白樺BpSPL9基因抑制表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究

杜金霞 申婷婷 王浩然 林一萍 李慧玉 張連飛

（1. 長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，長春 130000；2. 黑龍江省慶安國有林場管理局，哈爾濱 150000；3. 東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150000）

SPL基因是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子［1］。SPL家族基因的共同特征是包括1 個高度保守的76 個氨基酸殘基SBP結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域包含DNA結(jié)合所必需的2 個鋅結(jié)合位點和C 末端的核定位信號（NLS）［1-2］。SPL基因首先在金魚草（Antirrhinummajus）中被鑒定，能夠與花分生組織識別基因SQUAMOSA啟動子結(jié)合［1］。此后，SPL基因在綠藻、苔蘚以及擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、蘋果（Malus pumila）和毛果楊（Populus trichocarpa）等其他物種［3-6］中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。隨著研究的深入，SPL基因的功能也逐漸明晰，研究發(fā)現(xiàn)SPL基因的表達(dá)水平受miR156/157的調(diào)控，在植物生長和生理的各個方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括植物胚胎［7］、葉原基形成［8］、組織和營養(yǎng)相的變化［9］、光信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝［10］和脅迫反應(yīng)［11］。抑制AtSPL3的表達(dá)會導(dǎo)致擬南芥提前開花［9］。At-SPL3/4/5通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵下游基因AtAP1、AtFUL和AtLFY的表達(dá)，參與花分生組織的發(fā)育［12］。Os-SPL16通過增加細(xì)胞分裂和籽粒灌漿，有效地提高稻米品質(zhì)和產(chǎn)量，說明該基因?qū)λ荆∣ryza sativa）籽粒發(fā)育具有積極的影響［13］。OsSPL14抑制水稻分蘗數(shù)量，但促進(jìn)穗分枝以增加粒質(zhì)量［14］。在擬南芥中，SPL9干擾MYB-bHLH-WD40 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形成，抑制DFR的表達(dá)，從而抑制花青素的合成［10］。在低溫下（5 ℃），葡萄VvSBP3和VvSBP5均上調(diào)，但VvSBP4和VvSBP7下調(diào)，表明VvSBP3和VvSBP5與葡萄的低溫反應(yīng)相關(guān)［15］。人們對擬南芥和水稻中SPL基因的功能了解很多，但對白樺（Betula platyphylla）中SPL基因的了解有限。

EAR 型轉(zhuǎn)錄抑制子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄抑制子，在激活子C 末端附加一段EAR 基序，形成融合蛋白，可將其轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€高效的負(fù)調(diào)控子，該技術(shù)被稱為嵌合抑制子沉默技術(shù)（CREST）。CREST 在研究轉(zhuǎn)錄因子家族基因功能中應(yīng)用廣泛，其最大優(yōu)點是可以克服基因冗余性的影響。迄今為止，對SPL基因的功能分析在木本植物中研究較少，尤其是白樺。根據(jù)第九次森林清查結(jié)果，白樺是我國蓄積量第二的樹種，也是天然次生林更替的先鋒樹種。在前期研究中，通過白樺轉(zhuǎn)錄組及白樺基因組序列比對，共獲得了12 條SPL基因，系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)SPL家族分6 個亞類，其中SPL9屬于第Ⅲ類，這一類基因除含有SBP 結(jié)構(gòu)域外，基因長度差異較小［5］。本研究采用CREST 技術(shù)構(gòu)建BpSPL9-EAR 的植物表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化后，對獲得的轉(zhuǎn)基因白樺株系進(jìn)行表型分析，探討B(tài)pSPL9基因?qū)Π讟迳L發(fā)育的影響，為進(jìn)一步闡明白樺SPL9基因的生物學(xué)功能提供參考。

1 方法

1.1 RT-PCR擴(kuò)增SPL9-EAR序列

根據(jù)白樺SPL9基因序列［5］，設(shè)計特異引物SPL9-F（5′-CACCATGAAAATGGGTTCGGGTTC-3′ ） 、SPL9-R （5′-TCAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAGAAGTGACCAGTGCATCT -GC-3′），該引物用于克隆SPL9基因的不含終止密碼子的ORF 序列，并在3′端加上編碼12 個核苷酸的EAR 基因序列［16-17］。采用RNA 提取試劑盒（購自百泰克生物技術(shù)有限公司）提取白樺葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA（購自北京全式金生物），稀釋后為模板，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：2.0 μL 10×KOD Buffer、2.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、SPL9-F和SPL9-R 引物各0.6 μL，2.0 μL cDNA、0.3 μL KOD Plus Neo，DNAfree 水補(bǔ)足到20.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃2 min后，94 ℃45 s，58 ℃45 s，72 ℃1 min，35個循環(huán)后72 ℃7 min。目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行回收純化。

1.2 Gateway方法構(gòu)建SPL9抑制表達(dá)載體

純化后的PCR 產(chǎn)物通過TOPO 反應(yīng)連接到入門載體pENTR（pENTRTM/D-TOPO Cloning Kit，Invitrogen）上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行PCR 檢測，將陽性菌落送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。提取測序分析正確的陽性單克隆質(zhì)粒，進(jìn)行LR 反應(yīng)，將SPL9-EAR 重組至pGWB2 載體上。將重組質(zhì)粒pGWB2-BpSPL9-EAR 轉(zhuǎn)化EHA105 感受態(tài)細(xì)胞（購自擎科生物有限公司），在LB+50 mg·L-1卡那霉素+50 mg·L-1利福平的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，PCR 檢測為陽性的單克隆作為侵染白樺用的工程菌。

1.3 白樺樹遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測

通過農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)的白樺合子胚轉(zhuǎn)化法進(jìn)行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化［18］。為檢測目的基因是否成功導(dǎo)入到白樺中，分別以潮霉素抗性白樺株系及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟逯晗担╓T）的總DNA為模板，SPL9-F和SPL9-R為引物，pGWB2-BpSPL9 質(zhì)粒和WT 的DNA 分別為陽性和陰性對照，同時設(shè)水對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 轉(zhuǎn)基因株系的表型觀測

將BpSPL9-EAR 轉(zhuǎn)基因白樺及對照白樺組培擴(kuò)繁，生根后移栽到相同基質(zhì)（V（黑土）∶V（草炭土）∶V（蛭石）=2∶2∶1）中，放到在植物培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：室溫25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。2個月后測定苗高、地徑、節(jié)間距及葉面積。選擇Bp-SPL9-EAR 轉(zhuǎn)基因白樺株系和WT 株系內(nèi)長勢一致、健康的各10株，分別取第7和8片葉，掃描儀掃描后用ImageJ 軟件分析葉面積。各株系的苗高、地徑及葉面積數(shù)據(jù)用SPSS 進(jìn)行多重比較和方差分析。

1.5 內(nèi)源植物激素測定

取以上株系內(nèi)長勢一致、無病蟲害的植株嫩葉，多株混合后采用酶聯(lián)免疫法（購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）測定植物內(nèi)源激素，每個樣品測3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpSPL9-EAR克隆及植物表達(dá)載體構(gòu)建

以白樺葉片cDNA 為模板，根據(jù)BpSPL9ORF序列設(shè)計含有12 個氨基酸的EAR 的特異引物，經(jīng)PCR 獲得BpSPL9-ERA 片段，電泳檢測結(jié)果顯示：在1 176 bp處獲得特異條帶，并與目標(biāo)條帶大小一致（見圖1）。純化后的PCR 產(chǎn)物經(jīng)TOPO 反應(yīng)后，其中3 個單克隆PCR 檢測為陽性，選取電泳條帶亮度最高的2個單克隆進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果證明已成功克隆BpSPL9，并成功構(gòu)建到了pENTR 載體上（見圖2）。提取經(jīng)PCR 及測序檢測為陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行LR 反應(yīng)（見圖3），挑取的9 個單克隆進(jìn)行PCR 檢測，其中6 個PCR 檢測為陽性，說明已成功構(gòu)建pGWB2-BpSPL9-EAR載體。

圖1 BpSPL9-EAR片段PCR產(chǎn)物電泳圖譜M.Marker DL2000；1.水對照；2.BpSPL9基因Fig.1 Electrophoresis of PCR product of BpSPL9-EAR fragment M.Marker DL2000；1.Water control；2.BpSPL9 Genes

圖2 pGWB2-BpSPL9-EAR載體圖譜及PCR檢測M.Marker DL2000；1.水對照；2～7.重組子Fig.2 Vector of pGWB2-BpSPL9-EAR M.Marker DL2000；1.Water control；2-7.Recombination element

圖3 pGWB2-BpSPL9-EAR載體PCR檢測M.Marker DL2000；1.陽性對照；2.水對照；3～11.大腸桿菌轉(zhuǎn)化子Fig.3 Vector of pGWB2-BpSPL9-EAR M.Marker DL2000；1.Positive control；2.Water control；3-11.Escherichia coli invertor

2.2 轉(zhuǎn)BpSPL9-SRDX白樺株系的獲得

將構(gòu)建好pGWB2-BpSPL9-EAR 載體轉(zhuǎn)化到EHA105后，以白樺合子胚為外植體進(jìn)行侵染。將侵染后的白樺合子胚在Woody Plant medium（WPM）+1.0 mg·L-1細(xì)胞分裂素（6-BA）+0.2 mg·L-1萘乙酸（NAA）上共培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)至WPM+0.8 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1赤 霉 素（GA3）+50 mg·L-1潮霉素上，并在選擇培養(yǎng)后加入頭孢霉素抑制農(nóng)桿菌生長，20 d 左右在切口處長出愈傷；待愈傷組織長到5 cm 左右，將其切下進(jìn)行再分化培養(yǎng)，最終獲得4 個抗性株系，分別命名為Bp-SPL9-SRDX-1～BpSPL9-SRDX-4。

分別以4 個轉(zhuǎn)BpSPL9白樺株系及WT 葉片DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗證外源基因是否已進(jìn)入白樺基因組中（見圖4），電泳結(jié)果顯示：4個轉(zhuǎn)化子均能夠檢測與陽性對照大小一致的目的條帶，而WT 中沒有檢測出條帶，說明BpSPL9-EAR已成功整合到白樺基因組中。

圖4 轉(zhuǎn)BpSPL9基因植株的PCR檢測M.Marker DL2000；1.pGWB2-BpSPL9-EAR 質(zhì)粒；2.水；3.WT；4～7.轉(zhuǎn)化子Fig.4 PCR of BpSPL9 transgenic lines M.Marker DL2000；1.pGWB2-BpSPL9-EAR plasmids；2.Water；3.WT；4-7.Transformants

2.3 轉(zhuǎn)基因株系的苗高、地徑及節(jié)間距變化

2.3.1 BpSPL9基因調(diào)控白樺的苗高和地徑生長

對轉(zhuǎn)基因及對照株系進(jìn)行組培擴(kuò)繁后移栽，2個月后測量苗高及地徑，結(jié)果表明：除SPLSRDX-4外，其他3個轉(zhuǎn)基因株系苗高與非轉(zhuǎn)基因白樺差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.05），轉(zhuǎn)基因株系的苗高顯著低于WT 白樺（P＜0.05），其中SPLSRDX-2 和SPLSRDX-3 株系的苗高分別比WT 低30.34%和25.86%。轉(zhuǎn)基因株系地徑與WT 差異不顯著（P＞0.05）（見圖5）。

圖5 BpSPL9-SRDX白樺株系的苗高及地徑Fig.5 Analysis of seedling height and diameter of transgenic BpSPL9-SRDX lines

2.3.2 BpSPL9基因影響白樺節(jié)間距

對移栽2個月的轉(zhuǎn)基因和WT株系節(jié)間距進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：WT節(jié)間距主要分布在10～14 mm，而轉(zhuǎn)基因白樺的節(jié)間距變短，多數(shù)分布在8～14 mm，尤其是SPLSRDX-1株系，在6～8 mm 也有較多分布（見圖6）。表明BpSPL9影響白樺的節(jié)間距。

圖6 轉(zhuǎn)BpSPL9-SRDX株系的節(jié)間距分布Fig.6 Node spacing distribution of transgenic BpSPL9-SRDX lines

2.3.3 轉(zhuǎn)基因株系的葉面積變小

對轉(zhuǎn)基因白樺與WT的第7和8片葉的葉面積進(jìn)行分析，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因和WT 株系的葉面積達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），BpSPL9-SRDX-1 和Bp-SPL9-SRDX-4 的第7 片葉葉面積分別低于WT 葉面積的42.87%和38.96%，BpSPL9-SRDX-1 和Bp-SPL9-SRDX-2 的第8 片葉面積分別低于WT 的50.91%和47.82%（見圖7）。

圖7 轉(zhuǎn)BpSPL9抑制表達(dá)株系的葉面積Fig.7 Analysis of leaf area of transgenic BpSPL9-SRDX lines

2.4 轉(zhuǎn)基因株系的內(nèi)源植物激素

選取苗高最低的2 個轉(zhuǎn)基因株系BpSPL9-SRDX-2 和BpSPL-SRDX-3 與WT，測定吲哚-3-乙酸（IAA）和6-芐氨基嘌呤（6-BA）的變化情況，株系內(nèi)多株混樣并做3次平行重復(fù)試驗，結(jié)果表明：各株系間6-BA和IAA含量差異顯著（P＜0.05），轉(zhuǎn)基因株系2 種激素含量均低于對照株系，尤其是BpSPL9-SRDX-2株系的IAA含量明顯低于WT（見圖8）。

圖8 轉(zhuǎn)基因株系的激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.8 Hormone content of transgenic lines

3 討論

大多數(shù)的SPL轉(zhuǎn)錄因子具有相似的表達(dá)模式，有研究表明，SPL轉(zhuǎn)錄因子存在于許多植物中，主要參與調(diào)控植物的花、葉、脅迫等過程。在麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）中JcSPLs具有多樣的時空表達(dá)模式，JcSPL3在7 或10 年生麻風(fēng)樹所有組織中的表達(dá)水平最高，并且隨著樹齡的增長呈現(xiàn)出增加的趨勢，這表明它在麻風(fēng)樹年齡發(fā)育的調(diào)節(jié)中起著重要作用［18］。所有的擬南芥AtSPLs基因都在花分生組織和花器官（萼片、花瓣、雄蕊和心皮）及莖、葉、根等營養(yǎng)器官中表達(dá)［3］。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR 分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)小麥TaSPL基因調(diào)控花序和穗發(fā)育。在十字花科（Brassicaceae）植物花和莖發(fā)育過程中，BjuSPL3a_B、BjuSPL2b_B和BjuSPL2c_A在花中顯著表達(dá)，而BjuSPL3b_B和BjuSPL10a_A在莖節(jié)中顯著表達(dá)［19］，說明這2 個SPL可能參與莖節(jié)發(fā)育過程。前期研究發(fā)現(xiàn)，白樺SPL9基因在葉、芽、莖、雄花和雌花中均有表達(dá)［5］，初步證明SPL9可能參與這幾個組織部位的發(fā)育過程。

為了進(jìn)一步揭示SPL9的功能，構(gòu)建了Bp-SPL9-ERA 載體，轉(zhuǎn)化白樺后觀測轉(zhuǎn)基因株系的表型。轉(zhuǎn)BpSPL9抑制表達(dá)白樺表現(xiàn)出的苗高降低，節(jié)間距變短及葉面積變小的表型。

在擬南芥中過量表達(dá)AtSPL9和AtSPL10都可以延長葉片的間隔期，并降低葉片生成速率，導(dǎo)致葉片數(shù)量減少，葉面積增大［20］。種子萌發(fā)階段，At-SPL13基因上調(diào)表達(dá)，葉原基發(fā)育受到抑制，進(jìn)而影響了第1 片葉的形成。AtSPL9基因還在葉片形狀和表皮毛的形成起作用［21-23］。BpSPL9同樣影響白樺葉片大小，但對表皮毛的影響不明顯。在陸地棉（Gossypium hirsutum）GhSPL3和GhSPL18過表達(dá)擬南芥植株的表型觀測表明，這2個基因參與了葉片和第2芽的發(fā)育。SPL可能通過抑制YUC2和YUC6的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)生長素的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，并參與側(cè)器官包括葉片的形態(tài)發(fā)生［24］。小麥（Triticum aestivum）TaSPL8基因敲除突變體葉片接合處缺失，葉片直立，結(jié)構(gòu)緊湊，穗數(shù)增加，TaSPL8與生長素反應(yīng)因子基因和油菜素類固醇生物發(fā)生基因CYP90D2的啟動子結(jié)合并激活其表達(dá)［25］。BpSPL9的下調(diào)表達(dá)同樣引起了白樺的節(jié)間距變短。在玉米（Zea mays）和水稻中，SPL家族成員UB3通過調(diào)節(jié)參與細(xì)胞分裂素生物合成和信號傳導(dǎo)的LOG1和ARRs的表達(dá)，調(diào)節(jié)營養(yǎng)和生殖分支［26］。在白樺中，BpSPL9抑制表達(dá)株系生長素和細(xì)胞分裂素含量減低，苗木表現(xiàn)出苗高、節(jié)間距和葉片大小的變化該性狀與AtSPL9和AtSPL10相似，說明SPL基因調(diào)控葉片發(fā)育方面在木本與草本植物中相對保守。推測BpSPL9可能通過影響生長素和細(xì)胞分裂素的合成，從而調(diào)控白樺的生長發(fā)育。后續(xù)還需要進(jìn)一步分析該轉(zhuǎn)錄因子在白樺生長發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制。