液相芯片鑒別檢測7種出血性大腸埃希菌血清型

陶 虹，陳 兵，孫 潔，唐金明，林慶燕，曹琛福，呂建強(qiáng)，楊俊興，花群義，秦智鋒＊

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳518045；2.深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳518001）

食源性疾病是指通過攝食而進(jìn)入人體的有毒有害物質(zhì)等致病因子所造成的疾病，其中尤以細(xì)菌性疾病為主要病因。在細(xì)菌性食源性疾病中，以腸出血性大腸埃希菌（Shiga toxin-producingEscherichiacoli，STEC）引發(fā)的食品安全事件最為常見。STEC主要寄居在動物腸道中，致病性強(qiáng)，約70%的STEC感染是由6種主要的血清型（O26、O45、O103、O111、O121和 O145）引發(fā)［1］。目前，許多保守序列已被應(yīng)用到STEC的分子生物學(xué)檢測中，如uidA、fliC、rfb、ehxA、wzx、wbdI、ihpl和 wzy等［2］。液相芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代后期發(fā)展起來的高通量檢測技術(shù)，具有高通量、樣本用量少、操作簡單快速、靈敏度高、檢測范圍廣、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、費用低及靈活的優(yōu)點，是近年來最受關(guān)注的臨床高通量檢測技術(shù)。目前液相芯片系統(tǒng)在食源性致病菌的快速檢測方面的應(yīng)用研究已經(jīng)展開，初步研究顯示該系統(tǒng)能夠在短時間內(nèi)（6h～8 h）對多種常見食源性致病菌進(jìn)行準(zhǔn)確、快速和定量檢測。

本研究以 O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145等7種血清型的出血性大腸埃希菌為檢測對象，建立了基于多重擴(kuò)增和液相芯片的7種血清型大腸埃希菌的快速高通量檢測技術(shù)。通過對所建方法的靈敏度、特異性進(jìn)行評估，以確定所建方法在食源性致病菌快速高通量檢測的適用性和可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)菌 大腸埃希菌 O121（菌種編號：CVCC2071）、大腸埃希菌 O111（菌種編號：CVCC1450）、大腸埃希菌 O103（菌種編號：CVCC1442）、大腸埃希菌O45（菌種編號：CVCC1514），均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；大腸埃希菌O157，由深圳檢驗檢疫局實驗室分離保存；大腸埃希菌O145及O26，由深圳疾病預(yù)防控制中心饋贈。

1.1.2 試劑 HotStarTaqPlus Master Mix Kit、Strep tavidin-PE，Qiagen公司產(chǎn)品；編號為34、36、37、38、42、43、45液相芯片微球、5mol／L TMAC、200g／L Sarkosyl、1mol／L Tris-HCl、0.15mol／L EDTA，Luminex公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 Veriti PCR儀，Applied Biosystems公司產(chǎn)品；Liquichip 200液相芯片檢測工作站，Qiagen公司產(chǎn)品；GAS7001X凝膠成像分析儀，UVItech公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物探針的設(shè)計與合成 參考GenBank數(shù)據(jù)庫中 O26 型（GenBank：AB903790.1）、O45型（GenBank：AY771223.1）、O103 型（GenBank：AJVQ01000264.1）、 O111 型（GenBank：AB903203.1）、O121型（GenBank：AB903874.1）、O145型（GenBank：AY863412.1）、O157型（Gen-Bank：AB903734.1）等STEC的核苷酸序列，利用DNA Star生物軟件進(jìn)行同源性分析比較，篩選出特異性針對各個血清型的STEC基因中相對保守且高度特異的核苷酸片段，設(shè)計出針對O26型、O45型、O103型、O111型、O121型、O145型和O157型的特異性引物和探針，并在上下游引物的5′端分別加入通用引物，探針的5′端偶聯(lián)NH2。通用引物的下游引物5′端標(biāo)記生物素。7種菌株的引物及探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，各個血清型的引物見表1。

1.2.2 細(xì)菌復(fù)蘇與DNA抽提 用接種環(huán)蘸取各個菌種，于麥康凱瓊脂（MacConkey Agar）平板上劃線，37℃過夜。挑選大腸埃希菌特征性的單菌落，于營養(yǎng)肉湯中過夜培養(yǎng)。將各個血清型的細(xì)菌培養(yǎng)液取3mL～5mL，10 000r／min離心5min，收集菌體沉淀。菌體沉淀重懸于100μL無菌ddH2O中，煮沸15min。10 000r／min離心5min，取上清液作為核酸模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 7種血清型STEC單重PCR擴(kuò)增 分別以O(shè)26型、O45型、O103型、O111型、O121型、O145型和O157型菌株核酸為模板，按照Qiagen PCR Kit Handbook推薦的方法配置PCR反應(yīng)液：每個50μL的反應(yīng)體系中包含10× Qiagen PCR buffer 5μL，dNTP mix（10mmol／L）2μL，上、下游超級引物混合液（80μmol／L）1.5μL，特異性引物1.5μL，TaqDNA聚合酶2μL，模板5μL。于PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng)程序擴(kuò)增：95℃5min；94℃30s，52℃1min，72℃1min，15個循環(huán)；94℃30s，70℃1min 30s，6個循環(huán)；94℃20s，55℃30s，72℃20s，35個循環(huán)；72℃10min。

表1 O血清型的引物與預(yù)期擴(kuò)增片段Table 1 Primers of O serogroup of STEC and amplification fragment

1.2.4 7種血清型STEC多重PCR擴(kuò)增 將7種菌株全部混合后抽提核酸，按照1.2.3PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在反應(yīng)體系中，同時加入7種血清型的特異性引物后進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，同時設(shè)定陰性對照。

1.2.5 STEC液相芯片檢測

1.2.5.1 熒光編碼微球與探針偶聯(lián) 將編號為34、36、37、38、42、43和45的液相芯片熒光微球，分別與O26、O45、O103、O111、O121、O145和 O157的特異性探針進(jìn)行共價鍵偶聯(lián)，探針與微球?qū)?yīng)關(guān)系見表2。偶聯(lián)程序參照Luminex推薦操作步驟進(jìn)行。將所有試劑恢復(fù)至室溫，用0.1mol／L MES（pH 4.5）將寡核苷酸探針稀釋至0.2mmol／L。先將熒光編碼微球貯存液用旋渦振蕩重懸，后取200μL熒光編碼微球貯存液（5×106）至1.5mL的聚丙烯微量離心管中，10 000r／min離心5min。棄上清，加入50μL的0.1mol／L MES后振蕩混勻，再加入0.2 nmol寡核苷酸探針，吹打混勻。加入10μL新鮮配制的10mg／mL EDC溶液，混勻后室溫避光孵育30 min，再次加入相同量的EDC繼續(xù)孵育30min。加入1.0mL的吐溫-20（0.2g／L W／V）混勻洗滌，10 000r／min離心10min沉淀微球［3-4］。棄上清后加入1.0mL的SDS（1g／L W／V）混勻洗滌后再次10 000r／min離心10min沉淀微球。加入適量0.1mol／L MES，采用血球計數(shù)法對制備的熒光編碼微球偶聯(lián)物進(jìn)行計數(shù)，計算出熒光編碼微球的濃度，用MES將熒光編碼微球稀釋成5 000個／μL，于2℃～8℃避光保存。

表2 O血清型探針與不同熒光編碼微球?qū)?yīng)表Table 2 Correspond table of different code microspheres to probes of O serogroup

1.2.5.2 液相芯片檢測 將各個偶聯(lián)好探針的熒光編碼微球振蕩混勻，分別取各種微球10μL混合，用1.5×TMAC雜交液將每個編碼微球進(jìn)一步稀釋成200個／μL。在每個樣品孔和背景孔，加入33μL混合熒光編碼微球工作液；對每個背景孔，加入17μL TE（pH 8.0）作為空白對照；對每個樣品孔，加入12μL TE、5μL PCR反應(yīng)液。將各孔反復(fù)吹打混勻，于PCR儀中進(jìn)行如下反應(yīng)：95℃5min，46℃ 15min。雜交結(jié)束后，10 000r／min離心3min。同時用1×TMAC雜交液將SA-PE稀釋至2μg／mL，制成報告混合液。離心結(jié)束后，棄上清加入75μL的報告混合液，吹打幾次混勻，于PCR儀上40℃孵育5min［5-6］。按照Luminex公司推薦的儀器檢測步驟，設(shè)置儀器每次只檢測相應(yīng)編碼的熒光編碼微球，將上樣加熱陶瓷底板預(yù)先加熱至40℃后取樣品上機(jī)進(jìn)行檢測。

根據(jù)Luminex公司推薦的判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)每種熒光編碼微球個數(shù)不少于20個且背景空白熒光強(qiáng)度不高于3 000，試驗成立，進(jìn)行結(jié)果判定。液相芯片定性比值結(jié)果（Luminex qualitative ratio result，LQRR）等于樣品的校正后的熒光強(qiáng)度中位值（median florescence intensity，MFIs）與空白對照 MFI的平均值（MFIb）的比值，即LQRR＝MFIs／mMFIb。如果LQRR≥3，判定為陽性樣本；如果2≤LQRR≤3，則判定為可疑；如果LQRR＜2，則判定為陰性。

1.2.6 7種血清型STEC液相芯片檢測方法的評價

1.2.6.1 靈敏性試驗 將7種血清型的大腸埃希菌細(xì)菌培養(yǎng)液混合，從原液開始10倍系列稀釋至1010，抽提每個稀釋度的混合核酸。采用所建立的7種血清型STEC液相芯片檢測方法進(jìn)行靈敏度試驗。鑒于7種血清型腸出血性大腸埃希菌均產(chǎn)生產(chǎn)志賀毒素，因此采用市售的“腸出血性大腸埃希菌STX熒光PCR檢測試劑盒”進(jìn)行靈敏度檢測，對比兩者的靈敏度。

1.2.6.2 特異性試驗 取營養(yǎng)肉湯、沙門菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌樣品經(jīng)核酸抽提儀抽提核酸，進(jìn)行7種血清型STEC液相芯片檢測，評價該法的特異性。

1.2.6.3 小樣試驗 從美國、法國等國家進(jìn)口的凍肉中采集樣品，采用經(jīng)典的細(xì)菌分離鑒定方法分離鑒定細(xì)菌。同時對細(xì)菌的預(yù)培養(yǎng)液采用所建立的液相芯片檢測方法進(jìn)行平等檢測，共檢測樣品20份。探討該法的田間實用性及可靠性。

2 結(jié)果

2.1 7種血清型STEC PCR擴(kuò)增結(jié)果

在50μL 反應(yīng)體系中，O157、O145、O121、O111、O103、O45和O26血清型大腸埃希菌的單項PCR可特異性分別擴(kuò)增出相應(yīng)血清型的目的片段，片段大小分別為 115、292、234、219、149、255、248bp。將7種血清型出血性大腸埃希菌菌株引物混合，同時檢測7個血清型菌株混合樣品，經(jīng)多重PCR擴(kuò)增，可特異性擴(kuò)增出多重目的片段（圖1）。

圖1 7種血清型大腸埃希菌PCR擴(kuò)增結(jié)果圖Fig.1 Amplification results of PCR for seven O serotypes of STEC

2.2 7種血清型STEC液相芯片檢測結(jié)果

2.2.1 液相芯片檢測單個血清型STEC的結(jié)果 將各個血清型的探針與相應(yīng)熒光編碼的熒光編碼微球偶聯(lián)，分別只與各個血清型相應(yīng)的PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物直接雜交后，進(jìn)行單血清型液相芯片檢測。結(jié)果各個參與計數(shù)的熒光編碼微球均≥20個，表明用于計數(shù)的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的MFI值可信。各個熒光編碼微球的空白對照MFIB介于108～308之間，均＜3 000，表明結(jié)果有效，試驗可以進(jìn)行結(jié)果判定。PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的MFIS介于5 321～8 978。探針與相應(yīng)的PCR擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物之間均有特異性的雜交，LQRR值介于17～63之間，表明均為陽性。各個單血清型檢測的MFI值和相應(yīng)的LQRR結(jié)果見表3。

表3 單血清型液相芯片檢測MFI值Table 3 MFI value of Luminex for single serotype

2.2.2 液相芯片同時檢測七個血清型STEC的結(jié)果 將7種血清型菌株多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，直接與混合探針進(jìn)行雜交，結(jié)果各個編碼的熒光微球均≥20個，空白對照 MFIb＜3 000，表明試驗成立，可以進(jìn)行判定?；旌衔⑶蚺c多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的 MFI介于9 312～15 321，LQRR值介于11～23之間，表明均為陽性。檢測7種血清型菌株的MFI值和相應(yīng)的LQRR結(jié)果見表4。

表4 7種血清型菌株液相芯片同時檢測的MFI值Table 4 MFI value of Luminex for seven serogroups mixture

2.2.3 7種血清型STEC液相芯片檢測方法的評介

2.2.3.1 靈敏性試驗結(jié)果 采用所建立的7種血清型STEC液相芯片檢測方法檢測10倍系列稀釋的大腸埃希菌培養(yǎng)混合液，可檢測到104稀釋度。腸出血性大腸埃希菌STX熒光PCR檢測試劑盒檢測10倍系列稀釋的大腸埃希菌細(xì)菌培養(yǎng)混合液，可檢測到106稀釋度（圖2）。所建立的液相芯片檢測方法的靈敏度比市售熒光PCR檢測試劑盒靈敏度低100倍。

2.2.3.2 特異性試驗結(jié)果 采用所建立的7種血清型STEC液相芯片檢測方法檢測營養(yǎng)肉湯、沙門菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等樣品抽提的核酸，其的LQRR值介于1～1.6之間，均小于臨界值2，表明所建立方法比較特異。

圖2 腸出血性大腸埃希菌STX熒光PCR檢測試劑盒的靈敏度測定結(jié)果Fig.2 Sensitivity test of STX real-time PCR kit for seven serogroup mixture

2.2.3.3 小樣試驗 通過對美國、法國等國家進(jìn)口的凍肉90份樣品進(jìn)行檢測，共檢測出O157陽性樣品3份，與細(xì)菌的常規(guī)檢測方法（熒光PCR篩選檢測—細(xì)菌分離鑒定方確證）結(jié)果一致。表明所建立方法具有一定的實用性。

3 討論

目前，STEC細(xì)菌的常規(guī)檢測方法為先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后用腸出血性大腸埃希菌熒光定量PCR進(jìn)行篩選，然后用經(jīng)典的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法進(jìn)行確證。整個檢測流程比較繁瑣，包括細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)、劃線培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等步驟，耗時較長，檢測通量較低，不能滿足快速通關(guān)的需求［7］。而近年來液相芯片技術(shù)等現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的出現(xiàn)很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足，可實現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效的檢測，是細(xì)菌微生物快速高通量檢測的趨勢之一。在細(xì)菌的快速分子生物學(xué)檢測中，基于PCR和熒光定量PCR的檢測逐步占據(jù)大規(guī)模篩選檢測市場，盡管PCR檢測具有快速、靈敏的特點，但由于腸出血性大腸埃希菌有較多的O型，在分型鑒定時就比較繁瑣。我們所建立的7種血清型的出血性大腸埃希菌液相芯片經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)后，即可從分子的角度對覺的7種血清型進(jìn)行分型鑒定，具有高通量、操作簡單快速、特異性強(qiáng)的特點［8］。當(dāng)然，由于同時對7種血清型進(jìn)行分型鑒定，其的靈敏度與常規(guī)熒光定量PCR相比低了100倍。由于采用液相芯片進(jìn)行檢測時，檢測樣品是經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的菌液，從一定程度上解決了液相芯片檢測靈敏度較低的缺點。本研究以真正實現(xiàn)快速、集成、高通量的檢測目的，進(jìn)行菌株的分型，建立的一種高度敏感、特異及簡便的檢測平臺，并將建立的方法應(yīng)用于日常的監(jiān)測具有重要的意義。

目前國內(nèi)沒有同時檢測7種出血性大腸埃希菌的報道，國外也沒有這種商品化的檢測試劑盒。本研究設(shè)計了針對出血性大腸埃希菌O103、O111、O121、O145、O26、O45和O157等7種血清型的分型引物和探針，建立了出血性大腸埃希菌PCR檢測方法，并將出血性大腸埃希菌分型PCR檢測方法與液相芯片檢測方法結(jié)合，形成了一次多重擴(kuò)增，結(jié)合液相芯片同時檢測區(qū)分7種血清型的高能量檢測方法。所建出血性大腸埃希菌快速高通量分型檢測方法檢測通量高，可一次對出血性大腸埃希菌O103、O111、O121、O145、O26、O45和O157等7種血清型進(jìn)行分型鑒定。液相芯片技術(shù)具有顯而易見的高通量特征，理論上可以同時檢測100個目標(biāo)菌，但是要真正實現(xiàn)這一目標(biāo)還有必要進(jìn)一步探索研究。因為高達(dá)100種微球混在一起時，微球之間顏色差別變小，存在一定的干擾，檢測儀無法完全區(qū)分開來，而且微球種類多帶來較高的背景信號，影響低濃度樣本的判斷。

綜上所述，本研究所建立的方法快速，出血性大腸埃希菌分型檢測可在6h內(nèi)完成。所建方法特異性強(qiáng)，通過兩個引物和一個探針來確保各個血清型的特異性，搭建了出血性大腸埃希菌全新快速高通量檢測平臺，為其他病原體的快速高通量檢測提供了借鑒和經(jīng)驗。

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