發(fā)生的關(guān)鍵過程［6-10］。線粒體是細(xì)胞活動的“能量工廠”，同時(shí)也是ROS的重要產(chǎn)生部位。在植物細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和線粒體中，抗氧化酶和抗氧化代謝物共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生與清除平衡［11］。

目前，圍繞橡膠樹死皮的發(fā)生發(fā)展規(guī)律［3，12］、生理［13］、分子機(jī)制［14-16］及死皮防治［17-18］等多個(gè)方面已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，而在樹皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及抗氧化系統(tǒng)方面的研究較少。本文通過研究不同程度死皮橡膠樹樹皮線粒體超微結(jié)構(gòu)及ROS相關(guān)基因表達(dá)量變化規(guī)律，從微觀角度探討其與橡膠樹死皮動態(tài)發(fā)生過程的關(guān)系，以期深化對橡膠樹死皮發(fā)生機(jī)理的理解，為大幅提高橡膠樹單位面積產(chǎn)量和制定有效的TPD 防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所有樣品均采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場紅洋隊(duì)開割10 a（種植于2003 年，開割于2010 年）的橡膠樹品系熱研73397，于2020 年8 月開始割膠，根據(jù)連續(xù)6 刀（常規(guī)割膠，S/2 d/3）的排膠情況確定死皮程度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 死皮等級確定

將所選橡膠樹分為健康、輕度死皮和重度死皮，分類標(biāo)準(zhǔn)如下：排膠正常且膠乳流速均勻的樹為健康樹（標(biāo)記為H），死皮長度為2 cm至占割線總長度的1/4為輕度死皮（標(biāo)記為T2），死皮長度介于割線總長度的1/2至3/4為重度死皮（標(biāo)記為T4）。

1.2.2 電鏡樣品制備與超微結(jié)構(gòu)觀察

將確定部位割膠耗皮用報(bào)紙接住后，立即將靠近形成層部位的韌皮組織切下，并在冰上將切下的組織切割成1 mm×1 mm 的小塊，然后迅速投入體積分?jǐn)?shù)2%戊二醛固定液中固定，帶回實(shí)驗(yàn)室用真空泵抽氣直至樣品沉底，室溫放置2 h進(jìn)行前固定，之后用pH 為7.4 的磷酸緩沖液（PBS）漂洗3 次，每次15 min，再用1%的鋨酸進(jìn)行后固定5 h，并用0.1 mol·L-1PBS（pH 為7.4）漂洗3 次，每次15 min；將固定好的樣品依次放入體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液進(jìn)行逐級脫水，每次1 h；然后將樣品依次放入丙酮與環(huán)氧樹脂812包埋劑體積比為3∶1、1∶1、1∶3、0∶1的混合液中進(jìn)行滲透處理，每次120 min，將滲透好的樣品插入包埋板后37 ℃烘箱過夜，再在60 ℃烤箱聚合48 h；最后用Leica 冷凍超薄切片機(jī)（UC7，德國）進(jìn)行超薄切片，厚度為60～80 nm。切片再經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛各染色25 min 后，在透射電鏡（HT7700，日本）下觀察并拍照。

1.2.3 RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄

橡膠樹樹皮總RNA 采用RNA prep Pure Plant Kit（DP441，天根生化科技（北京）有限公司）試劑盒提取，提取步驟按試劑盒說明書操作。提取的總RNA 通過測定OD260和OD280進(jìn)行質(zhì)量分析和定量。cDNA 反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行。

1.2.4 qRT-PCR檢測

根據(jù)橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫［19］中獲得的ROS 相關(guān)基因序列，利用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物。引物序列如表1所示。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequence used in this study

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2016 對基因表達(dá)數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 23 軟件t-test 工具對基因表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 死皮發(fā)生過程樹皮線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

健康樹樹皮線粒體（M）未見明顯腫脹，結(jié)構(gòu)完整，大部分線粒體膜完整，嵴清晰（見圖1A）。輕度死皮樹線粒體（M）輕微腫脹，大多膜結(jié)構(gòu)完整，其內(nèi)基質(zhì)局部略顯變淡，嵴減少（見圖1B）。

重度死皮樹樹皮線粒體（M）嚴(yán)重腫脹，大部分線粒體呈不規(guī)則形變大，膜內(nèi)基質(zhì)溶解，嵴消失、空泡變，部分嚴(yán)重者，膜破損，基質(zhì)外溢（見圖1C）。

圖1 樹皮線粒體超微結(jié)構(gòu)A.健康樹；B.輕度死皮樹；C.重度死皮樹；M.線粒體；Pb.質(zhì)體小球；CW.細(xì)胞壁；RER.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；V.液泡；Go.高爾基體Fig.1 Ultrastructure of mitochondrial of rubber tree bark A.Healthy tree；B.Mild TPD tree；C.Severe TPD tree；M.Mitochondrial；Pb.Plastoglobuli；CW.Cell wall；RER.Rough endoplasmic reticulum；V.Vacuole；Go.Golgi apparatus

2.2 死皮發(fā)生過程抗氧化酶基因的表達(dá)

為明確橡膠樹死皮發(fā)生過程ROS 產(chǎn)生與清除關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，利用qRT-PCR 技術(shù)分析了過氧化物酶（peroxidase，HbPOD1～7）、過氧化氫酶（catalase，HbCAT）基因的表達(dá)模式（見圖2）。結(jié)果顯示，HbPOD1、HbPOD4、HbPOD5、HbPOD6和Hb-POD7基因在死皮樹樹皮中的表達(dá)量均顯著低于健康樹且死皮越嚴(yán)重其表達(dá)量越低。HbPOD2基因在輕度、重度死皮樹樹皮中表達(dá)均顯著高于健康樹，分別為健康樹表達(dá)量的15倍、12倍。HbPOD3基因在輕度死皮樹樹皮中的表達(dá)量最高，約為健康樹的2.6倍，而在重度死皮樹樹皮中的表達(dá)量與健康樹基本一致。HbCAT基因在樹皮中的表達(dá)隨著死皮的發(fā)生逐漸降低，其中在健康樹和輕度死皮樹中的表達(dá)量分別為重度死皮樹中的2.6倍、1.8倍（見圖2）。

圖2 抗氧化酶基因在橡膠樹死皮發(fā)生過程的表達(dá)A～G.HbPOD1-HbPOD7 基因表達(dá)；H.HbCAT 基因表達(dá)；死皮級別H，健康樹；死皮級別T2，輕度死皮樹；死皮級別T4，重度死皮樹；*和**分別表示死皮樹與健康樹差異顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）；下同F(xiàn)ig.2 Expression of antioxidant enzymatic genes during TPD process in H.brasiliensis A-G.The expression of HbPOD1-HbPOD7；H.The expression of HbCAT；TPD level H，Healthy tree；TPD level T2，mild TPD tree；TPD level T4，Severe TPD tree；* and ** indicate significan（tP＜0.05）and extremely significan（tP＜0.01）differences between TPD trees and healthy trees，respectively；The same as below

2.3 死皮發(fā)生過程抗氧化代謝物基因表達(dá)模式

通過熒光定量PCR 技術(shù)分析了重要抗氧化代謝物基因在橡膠樹死皮發(fā)生過程的表達(dá)量，含谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，HbGST1～4）基因4 個(gè)、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，HbPPO）、L-抗壞血酸氧化酶（L-ascorbate oxidase，HbAAO）基因各1個(gè)（見圖3）。結(jié)果顯示，HbGST1、HbGST2、HbPPO3個(gè)基因在死皮樹樹皮中的表達(dá)量高于健康樹，不同的是HbGST2和HbPPO在重度死皮樹的表達(dá)略低于輕度死皮樹，HbGST1的表達(dá)量隨著死皮嚴(yán)重程度升高；其余的3個(gè)基因（HbGST3、HbGST4、HbAAO）在死皮樹樹皮中的表達(dá)量均低于健康樹，其中Hb-GST3和HbAAO的表達(dá)量在重度死皮樹中表達(dá)量最低，HbGST4基因的表達(dá)量不受死皮程度影響。

圖3 抗氧化代謝物基因在橡膠樹死皮發(fā)生過程的表達(dá)A～D.HbGST1-HbGST4基因表達(dá)；E.HbPPO基因表達(dá)；F.HbAAO基因表達(dá)Fig.3 Expression of antioxidant metabolites genes during TPD process in H.brasiliensis A-D.The expression of HbGST1-HbGST4；E.The expression of HbPPO；F.The expression of HbAAO

3 討論

細(xì)胞及細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)分析是研究植物異常生理活動的重要細(xì)胞學(xué)手段。盧亞莉等［20］利用光學(xué)顯微鏡技術(shù)研究了不同程度死皮樹樹皮中的乳管、篩管、石細(xì)胞和單寧等的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，其研究結(jié)果表明隨著死皮程度的增加乳管排列越加紊亂無規(guī)律，膨大乳管數(shù)增加，篩管直徑減小，石細(xì)胞和單寧細(xì)胞增多。光學(xué)顯微鏡下，三級樹正常排膠部位樹皮結(jié)構(gòu)與健康樹基本一致［20］。線粒體是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，也是細(xì)胞新陳代謝的重要組成部分。在植物中，線粒體通過與光合作用、光呼吸和細(xì)胞質(zhì)代謝緊密相連維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡［21］。因此，線粒體結(jié)構(gòu)的完整與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、正常生理狀態(tài)息息相關(guān)。本研究的電鏡結(jié)果顯示，死皮發(fā)生過程橡膠樹樹皮線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化（見圖1）。健康樹樹皮大部分線粒體膜完整，嵴清晰，無明顯損傷。當(dāng)死皮發(fā)生時(shí)，固縮、變大、變長的線粒體基質(zhì)開始溶解、嵴開始消失，這必將對三羧酸循環(huán)和生物氧化代謝產(chǎn)生影響，從而影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝。隨著死皮程度的進(jìn)一步加深，線粒體腫脹加深并呈不規(guī)則形變，膜內(nèi)基質(zhì)大部分溶解，嵴消失、空泡變，部分嚴(yán)重者，膜破損，基質(zhì)外溢。

過度割膠和過度刺激引起的ROS產(chǎn)生與清除失衡是引發(fā)橡膠樹死皮的重要因素［14-15，22］。一方面過度割膠和過度刺激增強(qiáng)線粒體中呼吸代謝，從而導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生；另一方面，割膠后ROS清除相關(guān)物質(zhì)隨著膠乳排出而含量極低，細(xì)胞ROS清除能量減弱，導(dǎo)致ROS 的大量累積［4］。生理生化參數(shù)測定顯示，死皮樹中NAD（P）H 氧化酶和過氧化物酶活性顯著提高，黃色體破裂指數(shù)和ROS水平升高，還原性硫醇和抗壞血酸等ROS 清除劑含量降低，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶活性降低［4，23］。本研究利用熒光定量PCR 技術(shù)分析了ROS 產(chǎn)生、清除關(guān)鍵酶基因HbPODs、Hb-CAT（見圖2）和ROS 清除相關(guān)抗氧化代謝物Hb-GSTs、HbPPO、HbAAO基因的表達(dá)（見圖3）?；虮磉_(dá)結(jié)果顯示并不是所有的過氧化物酶在死皮樹中高表達(dá)，僅有HbPOD2、HbPOD3在死皮樹中的表達(dá)量顯著高于健康樹，其他5 個(gè)POD基因死皮樹的表達(dá)量均低于健康樹，預(yù)示HbPODs基因家族具有不同的分工。許聞獻(xiàn)等［24］通過分析過氧化物酶的同工酶分析發(fā)現(xiàn)造成死皮的過度割膠和過度刺激是通過誘導(dǎo)一些主酶帶的活性增強(qiáng)從而導(dǎo)致過氧化物酶活性提高，并不是所有同工酶活性都增強(qiáng)。根據(jù)本研究的結(jié)果推測HbPOD2和HbPOD3可能是橡膠樹死皮發(fā)生過程中過氧化物酶活性增強(qiáng)的主效過氧化物酶，未來可作為開發(fā)割膠強(qiáng)度、刺激強(qiáng)度和死皮發(fā)生的“標(biāo)志”基因的備選基因。死皮樹HbCAT基因的表達(dá)下調(diào)且下調(diào)程度與死皮嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這與郭秀麗等［13］的生理生化測定結(jié)果一致。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是廣泛存在于動植物中的一種多基因編碼的多功能超家族蛋白酶，在清除生物和非生物脅迫產(chǎn)生的氧化損傷中起著重要的作用［25-26］。在植物中，GSTs 基因家族成員在25～60，根據(jù)序列一致性、基因結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)可分為6 類［26］。范玉潔等［27］克隆了首個(gè)橡膠樹GSTs 家族成員HbGSTU1，該基因的表達(dá)受逆境脅迫和激素誘導(dǎo)等因素的調(diào)控，并且在死皮樹膠乳中的表達(dá)量較健康樹高，且隨著死皮程度的增加出現(xiàn)遞增的趨勢。本研究共分析了4 個(gè)不同于HbGSTU1的橡膠樹GSTs 家族基因的表達(dá)模式，結(jié)果顯示HbGST1和HbGST2在死皮樹樹皮中的表達(dá)量高于健康樹，這與范玉潔等［27］的研究結(jié)果一致，而HbGST3和HbGST4的表達(dá)趨勢則正好相反（見圖3）。這些基因表達(dá)的差異可能是因?yàn)镠bGST1、HbGST2與HbGSTU1屬于同一亞類，具有類似的生物學(xué)功能，而HbGST3、HbGST4屬于另一GSTs基因家族亞類，具有不同的生物學(xué)功能。PPO 是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含銅氧化還原酶，也是橡膠粒子凝固不可或缺的組份［28］。本研究也發(fā)現(xiàn)HbPPO在死皮樹中上調(diào)表達(dá)（見圖3）?？箟难?谷胱甘肽循環(huán)（ASA-GSH）是清除ROS 的重要抗氧化途徑［29］。AAO 是植物中廣泛存在的多銅氧化酶，也是ASAGSH 循環(huán)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，HbAAO在死皮樹中表達(dá)下調(diào)（見圖3），暗示HbAAOs參與橡膠樹死皮發(fā)生過程ROS清除。

橡膠樹死皮是一個(gè)持續(xù)的動態(tài)發(fā)生過程，樹皮細(xì)胞或細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的變化可能是其發(fā)生的起始。因此，本研究利用透射電鏡技術(shù)觀察了健康樹和不同程度死皮樹樹皮線粒體超微結(jié)構(gòu)，并對ROS代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。本研究發(fā)現(xiàn)線粒體等細(xì)胞器氧化損傷是橡膠樹死皮發(fā)生的關(guān)鍵過程，而ROS相關(guān)基因可作為下一步開發(fā)死皮發(fā)生、割膠和刺激強(qiáng)度監(jiān)測的潛在“標(biāo)志”基因。