外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片有機(jī)酸和激素含量的影響

劉建新 劉瑞瑞 劉秀麗 歐曉彬 賈海燕 卜 婷 李 娜

（甘肅省隴東生物資源保護(hù)利用與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，慶陽(yáng) 745000）

土壤鹽漬化是制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的全球性生態(tài)問(wèn)題［1］。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)的鹽堿地主要為中性鹽（NaCl、Na2SO4）和堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）伴生構(gòu)成的復(fù)合類型，對(duì)植物產(chǎn)生鹽堿復(fù)合脅迫［2］。因中性鹽脅迫（簡(jiǎn)稱鹽脅迫）和堿性鹽脅迫（簡(jiǎn)稱堿脅迫）間存在協(xié)同效應(yīng)，故鹽堿復(fù)合脅迫對(duì)植物的傷害常大于單一鹽脅迫或堿脅迫［3］。然而，已有的植物抗鹽堿機(jī)制研究主要集中在NaCl單鹽脅迫方面，對(duì)鹽堿復(fù)合脅迫的研究涉及較少。鹽堿復(fù)合脅迫下，滲透脅迫、營(yíng)養(yǎng)失衡和高pH 疊加［4］，因而維持細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)、電荷平衡及pH 穩(wěn)定對(duì)植物適應(yīng)鹽堿環(huán)境尤為關(guān)鍵［5］。有機(jī)酸是一類含有羧基的低分子量化合物，也是物質(zhì)和能量代謝的中間產(chǎn)物，它在植物響應(yīng)鹽堿脅迫中發(fā)揮著重要作用［6］。研究表明，鹽脅迫引起莧（Amaranthus tricolor）根部和地上部有機(jī)酸積累［7］；鹽、堿脅迫誘導(dǎo)番茄（Lycopersicon esculentum）根系有機(jī)酸水平提高［8］；而莖葉積累有機(jī)酸和根系主要分泌檸檬酸是鹽生植物星星草（Puccinellia tenuiflora）響應(yīng)堿脅迫的重要機(jī)制［9］。鹽脅迫還造成甜菜（Beta vulgaris）葉片有機(jī)酸組成發(fā)生改變［10］；鹽、堿脅迫引起堿地膚（Kochia scopariavar.sieversiana）不同有機(jī)酸主要在莖葉特別是成熟葉片中分布［11］?？傊}堿脅迫下植物有機(jī)酸代謝積累是極為復(fù)雜的過(guò)程，其含量高低受植物遺傳特性和環(huán)境脅迫等因素的共同作用。植物激素調(diào)控有機(jī)酸代謝酶的活性，在調(diào)節(jié)有機(jī)酸在植物不同組織中的分配和積累過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［12］。因此，研究有機(jī)酸和內(nèi)源激素對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)及其調(diào)控措施對(duì)揭示植物抗鹽堿機(jī)理和增強(qiáng)抗鹽堿性具有重要理論和實(shí)踐意義。

研究表明，內(nèi)源激素對(duì)植物適應(yīng)鹽堿脅迫具有重要調(diào)節(jié)作用。如張敏等［13］發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下小麥（Triticum aestivum）根系和葉片中生長(zhǎng)素（indole-3-acetic acid，IAA）和赤霉素（gibberellins，GAs）含量下降，脫落酸（abscisic acid，ABA）和玉米素核苷（zeatin riboside，ZR）含量升高，IAA/ABA 和GA3/ABA 比值降低。Tuna 等［14］研究表明，高鹽脅迫使玉米（Zea mays）中乙烯和ABA 含量升高，而IAA、GAs 和細(xì)胞分裂素（cytokinin，CTK）含量下降。王鑫等［15］研究顯示，甜菜遭受鹽堿脅迫后葉片IAA、GAs 和ABA 含 量 提 高，而CTK 含 量 下 降。Zhang等［16］指出，植物受到輕度鹽脅迫時(shí)體內(nèi)GAs 含量升高，從而降低葉片氣孔阻力，加速蒸騰作用和提高水分利用效率。Cachorro等［17］證明，鹽脅迫下菜豆（Phaseolus vulgaris）體內(nèi)ABA 含量的升高降低葉片氣孔導(dǎo)度，從而減少水分蒸騰并降低鹽離子傷害。Formentin 等［18］研究認(rèn)為，激素代謝的快速調(diào)節(jié)通過(guò)誘導(dǎo)特異的形態(tài)生理反應(yīng)促進(jìn)水稻（Oryza sativa）耐鹽性提高。迄今，已有許多研究探討鹽、堿脅迫下植物體內(nèi)有機(jī)酸和激素含量的變化，然而外源信號(hào)提高植物鹽堿耐性的有機(jī)酸和內(nèi)源激素響應(yīng)機(jī)制目前尚知之甚少。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是植物體中繼一氧化氮和一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)，它參與植物許多生理過(guò)程的調(diào)控，能夠增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的抗性［19］。研究表明，鹽脅迫下，H2S能維持水稻礦質(zhì)離子平衡［20］，提高大麥（Hordeum vulgare）的鉀鈉比［21］，增強(qiáng)茶樹(shù)（Camellia sinensis）［22］和玉米［23］抗氧化防御能力。鹽堿復(fù)合脅迫下，外源H2S 參與裸燕麥（Avena nuda）滲透脅迫調(diào)節(jié)［4］，且抽穗期噴施50 μmol·L-1H2S 供體NaHS 溶液緩解鹽堿復(fù)合脅迫對(duì)裸燕麥傷害的效果最佳［24］。裸燕麥?zhǔn)且环N禾本科（Poaceae）燕麥屬（Avena）西北特色優(yōu)勢(shì)作物，其籽粒富含β-葡聚糖和燕麥黃酮等降低血清膽固醇的成分，是美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的第1 個(gè)“具有降低心臟病風(fēng)險(xiǎn)”的谷物保健食品［25］。甘肅省是我國(guó)西部裸燕麥的主要種植地之一，裸燕麥也是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收和改善膳食結(jié)構(gòu)的重要雜糧，但土壤鹽堿化嚴(yán)重制約裸燕麥的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量提高。本試驗(yàn)?zāi)M甘肅省裸燕麥種植地鹽堿含量和組成，采用盆栽土培試驗(yàn)，研究噴施NaHS對(duì)鹽堿復(fù)合脅迫下裸燕麥葉片有機(jī)酸和激素水平的調(diào)控以及對(duì)產(chǎn)量性狀的影響，以期揭示H2S增強(qiáng)植物耐鹽堿性的生理機(jī)制，為探索利用H2S緩解裸燕麥鹽堿脅迫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與材料培養(yǎng)

試驗(yàn)于2021 年4—8 月在甘肅省隴東生物資源保護(hù)利用與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物科技園進(jìn)行。供試土壤取自隴東黃土高原（35°43′50″N，107°41′4″E）黑壚土耕作層（0～20 cm），風(fēng)干后過(guò)3 mm 孔篩，備用。土壤有機(jī)質(zhì)11.83 g·kg-1，速效氮37.4 mg·kg-1，速效磷（P2O5）7.25 mg·kg-1，速效鉀（K2O）182.5 mg·kg-1，水溶性總鹽0.773 g·kg-1，pH=7.92。裸燕麥品種‘定莜9號(hào)’種子購(gòu)自甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院；NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3、NaHS 從上海生工生物工程股份有限公司采購(gòu)；復(fù)合肥購(gòu)于甘肅省慶陽(yáng)市田田圈農(nóng)化有限公司；試驗(yàn)用塑料盆口徑31.5 cm，底徑25.0 cm，高34.0 cm，配底托。

過(guò)篩土樣分成2 組：一組中不添加NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3；另一組添加總質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.00 g·kg-1（包括土壤鹽堿背景值）的中性鹽和堿性鹽（n（NaCl）∶n（Na2SO4）∶n（Na2CO3）∶n（NaHCO3）=12∶8∶1∶9）。兩組土樣均添加0.5 g·kg-1（土）氮磷鉀（13-17-15）復(fù)合肥和0.269 L·kg-1（土）有機(jī)草碳基質(zhì)，各自拌勻后每盆裝土22.0 kg，澆水至田間持水量75%沉實(shí)3 d 后播種（4 月6 日），每盆播大約60粒種子，覆土3 cm，常規(guī)管理。5月9日定苗，每盆保留一致壯苗25 株。裸燕麥生長(zhǎng)至抽穗期（6月18日）時(shí)進(jìn)行噴施處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)處理：（1）對(duì)照（CK），盆土不添加中性鹽和堿性鹽，葉面噴施蒸餾水；（2）鹽堿脅迫（salt-alkali stress，SA），盆土添加中性鹽和堿性鹽，葉面噴施蒸餾水；（3）SA+NaHS，盆土添加中性鹽和堿性鹽，葉面噴施50 μmol·L-1NaHS 溶液；（4）NaHS，盆土不添加中性鹽和堿性鹽，葉面噴施50 μmol·L-1NaHS溶液。

每個(gè)處理6 盆（3 盆用作有機(jī)酸和植物激素檢測(cè)，另3 盆用于成熟后籽粒產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)），4 次重復(fù)，復(fù)拉丁方設(shè)計(jì)排布，共192盆。噴施用手持壓縮式噴霧器（成都市鑫桂塑膠有限公司）在裸燕麥抽穗期早晚各噴施1 次，連續(xù)噴3 d，每盆噴施量150 mL 左右。為提高噴施液與葉面的黏附性，噴施液中添加體積分?jǐn)?shù)為0.01%的Tween-80。噴施結(jié)束后第7 天取植株倒數(shù)第2 葉，用吸水紙擦拭干凈，裝入凍存管置液氮速凍后用干冰包埋寄至蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司檢測(cè)有機(jī)酸和植物激素含量。7 月20 日裸燕麥成熟后收獲，測(cè)定籽粒產(chǎn)量構(gòu)成。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

委托蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司運(yùn)用Vanquish Flex 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）和Q Exactive 型高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）檢測(cè)12 種有機(jī)酸和15種植物激素含量。

1.3.1 有機(jī)酸

1.3.1.1 樣品提取

精確稱量50 mg 凍樣于2 mL EP 管中，加入1顆鋼珠，加入500 μL 體積分?jǐn)?shù)30%甲醇溶液，高通量組織研磨儀60 Hz 研磨120 s，12 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清液20 μL，加入80 μL 體積分?jǐn)?shù)30%甲醇溶液混勻后加入到檢測(cè)瓶中。

1.3.1.2 色譜參數(shù)

液相色譜采用ACQUITY UPLC?BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters 公司），柱溫40 ℃，流動(dòng)相A 為水，流動(dòng)相B 為甲醇。梯度洗脫條件為0～6 min，28% B；6～9 min，28～40% B；9～10 min，40～50% B；10～11 min，50% B；11～13 min，30%B。進(jìn)樣量5 μL，流速0.25 mL·min-1。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，負(fù)離子電離模式。離子源溫度500 ℃，離子源電壓-4 500 V，碰撞氣6 psi，氣簾氣30 psi，霧化氣和輔助氣均為50 psi，采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行掃描。對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra performanceliquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，采用信噪比10∶1確定定量限及建立各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算以材料鮮質(zhì)量為基礎(chǔ)的各樣品有機(jī)酸含量（μg·g-1）。

1.3.2 植物激素

1.3.2.1 樣品提取

稱取100 mg 凍樣，加入1 mL 冰冷的體積分?jǐn)?shù)50%乙腈溶液，4 ℃超聲3 min 后4 ℃提取30 min，以12 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清過(guò)RPSPE 柱，用氮?dú)饬髡舾蓸悠?，溶?00 μL 體積分?jǐn)?shù)30%乙腈中，并轉(zhuǎn)移至裝有插入物的樣品瓶中。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱為Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A 為超純水，流動(dòng)相B 為乙腈；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。洗脫梯度：0 minV（水）∶V（乙腈）=90∶10，1 minV（水）∶V（乙腈）=90∶10，7 minV（水）∶V（乙腈）=90∶10，7.1 minV（水）∶V（乙腈）=10∶90，9 minV（水）∶V（乙腈）=10∶90。質(zhì)譜參數(shù)：采用電噴霧離子源，鞘氣40 arb；輔助氣10 arb；離子噴霧電壓-2 800 V；溫度350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為單離子檢測(cè)模式；掃描方式為正離子或負(fù)離子。利用軟件Trace Finder處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算以鮮質(zhì)量材料表示的各樣品激素含量，單位以ng·g-1表示。

1.3.3 產(chǎn)量構(gòu)成因素

裸燕麥成熟后以每盆為單位，統(tǒng)計(jì)裸燕麥的穗數(shù)量、穗鈴數(shù)量、穗粒數(shù)量，用天平（精度0.01 g）稱量千粒質(zhì)量和籽粒質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行一般線性模型單變量無(wú)交互拉丁方設(shè)計(jì)多因素方差分析，新復(fù)極差法比較處理間的5%差異顯著性。用Simca14.1 軟件對(duì)有機(jī)酸和激素含量等方差縮放后偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和隱結(jié)構(gòu)正交投影判別分析（orthogonal projection to latent structure-discriminant analysis，OPLS-DA），篩選處理間含量顯著的差異有機(jī)酸和植物激素。將不同處理裸燕麥產(chǎn)量構(gòu)成因素進(jìn)行主成分分析，以每個(gè)主成分特征根作為權(quán)數(shù)，計(jì)算不同處理產(chǎn)量性狀綜合得分。根據(jù)灰色系統(tǒng)理論，將產(chǎn)量性狀綜合得分和有機(jī)酸、激素含量視為1個(gè)灰色系統(tǒng)，參考張達(dá)斌等［26］的方法計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片有機(jī)酸含量的影響

由表1 可知，在裸燕麥葉片中檢測(cè)出琥珀酸、丁烯二酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、丙二酸、葡萄糖醛酸、泛酸、煙酸、焦谷氨酸、辛二酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸12 種有機(jī)酸，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1 000 μg·g-1的是檸檬酸、蘋(píng)果酸和泛酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10 μg·g-1的是煙酸、辛二酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸，其余5 種有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于10～100 μg·g-1。不同處理引起裸燕麥葉片中有機(jī)酸含量發(fā)生顯著改變。與CK 相比，SA 處理顯著提高了琥珀酸、丁烯二酸、蘋(píng)果酸、葡萄糖醛酸和總有機(jī)酸含量，顯著降低了焦谷氨酸含量，對(duì)檸檬酸、丙二酸、泛酸、煙酸、辛二酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸含量無(wú)顯著影響。與SA 處理相比，SA+NaHS 處理的3-羥基-3-甲基谷氨酸含量顯著提高，葡萄糖醛酸含量顯著降低，琥珀酸、丁烯二酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、丙二酸、泛酸、煙酸、焦谷氨酸、辛二酸、苯丙酮酸和總有機(jī)酸含量無(wú)顯著變化。與CK 相比，單獨(dú)NaHS處理的焦谷氨酸、辛二酸、葡萄糖醛酸含量顯著提高，琥珀酸、丁烯二酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、丙二酸、泛酸、煙酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸和總有機(jī)酸含量無(wú)顯著變化。

表1 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片有機(jī)酸含量的影響Table 1 Effects of exogenous hydrogen sulfide on the content of organic acids in leaves of naked oat under saline-alkali stress

2.2 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片有機(jī)酸組成的PLS-DA分析

PLS-DA 是有監(jiān)督的判別分析方法，R2X、R2Y和Q2各自代表模型對(duì)矩陣X、Y的擬合度和預(yù)測(cè)能力［27］。將不同處理裸燕麥葉片中有機(jī)酸含量經(jīng)PLS-DA 分析，R2X=0.631，R2Y=0.526，Q2=0.331，說(shuō)明模型擬合較好。由圖1A 得分圖可見(jiàn)，CK、NaHS、SA、SA+NaHS 處理各自歸為一類，表明4個(gè)不同處理間有機(jī)酸含量存在差異。經(jīng)200次置換檢驗(yàn)（圖1B）顯示，置換檢驗(yàn)中隨機(jī)產(chǎn)生的R2在縱軸上的截距小于0.4，Q2值在縱軸上的截距小于0.05。說(shuō)明PLS-DA 沒(méi)有出現(xiàn)模型過(guò)擬合現(xiàn)象，可以依據(jù)PLSDA 分析獲得的變量投射重要度（variable importance for the projection，VIP）值篩選差異代謝物。根據(jù)VIP＞1 且方差分析P＜0.05 篩選出辛二酸、葡萄糖醛酸、焦谷氨酸、丁烯二酸和3-羥基-3-甲基谷氨酸5種差異氨基酸。

圖1 不同處理下裸燕麥葉片有機(jī)酸PLS-DA得分圖（A）及200次模型的置換檢驗(yàn)（B）CK.無(wú)鹽堿脅迫下噴水；SA.鹽堿脅迫下噴水；SA+NaHS.鹽堿脅迫下噴NaHS；NaHS.無(wú)鹽堿脅迫下噴NaHS；下同F(xiàn)ig.1 PLS-DA score plot of organic acids in naked oat leaves under different treatments（A）and 200 permutation test of the mode（lB）CK.Spraying water under no salt-alkali stress；SA.Spraying water under salt-alkali stress；SA+NaHS.Spraying NaHS under salt-alkali stress；NaHS.Spraying NaHS under no salt-alkali stress；The same as below

2.3 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片有機(jī)酸組成的OPLS-DA分析

為提高模型參數(shù)對(duì)矩陣X/Y關(guān)聯(lián)度解釋，將不同處理裸燕麥葉片有機(jī)酸OPLS-DA 分析。如圖2：A，C，E 結(jié)果表明：處理CK、SA、SA+NaHS、NaHS各自聚為一族，充分顯示各處理間有機(jī)酸含量存在明顯差異。根據(jù)OPLS-DA 分析的VIP＞1 且95%置信區(qū)間不包括零篩選并結(jié)合S-圖解析可知：與CK相比，SA處理含量顯著上調(diào)的差異有機(jī)酸是葡萄糖醛酸、琥珀酸、丁烯二酸、蘋(píng)果酸、丙二酸5種，含量顯著下調(diào)的有機(jī)酸是焦谷氨酸（圖2B）。與SA 處理相比，SA+NaHS 處理的3-羥基-3-甲基谷氨酸含量顯著上調(diào)，而煙酸和葡萄糖醛酸含量顯著下調(diào)（圖2D）；與CK 相比，單獨(dú)NaHS 處理下辛二酸、葡萄糖醛酸、丁烯二酸、泛酸和丙二酸5種有機(jī)酸含量存在顯著差異，而且這5種有機(jī)酸含量全部上調(diào)（圖2F）。

圖2 不同處理下裸燕麥葉片有機(jī)酸OPLS-DA得分圖（A、C、E）和S形圖（B、D、F）A～B.CK vs SA；C～D.SA vs. SA+NaHS；E～F.CK vs. NaHS；Succi.琥珀酸；Butene.丁烯二酸；Malic.蘋(píng)果酸；Citric.檸檬酸；Malonic.丙二酸；Glucu.葡萄糖醛酸；Panto.泛酸；Nicotinic.煙酸；Pyrog.焦谷氨酸；Suberic.辛二酸；HMA.3-羥基-3-甲基谷氨酸；Phenyl.苯丙酮酸Fig.2 OPLS-DA score plo（tA，C，E）and S-plo（tB，D，F(xiàn)）of organic acids in naked oat leaves under different treatment A-B.CK vs.SA；.C-D.SA vs.SA+NaHS；E-F.CK vs.NaHS；Succi.Succinic acid；Butene.Butenedioic acid；Malic.Malic acid；Citric.Citric acid；Malonic.Malonic acid；Glucu.Glucuronic acid；Panto.Pantothenic acid；Nicotinic.Nicotinic acid；Pyrog.Pyroglutamic acid；Suberic.Suberic acid；HMA.3-Hydroxy-3-methylglutaric acid；Phenyl.Phenylpyruvic acid

2.4 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片激素含量的影響

從表2 可見(jiàn)，在裸燕麥葉片中檢測(cè)出IAA、赤霉素A1（gibberellin A1，GA1）、赤霉素A3（gibberellin A3，GA3）、赤霉素A4（gibberellin A4，GA4）、赤霉素A7（gibberellin A7，GA7）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、茉莉酸-異亮氨酸（jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJA）、ABA、反式-玉米素（trans-zeatin，tZ）、反式-玉米素核苷（trans-zeatin-riboside，tZR）、N6-（Δ2-異戊烯）腺嘌呤［N6-（Δ2-Isopentenyl）adenine，iP］、N6-（Δ2-異戊烯基）腺苷［N6-（Δ2-Isopentenyl）adenosine，iPA］、1-氨基環(huán)丙烷羧酸（1-aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC）等12種激素，未檢出油菜素內(nèi)酯，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1.000 ng·g-1的是ABA、JA、JA-Ile 和IAA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于0.100～1.000 ng·g-1的是MJA、GA3、tZ、ACC，其余6 種激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.100 ng·g-1。方差分析表明，與CK 相比，SA 處理顯著降低了JA-Ile、tZ和iP 含量，其余激素含量無(wú)顯著變化。與SA 處理相比，SA+NaHS 處 理顯著提高了IAA、GA7、MJA、iP 含量，顯著降低了GA3、GA4和ACC 含量，對(duì)GA1、JA、JA-Ile、ABA、tZ、tZR、iPA 含量無(wú)顯著影響。與CK 相比，單獨(dú)NaHS 處理的IAA、GA1、GA3、GA7、MJA、ABA、ACC 含量顯著提高，iP 含量顯著降低，GA4、JA、JA-Ile、tZ、tZR、iPA 含量無(wú)顯著變化。

表2 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片激素含量的影響Table 2 Effects of exogenous hydrogen sulfide on the content of hormone in leaves of naked oat under saline-alkali stress

2.5 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片激素含量的PLS-DA分析

將不同處理裸燕麥葉片激素含量經(jīng)PLS-DA分析R2X=0.554，R2Y=0.676，Q2=0.548，說(shuō)明模型擬合好。圖3A 得分圖顯示，CK、NaHS、SA、SA+NaHS處理較好各自歸為一類，說(shuō)明不同處理激素含量存在差異。經(jīng)200 次置換檢驗(yàn)（見(jiàn)圖3B）顯示，置換檢驗(yàn)隨機(jī)產(chǎn)生的R2在縱軸上的截距小于0.4，Q2值在縱軸上的截距小于0.05。說(shuō)明PLS-DA 沒(méi)有出現(xiàn)模型過(guò)擬合現(xiàn)象。根據(jù)VIP＞1且方差分析P＜0.05 篩選，tZ、GA4、MJA、ACC、ABA、GA7和GA3為含量差異激素。

圖3 不同處理下裸燕麥葉片激素PLS-DA得分圖及200次模型的置換檢驗(yàn)Fig.3 PLS-DA score plot of hormones in naked oat leaves under different treatments and 200 permutation test of the model

2.6 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片激素組成的OPLS-DA分析

不同處理裸燕麥葉片激素含量OPLS-DA 分析結(jié)果（見(jiàn)圖4：A、C、E）顯示，處理CK、SA、SA+NaHS、NaHS 各自聚為一族，充分顯示處理間激素含量存在明顯差異。根據(jù)OPLS-DA 分析的VIP＞1 且95%置信區(qū)間不包括零篩選并結(jié)合S-圖解析可知，與CK 相比，SA 處理含量顯著上調(diào)的差異激素是MJA、GA1、iPA，含量顯著下調(diào)的激素是tZ、ABA、JA-Ile（見(jiàn)圖4B）。與SA 處理相比，SA+NaHS 處理下MJA、GA7、tZ 和IAA 含量顯著上調(diào)，而GA4、ACC、tZR 和GA3含量顯著下調(diào)（見(jiàn)圖4D）；與CK 相比，單獨(dú)NaHS 處理下MJA、GA7、GA1和ABA 含量顯著上調(diào)，而iP 和GA4含量顯著下調(diào)（見(jiàn)圖4F）。

圖4 不同處理下裸燕麥葉片激素OPLS-DA得分圖（A、C、E）和S形圖（B、D、F）A～B.CK vs.SA；C～D.SA vs.SA+NaHS；E～F.CK vs.NaHS；IAA.吲哚乙酸；GA1.赤霉素A1；GA3.赤霉素A3；GA4.赤霉素A4；GA7.赤霉素A7；JA.茉莉酸；JA-Ile.茉莉酸-異亮氨酸；MJA.茉莉酸甲酯；ABA.脫落酸；tZ.反式-玉米素；tZR.反式-玉米素核苷；iP.N6（-Δ2-異戊烯）腺嘌呤；iPA.N6（-Δ2-異戊烯基）腺苷；ACC.1-氨基環(huán)丙烷羧酸Fig.4 OPLS-DA score plo（tA，C，E）and S-plo（tB，D，F(xiàn)）of hormones in naked oat leaves under different treatment A-B.CK vs.SA；C-D.SA vs.SA+NaHS；E-F.CK vs.NaHS；IAA.Indole-3-acetic acid；GA1.Gibberellin A1；GA3.Gibberellin A3；GA4.Gibberellin A4；GA7.Gibberellin A7；JA.Jasmonic acid；JA-Ile.Jasmonoyl-isoleucine；MJA.Methyl Jasmonate；ABA.Abscisic acid；tZ.Trans-zeatin；tZR.Trans-zeatin-riboside；iP.N6（-Δ2-Isopentenyl）adenine；iPA.N6（-Δ2-Isopentenyl）adenosine；ACC.1-Aminocyclopropanecarboxylic acid

2.7 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片不同類激素總量和總量比值的影響

從表3 可見(jiàn)，與CK 相比，SA 處理顯著降低了CTK 含量，其他種類激素總量及激素比例無(wú)顯著變化。與SA 處理比較，SA+NaHS 處理顯著提高了IAA 含量及IAA/ABA 比值，顯著降低了GAs、ACC含量及ACC/ABA 比值，對(duì)其他種類激素總量和激素比值無(wú)顯著影響。與CK 比較，單獨(dú)NaHS 處理顯著提高了IAA、GAs、JAs、ABA 和ACC 含量，對(duì)CTK含量和不同激素比值無(wú)顯著影響。

表3 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥葉片6類激素總量和總量比值的影響Table 3 Effects of exogenous hydrogen sulfide on the total amount of different hormones and the ratio of total hormone amount in leaves of naked oat under saline-alkali stress

2.8 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響

從表4 可知，SA 處理下裸燕麥穗數(shù)量、穗鈴數(shù)量和千粒質(zhì)量分別與CK 的差異不顯著，而穗粒數(shù)量和籽粒產(chǎn)量顯著下降。SA+NaHS 處理與SA 比較，穗數(shù)量、穗鈴數(shù)量和千粒質(zhì)量無(wú)顯著差異，穗粒數(shù)量和籽粒產(chǎn)量顯著提高。單獨(dú)NaHS 處理與CK 比較，穗數(shù)量、穗鈴數(shù)量、穗粒數(shù)量、千粒質(zhì)量和籽粒產(chǎn)量無(wú)顯著差異。

表4 外源硫化氫對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響Table 4 Effects of exogenous hydrogen sulfide on yield components of naked oat under saline-alkaline stress

2.9 裸燕麥有機(jī)酸、激素含量和產(chǎn)量性狀變化的灰色關(guān)聯(lián)度分析

由表5 可知，在不同處理下裸燕麥有機(jī)酸、激素含量與產(chǎn)量性狀的密切程度（關(guān)聯(lián)序）順序?yàn)椋航构劝彼幔総Z＞ABA＞煙酸＞JA-Ile＞辛二酸＞丙二酸＞tZR＞JA＞GA1＞3-羥基-3-甲基谷氨酸＞泛酸＞GA3＞苯丙酮酸＞蘋(píng)果酸＞GA4＞MJA＞iPA＞IAA＞檸檬酸＞ACC＞丁烯二酸＞GA7＞iP＞葡萄糖醛酸＞琥珀酸，且關(guān)聯(lián)度均在60%以上。

表5 裸燕麥有機(jī)酸、激素含量與產(chǎn)量性狀的關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)序Table 5 Correlation coefficient and order between organic acid and hormone content and yield traits of naked oat

3 討論

Guo 等［6］研究證明，植物有機(jī)酸代謝的獨(dú)特調(diào)節(jié)與其鹽、堿耐性密切相關(guān)。而H2S通過(guò)調(diào)控植物激素水平可減輕逆境脅迫對(duì)植物的氧化損傷［28］。本研究結(jié)果顯示，外源H2S對(duì)鹽堿復(fù)合脅迫下裸燕麥不同種類有機(jī)酸和激素含量存在顯著影響，且不同程度減輕鹽堿復(fù)合脅迫造成的裸燕麥穗數(shù)量、穗鈴數(shù)量、穗粒數(shù)量、千粒質(zhì)量和籽粒產(chǎn)量的下降幅度（見(jiàn)表4）。已有研究證明，外源H2S 通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力可減輕鹽誘導(dǎo)的氧化損傷，并維持葉綠素?zé)晒夂吞岣呦跛徇€原酶活性［22-23，29］；改善光合性能［30］，調(diào)節(jié)非選擇性陽(yáng)離子通道和鹽超敏感通路降低Na+含量［31］；調(diào)控質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)維持礦質(zhì)離子穩(wěn)態(tài)［20-21，32］，從而緩解鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制。本研究結(jié)果說(shuō)明，外源H2S對(duì)有機(jī)酸和激素水平的調(diào)控可能是其緩解裸燕麥產(chǎn)量性狀下降，增強(qiáng)裸燕麥鹽堿耐受的重要原因之一。

有機(jī)酸不僅是植物適應(yīng)鹽堿脅迫的重要滲透調(diào)節(jié)劑，也是負(fù)電荷貢獻(xiàn)者，還在離子平衡和pH調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用［6］。然而，已有的鹽、堿脅迫下植物積累有機(jī)酸的研究結(jié)果并不一致，未見(jiàn)H2S 對(duì)鹽堿復(fù)合脅迫下植物有機(jī)酸積累調(diào)控的研究。楊國(guó)會(huì)［5］研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫不影響小冰麥（Triticum aestivum-Agropyron intermedium）中有機(jī)酸含量，而堿脅迫顯著誘導(dǎo)其有機(jī)酸急劇增加。另一些研究［7-11］則表明，鹽、堿脅迫均誘導(dǎo)有機(jī)酸積累，并改變有機(jī)酸組成，但鹽脅迫和堿脅迫下有機(jī)酸的積累特征存在明顯差異，如郭立泉等［9］的研究顯示，星星草莖葉中的有機(jī)酸含量隨著鹽脅迫強(qiáng)度增大而下降，而隨堿脅迫強(qiáng)度提高有機(jī)酸含量急劇上升。本研究中，裸燕麥葉片中的焦谷氨酸、煙酸、辛二酸、丙二酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、泛酸和苯丙酮酸的含量與產(chǎn)量性狀的關(guān)聯(lián)度高（見(jiàn)表5）。鹽堿復(fù)合脅迫不僅顯著提高裸燕麥葉片中總有機(jī)酸含量，還使琥珀酸、丁烯二酸、蘋(píng)果酸、葡萄糖醛酸含量顯著提高，但同時(shí)顯著降低了焦谷氨酸含量（見(jiàn)表1）。外源H2S 對(duì)正常條件和鹽堿復(fù)合脅迫下裸燕麥葉片中有機(jī)酸總量影響不大，而顯著改變了有機(jī)酸的組成，使鹽堿復(fù)合脅迫下裸燕麥葉片中3-羥基-3-甲基谷氨酸含量顯著提高，而葡萄糖醛酸含量顯著下降。OPLS-DA 分析發(fā)現(xiàn)，鹽堿復(fù)合脅迫下外施H2S含量顯著上調(diào)的是3-羥基-3-甲基谷氨酸，而煙酸和葡萄糖醛酸含量顯著下調(diào)（見(jiàn)圖2D）。這表明外源H2S 對(duì)鹽堿脅迫下葉片3-羥基-3-甲基谷氨酸下降的顯著上調(diào)作用可能在H2S 減輕鹽堿脅迫對(duì)裸燕麥產(chǎn)量性狀抑制中發(fā)揮了重要作用，而煙酸和葡萄糖醛酸含量的變化可能在增強(qiáng)裸燕麥適應(yīng)鹽堿脅迫中發(fā)揮著獨(dú)特作用，但具體的生理作用及其分子機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。

植物激素是一類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。IAA 主要促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)［18］；CTK 促進(jìn)細(xì)胞分裂和延緩葉片衰老，并調(diào)節(jié)許多酶活性［13］；GAs 加速細(xì)胞分裂和促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)［14］；ABA 引起氣孔關(guān)閉，抑制植物生長(zhǎng)［16-17］；乙烯促進(jìn)開(kāi)花、果實(shí)成熟、器官衰老和調(diào)控植物對(duì)逆境的適應(yīng)［33］；JAs 促進(jìn)葉片衰老和脫落、氣孔關(guān)閉、呼吸作用和蛋白質(zhì)合成，抑制花芽形成、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和光合作用［34］。一般認(rèn)為，IAA、CTK 和GAs 為生長(zhǎng)促進(jìn)型激素，而ABA 和JAs 為生長(zhǎng)抑制型激素，但不同種類激素的生理效應(yīng)存在相互促進(jìn)或頡頏作用，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控往往是多種激素綜合作用的結(jié)果［35］。鹽、堿脅迫會(huì)改變激素含量和分布，從而調(diào)節(jié)生理生化過(guò)程和生長(zhǎng)發(fā)育，使植物適應(yīng)鹽、堿的能力增強(qiáng)［13-18］，且多數(shù)研究認(rèn)為鹽、堿脅迫誘導(dǎo)生長(zhǎng)促進(jìn)型激素減少，而生長(zhǎng)抑制型激素增加［36］，但也有相反的研究報(bào)道［13-17］。Chang 等［37］研究表明，鹽脅迫下黃瓜（Cucumis sativus）萌發(fā)種子中乙烯合成前體ACC合成乙烯的能力和乙烯積累量明顯降低。本研究中，裸燕麥葉片中tZ、ABA、JA-Ile、tZR、JA、GA1的含量與其產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)密切（見(jiàn)表5）。鹽堿復(fù)合脅迫顯著降低裸燕麥葉片JA-Ile、tZ 和iP 含量；外源H2S 顯著提高鹽堿復(fù)合脅迫下裸燕麥葉片IAA、GA7、MJA 和iP 含量，顯著降低GA3、GA4和ACC 含量（見(jiàn)表2）。OPLS-DA分析顯示，鹽堿復(fù)合脅迫顯著上調(diào)MJA、GA1、iPA 含量，顯著下調(diào)tZ、ABA、JAIle 含量（圖4B）；外源H2S 顯著上調(diào)鹽堿復(fù)合脅迫下裸燕麥葉片MJA、GA7、tZ 和IAA 含量，顯著下調(diào)GA4、ACC、tZR 和GA3含量（見(jiàn)圖4D）。這表明鹽堿脅迫和鹽堿脅迫下外施H2S 都會(huì)顯著改變裸燕麥葉片中不同種類激素水平，其中JA-Ile 和tZ 含量的下降可能是鹽堿脅迫導(dǎo)致裸燕麥產(chǎn)量性狀下降最為主要的原因之一，而外源H2S 對(duì)IAA、GA7、MJA及iP或tZ等CTK的上調(diào)作用可能與其有效緩解鹽堿脅迫裸燕麥產(chǎn)量性狀降低密切相關(guān)。外源H2S參與不同逆境下植物激素水平的調(diào)控［28］，而它調(diào)控的激素改變與逆境下植物生長(zhǎng)變化的關(guān)系尚需進(jìn)一步揭示。

植物耐鹽性不僅與植物激素絕對(duì)含量有關(guān)，而且與各類激素間的平衡關(guān)系更加密切［13］。劉海英等［38］研究表明，鹽脅迫下小麥IAA/ABA 和GAs/ABA 比值顯著降低。張麗等［39］研究發(fā)現(xiàn)，平歐雜種榛（Corylus heterophylla×C. avellana）體內(nèi)（GA+IAA+ZR）/ABA 比值隨鹽或堿脅迫強(qiáng)度增大逐漸降低。本研究中，鹽堿復(fù)合脅迫顯著降低了裸燕麥葉片中CTK 含量，而對(duì)IAA、GAs、JAs、ABA 和ACC 總量及IAA/ABA、GAs/ABA、JAs/ABA、CTK/ABA、ACC/ABA 比值無(wú)顯著影響；外源H2S 顯著提高了鹽堿復(fù)合脅迫下裸燕麥葉片IAA 含量及IAA/ABA 比值，顯著降低了GAs、ACC含量及ACC/ABA比值（見(jiàn)表3）。這說(shuō)明鹽堿脅迫并未顯著改變裸燕麥葉片激素平衡，僅僅顯著降低了CTK 的含量；而外源H2S 不僅顯著改變鹽堿脅迫裸燕麥葉片激素水平，而且顯著提高IAA/ABA 比值。Achard等［40］研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫下，擬南芥（Arabidopsis thaliana）體內(nèi)GAs 含量降低，同時(shí)伴隨著DELLA蛋白（一類由環(huán)境誘導(dǎo)的多種激素共同調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)抑制因子）含量升高，引起生長(zhǎng)抑制，從而增強(qiáng)擬南芥耐受鹽脅迫的能力。鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制可能部分還通過(guò)激活乙烯信號(hào)途徑完成［36］。IAA 影響植物多種生理過(guò)程，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［18］，還能提高液泡膜H+-焦磷酸酶和質(zhì)膜H+-ATP 酶表達(dá)水平和活性，將Na+轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞或區(qū)隔化液泡內(nèi)提供驅(qū)動(dòng)力，從而增強(qiáng)植物耐鹽性［41］。由此推測(cè)，外源H2S 可能通過(guò)降低GAs 和ACC 含量增強(qiáng)裸燕麥鹽堿脅迫耐性，同時(shí)通過(guò)提高IAA/ABA 比值緩解鹽堿脅迫對(duì)裸燕麥產(chǎn)量性狀的抑制。然而，H2S對(duì)植物不同種類激素代謝的調(diào)控及其作用機(jī)制交織復(fù)雜，目前關(guān)于鹽堿脅迫下植物內(nèi)源激素對(duì)H2S響應(yīng)機(jī)制的研究還少見(jiàn)報(bào)道，尚需進(jìn)一步運(yùn)用分子生物學(xué)等多種手段解析H2S 緩解植物鹽堿脅迫的激素調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

在鹽堿脅迫下，噴施H2S能夠顯著上調(diào)裸燕麥葉片中3-羥基-3-甲基谷氨酸含量和下調(diào)煙酸、葡萄糖醛酸含量，提高IAA、GA7、MJA 及iP 或tZ 等細(xì)胞分裂素含量和IAA/ABA 比值，降低GA3、GA4和ACC 含量及ACC/ABA 比值，不同程度緩解裸燕麥穗數(shù)量、穗鈴數(shù)量、千粒質(zhì)量、穗粒數(shù)量和籽粒產(chǎn)量的下降幅度。說(shuō)明外源H2S 參與鹽堿脅迫下裸燕麥有機(jī)酸和激素代謝的調(diào)控，能夠增強(qiáng)裸燕麥對(duì)鹽堿環(huán)境的適應(yīng)能力。