栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)與代謝成分的影響

林弋凱 朱玉球 斯金平 秦郞 諸燕 吳令上 劉京晶 ??

[摘要]為明確栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛的生長(zhǎng)及代謝成分的影響，對(duì)鐵皮石斛C13品系在巖壁附生、梨樹附生和設(shè)施盆栽3種栽培環(huán)境下進(jìn)行形態(tài)特征、顯微結(jié)構(gòu)、多糖和浸出物含量的觀察與分析。結(jié)果表明，生長(zhǎng)環(huán)境顯著地影響鐵皮石斛的生長(zhǎng)，在農(nóng)藝性狀上，巖壁附生和梨樹附生的鐵皮石斛葉片稀少、顏色由綠變紫紅、伸展角度減小，莖稈多呈紫色、較粗壯，莖長(zhǎng)分別為34，40 cm，普遍比設(shè)施盆栽（75 cm）短，且根系特別發(fā)達(dá)；在顯微結(jié)構(gòu)上，野外生長(zhǎng)的鐵皮石斛與設(shè)施栽培比均表現(xiàn)出葉片增厚、上表皮厚度增加、下表皮表皮毛叢生、氣孔小而密，根被細(xì)胞、外皮層、內(nèi)皮層的細(xì)胞壁均偏厚，且根被、外皮層、內(nèi)皮層、髓部的細(xì)胞小且排列緊密，但栽培環(huán)境沒有產(chǎn)生特異性的組織結(jié)構(gòu)，主要是結(jié)構(gòu)參數(shù)大小和數(shù)量的變化，說明鐵皮石斛具有很好的環(huán)境適應(yīng)能力；此外，生長(zhǎng)環(huán)境顯著地影響鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物等代謝成分的積累，巖壁附生鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)3734%，1166%，梨樹附生次之，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3390%，962%，均高于設(shè)施盆栽；通過HPLC分析，巖壁附生鐵皮石斛中醇溶性浸出物成分比另外2種栽培模式更加復(fù)雜，說巖壁附生栽培環(huán)境更有利于鐵皮石斛次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。

[關(guān)鍵詞]鐵皮石斛； 栽培環(huán)境； 形態(tài)特征； 顯微結(jié)構(gòu)； 代謝成分

Effects of cultivation environments on Dendrobium catenatum

LIN Yikai1， ZHU Yuqiu2， SI Jinping1*， QIN Lang2， ZHU Yan3，WU Lingshang1， LIU Jingjing1

（1State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang A & F University， Lin′an 311300， China；

2 Anhui Mulongshan Ecotourism Development Co， Ltd， Quanjiao 239500， China；

3Hangzhou Zhenheng Biotechnology Co， Ltd， Lin′an 311300， China）

[Abstract]The study was aimed to clarify the effect of three cultivation environments on the growth and metabolism of Dendrobium catenatum C13 group There were three different cultivation conditions including rock epiphytic cultivation， pear epiphytic cultivation and pot cultivation Morphological characteristics and agronomic characters of D catenatum were observed and measured Microstructure， contents of polysaccharide and alcoholsoluble extracts were measured by paraffin section method， phenolsulfuric acid method and hotdip method， respectively The result showed that the cultivation environment significantly affected the growth of D catenatum， the leaves of D catenatum that cultivated on the rock and pear were sparse and small， the stems were short and purple and the root system was developed Compare with potted cultivation， D catenatum from rock epiphytic cultivation and pear epiphytic cultivation showed the following characteristics in the microstructure： the upper epidermis became thicker， the epidermal hair in the epidermis became denser， stomatal showed smaller and denser， the cell wall of exodermis， endoderm and medulla became thicker， the cell of velamen， exodermis， endoderm and medulla were smaller and arranged more closely， but the cultivation environment did not produce specific tissue structure， mainly changed in the structural parameters of size and quantity The growth environments also influenced contents of polysaccharides and alcoholsoluble extracts The dontents of polysaccharides and alcoholsoluble extracts in D catenatum from rock epiphytic were the highest， reached 3734% and 1166%， the second was pear epiphytic， both higher than pot cultivation， alcoholsoluble extracts contents in D catenatum from rock epiphytic are more complex， which shows that rock epiphytic is conducive to the accumulation of secondary metabolites in D catenatumendprint

[Key words]Dendrobium catenatum； cultivition environment； morphological characteristics； microstructure； effective components

鐵皮石斛Dendrobium catenatum （D officinale）是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、滋陰清熱、益胃生津等功效[13]。因過度采挖與生境破壞，野生鐵皮石斛資源已近枯竭。進(jìn)入新世紀(jì)以來，隨著栽培技術(shù)不斷突破，鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，不同栽培模式應(yīng)運(yùn)而生[46]，栽培模式對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)與產(chǎn)品質(zhì)量的影響成為關(guān)注的熱點(diǎn)。本文用鐵皮石斛C13品系，開展了設(shè)施盆栽、巖壁附生、活樹附生（梨樹）3種環(huán)境下外觀形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、代謝成分的變異規(guī)律的研究。

1材料與方法

11供試樣品

栽培品種為本課題組選育的鐵皮石斛C13品系[7]，2012年11月采集種子，在浙江農(nóng)林大學(xué)組培室無菌播種，2013年8月瓶苗移栽到設(shè)施大棚馴化種植。2015年3月將大棚種植苗分別移栽至花盆、巖壁、梨樹栽培，進(jìn)行統(tǒng)一的管理。

12儀器與試劑

UV2550紫外可見分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；D37520快速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；MilliQ Academic超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；Leica熒光顯微鏡（DM4000）；無水乙醇和苯酚均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。碘和碘化鉀購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

13試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于浙江省臨安市天目山鎮(zhèn)橫塘村麻泥角弄（東經(jīng)119°26′11″，北緯30°20′30″，海拔280 m），系鐵皮石斛自然分布區(qū)的北緣，常年年均氣溫164 ℃，其中2016年最高溫達(dá)37 ℃、最低溫達(dá)-10 ℃，降水日158 d，無霜期237 d，受寒潮、臺(tái)風(fēng)等極端天氣的影響。

14栽培環(huán)境

141設(shè)施盆栽設(shè)施塑料薄膜連拱大棚高55 m，長(zhǎng)寬均為40 m，遮陽(yáng)率50%，2015年3月種植，塑料花盆上口直徑15 cm，高13 cm，擺放在高90 cm的移動(dòng)苗床上，以松樹皮為基質(zhì)，厚度為9～11 cm。種植平面2016年1月平均溫度達(dá)70 ℃，最低溫達(dá)-73 ℃；2016年7月平均溫度達(dá)293 ℃，最高溫達(dá)431 ℃。在鐵皮石斛的生長(zhǎng)季節(jié)，晴天每天噴霧1～2 h，當(dāng)鐵皮石斛越冬期時(shí)，每隔2～3 d噴霧1次，夏季加強(qiáng)棚內(nèi)通風(fēng)，減少病害的發(fā)生。

142巖壁附生2015年3月種植在高為2 m的90°的巖壁上，種植密度20 cm×20 cm，采用包裝帶固定至2015年9月，試驗(yàn)地上方無遮擋物，栽培過程中不用任何基質(zhì)，不施加任何肥料。種植后生長(zhǎng)季節(jié)晴天每天噴霧1～2 h，通過水分調(diào)控改善環(huán)境的濕度與溫度，2016年1月巖壁附生栽培環(huán)境平均溫度為44 ℃，最低溫達(dá)-148 ℃；2016年7月平均溫度達(dá)300 ℃，最高溫達(dá)481 ℃。

143梨樹附生以梨樹為活樹附生的載體，2015年3月將鐵皮石斛附生于樹齡20年左右梨樹的樹干、樹枝、樹杈上，用梨樹的樹木枝葉進(jìn)行遮陰，用麻繩綁住鐵皮石斛的根莖處，間隔30 cm捆1層，層內(nèi)叢距8～10 cm，種植后生長(zhǎng)季節(jié)晴天每天噴霧1～2 h。2016年1月梨樹附生栽培環(huán)境平均溫度為39 ℃，最低溫達(dá)-136 ℃；2016年7月平均溫度達(dá)298 ℃，最高溫達(dá)443 ℃。

15外觀形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)觀察

2016年4月分別測(cè)定設(shè)施盆栽、巖壁附生、梨樹附生3種環(huán)境鐵皮石斛各個(gè)生理年齡的萌糵數(shù)量、莖節(jié)數(shù)，用直尺和數(shù)顯游標(biāo)卡尺分別測(cè)量二年生、三年生萌糵的莖高和莖粗，測(cè)定二年生萌糵的葉片數(shù)量、葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、莖粗，5株為1組，重復(fù)3次。

采用常規(guī)石蠟切片法觀測(cè)葉片與根的顯微結(jié)構(gòu)[8]，2016年8月分別采集3種環(huán)境鐵皮石斛葉片（從上向下數(shù)第4片葉）和根（距離根尖2～5 cm處），制作石蠟切片，采用番紅固綠復(fù)染法分別對(duì)材料進(jìn)行染色，中性樹膠封片，Leica熒光顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照。

采用氣孔保衛(wèi)細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)法方法觀測(cè)葉片氣孔的變化 2016年10月分別采摘鐵皮石斛葉片（從上向下數(shù)第4片葉），迅速放入裝有固定液（無水乙醇冰乙酸3∶1）的樣品瓶中，靜置至葉片褪色發(fā)白；將褪色的葉片剪成上、中、下三等分，取中部的葉片置于無菌水中，浸泡約3 min后取出，置于載玻片上，用1%碘碘化鉀溶液染色，蓋上蓋玻片后立即用Leica熒光顯微鏡觀測(cè)葉片的下表皮[9]。3個(gè)環(huán)境各設(shè)立3個(gè)重復(fù)，用Leica熒光顯微鏡在每張玻片中隨機(jī)采集5張圖片。用顯微鏡中的標(biāo)尺測(cè)量每張圖片中每個(gè)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度、寬度和氣孔個(gè)數(shù)，用橢圓的周長(zhǎng)近似公式計(jì)算葉片氣孔及2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞組成整體的外周周圍長(zhǎng)（L）[10]。用SPSS 180軟件處理數(shù)據(jù)，并進(jìn)行方差分析，標(biāo)注顯著性差異結(jié)果。

16代謝成分分析

2016年4月25日分別采集3種栽培環(huán)境的鐵皮石斛二年生和三年生萌條，每個(gè)栽培環(huán)境采樣不少于25個(gè)萌條，每叢植株各采集1條二年生和三年生萌條，重復(fù)3次。將采集的樣品莖葉分離，100 ℃殺青后，置于60 ℃烘箱內(nèi)烘至恒重，粉碎過60目篩后保存于干燥器中待用。采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（一部）附錄ⅤA項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定醇溶性浸出物含量。3種環(huán)境莖醇溶性成分參照朱波等的方法[11]。

2結(jié)果與分析

21栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛形態(tài)特征與農(nóng)藝性狀的影響

鐵皮石斛C13在設(shè)施盆栽、巖壁附生、梨樹附生3種環(huán)境中均能正常生長(zhǎng)發(fā)育，但環(huán)境條件對(duì)形態(tài)特征與農(nóng)藝性狀影響十分明顯（表1）。

從表1可見，3種環(huán)境的莖稈長(zhǎng)度差異明顯，設(shè)施盆栽的二年生平均株高75 cm，明顯高于梨樹附生和巖壁附生的34，40 cm，3種環(huán)境莖粗沒有顯著差異；設(shè)施盆栽葉片繁茂且顏色呈深綠色，莖稈呈淺綠色，巖壁附生和梨樹附生葉片稀少，葉片長(zhǎng)和寬明顯小于設(shè)施盆栽，二年生莖稈和葉片的顏色多呈紫紅色，說明設(shè)施栽培的遮陽(yáng)功能有利于莖稈的高生長(zhǎng)，巖壁附生和梨樹附生因陽(yáng)光直射影響葉片色素的合成與比例大小。endprint

3種環(huán)境的根系分布存在顯著差異：設(shè)施盆栽根系直立向下，多數(shù)扎在基質(zhì)之中；巖壁附生的根系特別發(fā)達(dá)，根系呈扁平狀、無吸盤，緊貼著巖壁向四周發(fā)散，根系偶有分叉；梨樹附生的根系多數(shù)彎曲的扎入梨樹樹皮中，體現(xiàn)了鐵皮石斛根對(duì)3種環(huán)境的生態(tài)適應(yīng)性（圖1）。

22栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛顯微結(jié)構(gòu)的影響

221栽培環(huán)境對(duì)葉的影響鐵皮石斛的葉片由表皮、葉肉和葉脈3部分組成，3種不同環(huán)境的鐵皮石斛葉的上、下表皮均有1層近方形的生活細(xì)胞組成，上表皮細(xì)胞略大于下表皮細(xì)胞，上表皮無表皮毛、下表皮表皮毛叢生。氣孔僅分布于下表皮，不同栽培環(huán)境下葉片解剖結(jié)構(gòu)主要參數(shù)存在顯著差異（表2）。

從表2可見，大棚栽培的氣孔長(zhǎng)、外周長(zhǎng)平均達(dá)到3625，13750 μm，均極顯著高于巖壁栽培和梨樹附生，而3個(gè)栽培環(huán)境之間的氣孔寬差異不顯著。梨樹附生、巖壁附生、大棚栽培的氣孔密度分別每平方毫米為10235，7053，5348個(gè)，三者存在極顯著差異。氣孔密度與外周長(zhǎng)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，氣孔外周長(zhǎng)越大，氣孔密度就越?。▓D2）。為適應(yīng)野外強(qiáng)光和干旱環(huán)境，氣孔密度明顯增大、氣孔周長(zhǎng)減小。

3種栽培環(huán)境的鐵皮石斛葉肉均沒有明顯分化為海綿組織和柵欄組織，巖壁附生和梨樹附生的葉片厚度、葉肉厚度、上表皮厚度均顯著大于大棚栽培

從圖4可見，生長(zhǎng)于3種環(huán)境的鐵皮石斛根的根被細(xì)胞層數(shù)不同。梨樹附生和巖壁附生的鐵皮石斛根被細(xì)胞層數(shù)為3～4層，而大棚栽培的根被細(xì)胞層數(shù)為3～7層、排列不規(guī)則，且最外層多了一層排列緊密的生活細(xì)胞；巖壁附生和梨樹附生的細(xì)胞壁明顯加厚，且?guī)r壁附生的細(xì)胞壁表現(xiàn)為最厚。大棚栽培的鐵皮石斛根被層里的細(xì)胞大、排列疏松；巖壁附生和梨樹附生的根被層里的細(xì)胞小且排列緊密，且在根與巖壁或梨樹的接觸面的細(xì)胞表現(xiàn)的最為明顯。

3種環(huán)境鐵皮石斛的外皮層均由一層徑向延長(zhǎng)、排列緊密的馬蹄形細(xì)胞組成且細(xì)胞壁加厚，中間偶爾夾雜著幾個(gè)近方形的通道細(xì)胞，是植物養(yǎng)分和水分的交換通道。但大棚栽培的外皮層細(xì)胞較巖壁附生和梨樹附生的細(xì)胞大且排列疏松。巖壁附生和梨樹附生的外皮層與大棚栽培有明顯的差異，在與巖壁或梨樹的接觸面，外皮層細(xì)胞呈直線排列且極為緊密，而大棚栽培的地下根的外皮層整體呈類圓形，充分體現(xiàn)了鐵皮石斛對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性。大棚栽培的皮層薄壁細(xì)胞均比其他環(huán)境小且排列疏松。

皮層以內(nèi)，根的中心部分為中柱，由中柱鞘、維管束和髓組成。3個(gè)不同環(huán)境鐵皮石斛的維管束結(jié)構(gòu)有顯著差異。生長(zhǎng)于3個(gè)不同的環(huán)境，木質(zhì)部的發(fā)育程度也不同，大棚栽培的木質(zhì)化程度最高，占中柱的比例最大。

23栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛代謝成分的影響

231栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛多糖和浸出物的影響多糖和醇溶性浸出物含量是鐵皮石斛主要的有效成分，是評(píng)價(jià)鐵皮石斛品質(zhì)的主要指標(biāo)，栽培環(huán)境顯著地影響多糖和浸出物的含量（表3）。

從表3可見，梨樹附生和巖壁附生的鐵皮石斛二年生和三年生多糖和醇溶性浸出物含量均高于設(shè)施盆栽，且?guī)r壁附生的多糖含量最高，二年生和三年生多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到3734%，3663%比設(shè)施盆栽高447%，1047%；醇溶性含量比設(shè)施盆栽高353%，263%。鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量與生理年齡密切相關(guān)，3個(gè)環(huán)境的鐵皮石斛二年生多糖含量均顯著高于三年生。設(shè)施盆栽、梨樹附生、巖壁附生二年生多糖含量比三年生分別高661%，358%，071%。二年生和三年生巖壁附生的多糖和醇溶性浸出物總量最高，均高于設(shè)施盆栽和梨樹附生。

232栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛莖醇溶性成分的影響通過HPLC分析，3個(gè)栽培環(huán)境的鐵皮石斛莖醇溶性成分有明顯差異（圖5）。巖壁附生的鐵皮石斛特征峰最多，達(dá)10個(gè)，其中，6，12，13，14號(hào)峰分離度較好，且是巖壁附生獨(dú)有的差異特征峰，4，5，8號(hào)峰是大棚栽培特有的特征峰；1，2，3號(hào)峰為梨樹附生特有的特征峰，而11號(hào)峰是生長(zhǎng)于3種環(huán)境下鐵皮石斛莖共有的特征峰，其三年生峰面積均高于二年生，說明該成分的含量隨著年份的增加而累積。

3結(jié)論與討論

生長(zhǎng)環(huán)境顯著地影響鐵皮石斛的生長(zhǎng)，野外惡劣環(huán)境下巖壁附生和梨樹附生的鐵皮石斛整叢植株逐漸變成紫紅色，而且葉片稀少、伸展角度的減小，莖條粗壯矮小，根系特別發(fā)達(dá)，生物量明顯低于設(shè)施盆栽；野生環(huán)境下的鐵皮石斛在組織結(jié)構(gòu)上明顯不同于設(shè)施栽培，均表現(xiàn)出葉片增厚、上表皮厚度增強(qiáng)、下表皮表皮毛叢生、氣孔小而密，根被細(xì)胞、外皮層、內(nèi)皮層的細(xì)胞壁偏厚，且根被、外皮層、內(nèi)皮層、髓部的細(xì)胞小且排列緊密，以利于增強(qiáng)保溫作用、減少水分蒸騰、降低強(qiáng)光在葉肉的通量、減少?gòu)?qiáng)光對(duì)葉表皮的損傷、有利于提高水分利用效率、維持光合效率，體現(xiàn)出鐵皮石斛對(duì)野外低溫、強(qiáng)光環(huán)境的適應(yīng)性。

次生代謝物質(zhì)積累與環(huán)境關(guān)系密切[12]，在3種生長(zhǎng)環(huán)境下，巖壁附生鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量最高，梨樹附生次之，均高于設(shè)施盆栽。說明巖壁附生的栽培環(huán)境更有利于鐵皮石斛次生代謝產(chǎn)物的積累；另外，巖壁附生鐵皮石斛中醇溶性物質(zhì)組成比另外2種栽培模式樣品復(fù)雜，不同的野外環(huán)境影響植物的次生代謝途徑，導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物組成不同。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]endprint