物理因子及無機(jī)鹽對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

黃思梅，張 鏡，張京維

(1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 梅州 514015；2.廣東杉維生物醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，廣東 梅州 514015)

物理因子及無機(jī)鹽對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

黃思梅1，張 鏡1，張京維2

(1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 梅州 514015；2.廣東杉維生物醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，廣東 梅州 514015)

以半制備HPLC純化制備的陰香果實(shí)花色苷為樣品，研究物理因子及無機(jī)鹽與陰香花色苷溶液穩(wěn)定性的關(guān)系。結(jié)果表明：陰香花色苷溶液100℃條件下的半衰期為4.7h，室內(nèi)散射光下貯存40d的保存率為92.702%，pH1.0～6.0溶液貯存40d，陰香花色苷時(shí)的保存率高于90.0%；0.001～0.01mol/L 的NaCl溶液、FeSO4溶液對(duì)陰香花色苷具有護(hù)色或增色效果，0.001～0.1mol/L的CuSO4溶液或KCl溶液對(duì)陰香花色苷具加速降解的作用，陰香花色苷在0.001～0.01mol/L的ZnSO4、Mg(NO3)2及0.001～0.05mol/L的Ca(NO3)2溶液中，保存率與不含無機(jī)鹽的保存率無顯著差異，但高濃度的ZnSO4、Mg(NO3)2及Ca(NO3)2溶液有促進(jìn)陰香花色苷降解的作用。研究表明陰香花色苷的穩(wěn)定性較高。

陰香；花色苷；穩(wěn)定性；無機(jī)鹽；物理因子

Abstract：Anthocyanins inCinnamoummum burmanniifruits were extracted with 90% methanol aqueous solution, separated D301 macroporous resin and purified by semi-preparative HPLC, and the effects of physical factors and mineral salts on the stability of the purified anthocyanins were investigated. Their half-degradation time in aqueous solution was 4.7 h at 100 ℃.Their retention rate was 92.702% under indoor scattered light after 40 days of storage; in contrast, that in aqueous solution at pH 1.0－6.0 was more than 90.00% after the same storage period. NaCl and FeSO4 solutions in the concentration range from 1 to 10 mmol/L displayed color-protecting and hyperchromic effects on the purified anthocyanins, respectively. CuSO4 and KCl solutions in the concentration range from 1 to 100 mmol/L accelerated their decomposition. However, 1－50 mmol/L Ca(NO3)2 as well as 1－10 mmol/L ZnSO4 and Mg(NO3)2had no effect on their stability. In the presence of CaNO3, ZnSO4 or Mg(NO3)2 at higher concentrations, the purified anthocyanins were significantly accelerated to be decomposed. These results suggest a higher stability of the anthocyanins purified fromCinnamoummum burmanniifruits.

Key words：Cinnamoummum bumanni；anthocyanin；stability；mineral salts；physical factors

陰香(Cinnamoummum bumannii)為樟科、樟屬中一種，系多年生常綠、闊葉喬木，扦插繁殖灌木狀。主要分布于我國廣東、海南、廣西、福建、江西、浙江、湖南等省及東南亞等地。陰香樹速生、樹冠緊湊、樹形美觀，葉面積指數(shù)大，終年枝葉繁茂，對(duì)SO2等的抗性強(qiáng)，是理想的防污染、抗有害氣體的綠化樹種，是我國東南沿海廣東、海南等省常用的行道樹[1]。陰香樹還因根、皮、葉等可提取藥用成分與化工原料而被作為工業(yè)林發(fā)展樹種[2-3]，且因陰香對(duì)防治水土流失具突出的效果，近年在廣東、海南等將其大量用于水源涵養(yǎng)林發(fā)展樹種。陰香樹在廣東每年3月底至4月初開花，8月后果實(shí)才開始較快發(fā)育，12～1月果實(shí)成熟，在具有“冬季天然溫室”之稱的廣東，陰香樹果實(shí)年產(chǎn)量大，而且含豐富花色苷等多種成分[4]。

花色苷是廣泛存在于植物的花、水果、蔬菜中鮮艷天然色素，現(xiàn)已作為食用色素用于果醬、果汁、飲料、糖果等加工食品[5]。除作為著色劑外，花色苷還具有很強(qiáng)的清除自由基、抗氧化等活性，降低低密度脂蛋白膽固醇，抗突變、抗腫瘤、抗過敏，保護(hù)胃黏膜，以及降低重金屬毒性等多種醫(yī)療保健功能[6-10]，是倍受世人青睞的天然活性物質(zhì)。植物組織中花色苷的含量低，且市售花色苷產(chǎn)品多以水果、蔬菜及糧食等農(nóng)產(chǎn)品為原料，致使市場(chǎng)價(jià)格昂貴，因而新花色苷的研發(fā)仍系當(dāng)今重要的研究課題[11-18]。陰香果實(shí)不僅富含花色苷，而且抗氧化活性的穩(wěn)定性較高[19-20]，開發(fā)利用潛力較大，本研究旨在為陰香果實(shí)花色苷的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰香果實(shí)成熟期從廣東省梅州市采摘，蒸餾水洗凈晾干，超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

HCl、NaOH、NaCl、KCl、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1525EF分析/半制備 HPLC 美國Waters公司；VIRTIS 凍干機(jī) 美國Irtis公司；U-2800紫外-可見分光光度計(jì) 日本日立公司；D301大孔吸附樹脂 天津市大均科技開發(fā)有限公司；EP-1蠕動(dòng)泵、層析柱(25mm×80mm) 美國Bio-Rad公司；NU-425 CLASSⅡ生物安全柜 美國紐艾公司。

1.3 方法

1.3.1 供試陰香果實(shí)花色苷樣品的制備

冷凍果實(shí)室溫解凍，搗碎果肉，90%甲醇溶液與物料混勻浸提30min，離心上清液－18℃過夜，離心收集上清液凍干。粗提物粉末以D301大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附精制后再動(dòng)態(tài)吸附精制，80%甲醇解吸，收集主峰洗脫液凍干。精制的花色苷樣品以半制備 HPLC純化，色譜條件以三氟乙酸、甲醇及三蒸水為流動(dòng)相，梯度洗脫，515nm波長(zhǎng)主峰洗脫液凍干，以張鏡等[20]方法測(cè)定樣品總花色苷含量為93.27%。

1.3.2 陰香花色苷特征吸收波長(zhǎng)的選擇

取適量陰香花色苷樣品溶于pH4.0 蒸餾水中，以pH4.0蒸餾水為參比液，用紫外-可見分光光度計(jì)在190～1100nm內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，以500～550nm內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.3 溫度對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

取pH4.0的蒸餾水配制成一定濃度的陰香花色苷溶液，分裝到三角瓶?jī)?nèi)，在20～100℃恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行熱處理，每1h取樣測(cè)定1次溶液在515nm波長(zhǎng)處的吸光度，以pH4.0的蒸餾水為參比液，按以下公式計(jì)算花色苷保存率。

式中：Ax為處理后陰香花色苷溶液的吸光度；A0為初始溶液的吸光度。

1.3.4 室內(nèi)散射光對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

以1mol/L HCl溶液將調(diào)蒸餾水pH值為4.0，加入適量的陰香花色苷溶解，無菌條件下0.22μm微孔濾膜除菌，分裝于容器，于透光良好的室內(nèi)桌面貯放，并以同一室內(nèi)避光貯放的陰香花色苷溶液為對(duì)照，每4d取樣測(cè)定處理液吸光度，計(jì)算花色苷的保存率。

1.3.5 pH值對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

將花色苷分別配制pH1～10的溶液，0.22μm微孔濾膜除菌后裝入三角瓶?jī)?nèi)，避光28℃恒溫貯存，定時(shí)精確取一定體積樣品液，調(diào)溶液的pH值為4.0，靜置4h后測(cè)515nm波長(zhǎng)處的吸光度，乘稀釋倍數(shù)得處理后樣品的吸光度，計(jì)算花色苷保存率。

1.3.6 無機(jī)鹽對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

將供試無機(jī)鹽配制成系列濃度(pH4.0)溶液，加入適量的陰香花色苷樣品，0.22μm微孔濾膜除菌后裝入三角瓶?jī)?nèi)，避光28℃恒溫貯存，定時(shí)取樣測(cè)定各處理515nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算花色苷的保存率。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，所有數(shù)據(jù)以SPSS 13.0及Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以 LSR法進(jìn)行差異顯著水平多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰香花色苷特征波長(zhǎng)的確定

圖1 陰香花色苷pH4.0溶液紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-visible spectrum of anthocyanins extracted fromC. burmanniifruits

由圖1可見，陰香花色苷光譜圖分別在波長(zhǎng)265、343nm和515nm處有吸收峰，500～550nm內(nèi)的可見光吸收峰為花色苷定量測(cè)定通用的吸收峰，以515nm為本研究檢測(cè)波長(zhǎng)。另外，光譜中343nm處吸收峰明顯，表明陰香花色苷分子有?；?，而有?；幕ㄉ辗肿硬灰资芩肿庸?，在寬pH值范圍表現(xiàn)較高的顏色穩(wěn)定性[21-22]。

2.2 溫度對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

圖2 溫度對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由圖2可知，陰香花色苷90℃及100℃處理時(shí)，半衰期分別為8.0h和4.7h。統(tǒng)計(jì)分析表明30～50℃處理10h內(nèi)花色苷保存率與初始值無顯著差異，而20℃處理的顯著高于初始值。60℃以上的熱處理陰香花色苷保存率逐漸下降，處理溫度越高，保存率下降的幅度越大，80～100℃處理2h后花色苷保存率與初始值的差異極顯著。但80℃以上高溫處理1h的花色苷溶液因顏色變深，所以保存率高于初始值，可能因高溫使花色苷甲醇假堿、查爾酮假堿、烊陽離子及醌式堿4種結(jié)構(gòu)形式的比例改變，顯色成分的比例增大[23]。

2.3 室內(nèi)散射光對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

圖3 室內(nèi)散射光對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of scattered light on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由圖3可見，花色苷溶液在室內(nèi)散射光貯存12d時(shí)保存率較初始值顯著降低，降幅為3.380%。貯放40d時(shí)花色苷的保存率為92.702%，與初始值差異極顯著，且比相同條件下避光貯存對(duì)照保存率低3.8%，而藍(lán)莓花色苷室內(nèi)散射光下30d的保存率僅為39. 90%[24]，表明陰香花色苷對(duì)室內(nèi)散射光的耐受性較好。

2.4 pH值對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，pH1～6處理的花色苷溶液貯藏40d時(shí)保存率較初始值低，且差異顯著，但保存率均高于90%。pH7～10處理的花色苷溶液貯存期中保存率隨pH值的增大而急驟降低，貯藏40d時(shí)保存率與初始值的差異極顯著。雖然陰香花色苷不同pH值下的穩(wěn)定性與文獻(xiàn)報(bào)道[25]的其他花色苷較一致，但其降解的速率相對(duì)較慢，表明陰香花色苷在酸性條件下的穩(wěn)定性較好。

圖4 pH值對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

2.5 無機(jī)鹽對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

2.5.1 NaCl對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

圖5 NaCl對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由圖5可知，NaCl濃度低于0.01mol/L處理的花色苷溶液貯存40d時(shí)保存率都與初始值無顯著差異，但與無NaCl的對(duì)照花色苷溶液無顯著差異，表明低濃度的NaCl都對(duì)陰香花色苷具有良好的護(hù)色作用。高于0.05mol/L的處理花色苷溶液貯存40d時(shí)保存率與對(duì)照差異不顯著，表明較高濃度NaCl對(duì)陰香花色苷的穩(wěn)定性無不利影響。

2.5.2 KCl對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

圖6 KCl對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of KCl concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由圖6可知，0.1mol/L KCl溶液陰香花色苷保存率最低，貯存40d后降至76.704%，與所有其他濃度處理貯存40d后保存率的差異都極顯著。其余濃度之間處理貯存40d后保存率相互間差異不顯著，但與初始值及無KCl的對(duì)照的差異都極顯著，表明陰香花色苷對(duì)KCl敏感。

2.5.3 Ca(NO3)2對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

圖7 Ca(NO3)2對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of CaNO3concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由圖7可見，處理濃度為0.001、0.005mol/L Ca(NO3)2溶液的花色苷保存率與對(duì)照保存率相當(dāng)，差異不顯著。但濃度高于0.005mol/L處理的花色苷貯存期間保存率不斷降解，貯存40d時(shí)0.01mol/L的處理與對(duì)照差異顯著，而濃度0.05mol/L及0.1mol/L處理的保存率與對(duì)照差異極顯著。

2.5.4 Mg(NO3)2對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

圖8 Mg(NO3)2對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of Mg(NO3)2concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由圖8可知，Mg(NO3)2溶液濃度低于0.005mol/L處理后花色苷溶液貯存效果最佳，40 d保存率與不含Mg(NO3)2的花色苷對(duì)照溶液的保存率差異不顯著。濃度大于0.01mol/L處理的花色苷溶液，40d內(nèi)花色苷的保存率下降顯著，結(jié)果表明，Mg(NO3)2對(duì)花色苷穩(wěn)定性存在不利影響，影響程度隨濃度的升高而加大，且彼此間差異極顯著。

2.5.5 CuSO4對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

圖9 CuSO4對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of CuSO4concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由圖9可知，不同濃度CuSO4處理的花色苷溶液保存率均低于不含CuSO4的對(duì)照花色苷保存率，差異極顯著。結(jié)果表明，CuSO4對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響較大，陰香花色苷在含CuSO4溶液中褪色快，因而陰香花色苷開發(fā)利用中應(yīng)盡可能避免CuSO4離子對(duì)顏色的不利影響。

2.5.6 ZnSO4對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

圖10 ZnSO4處理的陰香花色苷存放30d的保存率Fig.10 Effect of ZnSO4concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由圖10可見，ZnSO4溶液低于0.005mol/L時(shí)，花色苷溶液保存率與不含ZnSO4貯存40d的保存率相當(dāng)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明其差異不顯著。其余較高濃度溶液中花色苷的保存率隨貯存期的延長(zhǎng)而逐漸降低，而且下降速度較快，8～12d時(shí)的保存率較對(duì)照的差異達(dá)極顯著。

2.5.7 FeSO4對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響

由圖11可見，F(xiàn)eSO4溶液低于0.001mol/L中時(shí)，貯存40d后陰香花色苷的保存率高于初始值，且與無FeSO4對(duì)照的保存率高差異極顯著。濃度高于0.005mol/L處理對(duì)花色苷的穩(wěn)定性在貯存的前期無不利影響，但后期有促進(jìn)花色苷的降解作用。結(jié)果表明，低濃度FeSO4處理后對(duì)花色苷增色效應(yīng)，但陰香花色苷對(duì)高濃度FeSO4敏感。

圖11 FeSO4對(duì)陰香花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of FeSO4concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

3 結(jié)論與討論

3.1 陰香花色苷的熱、光與弱酸穩(wěn)定性較好

陰香花色苷溶液100℃高溫度處理降解半衰期為4.7h，60℃處理10h仍高于90.0%，而荔枝果皮花色苷60℃及100℃處理其降解半衰期分別為10.1h與2.56h[26]。pH≤7.0的陰香花色苷溶液在室內(nèi)散射光與黑暗下貯存40d的保存率均大于90%，紅心蘿卜花色苷pH5.0溶液貯存30d的保存率低于60%[25]。陰香花色苷光譜圖中300～350nm光區(qū)吸收峰非常明顯，表明陰香花色苷結(jié)構(gòu)存在?；云漕伾臒?、室內(nèi)散射光與酸性條件下的穩(wěn)定性較好[22]。

3.2 低濃度的NaCl及FeSO4分別具有明顯的護(hù)色與增色效果

陰香花色苷以NaCl低于 0.01mol/L的溶液處理貯存40d時(shí)保存率與初始值的差異不顯著，而陰香花色苷在0.001mol/L的FeSO4溶液中貯存40d保存率比初始值高，且差異極顯著，表明低濃度NaCl與FeSO4溶液對(duì)陰香花色苷分別具有護(hù)色與增色效果作用。

3.3 陰香花色苷對(duì)KCl、CuSO4敏感

陰香花色苷在0.1mol/L以下的CuSO4與KCl溶液中，保存率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯下降，與無鹽溶液花色苷的保存率差異極顯著，表明CuSO4與KCl均具有加速陰香花色苷降解的作用。

3.4 高濃度ZnSO4、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2具加速花色苷降解的作用

陰香花色苷在高于0.05mol/L的Ca(NO3)2、0.01mol/L的 ZnSO4及Mg(NO3)2溶液中，貯存期花色苷的保存率顯著低于不含無機(jī)鹽的對(duì)照溶液的保存率，但在低濃度的上述鹽溶液對(duì)花色苷的保存率無影響。

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Effects of Physical Factors and Mineral Salts on Stability of Anthocyanins fromCinnamoummum burmanniiFruits

HUANG Si-mei1，ZHANG Jing1，ZHANG Jing-wei2
(1. School of Life Sciences, Jiaying University, Meizhou 514015, China；2. Guangdong Shanwei Biomedical Group Co. Ltd., Meizhou 514015, China)

TS214.9

A

1002-6630(2010)13-0069-05

2009-10-17

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009B011300015)；廣東省梅州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2006A11)

黃思梅(1968—)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品及植物生理生化研究。E-mail：hsimei@jyu.edu.cn