湖北部分地區(qū)規(guī)模化蛋雞場(chǎng)H9亞型禽流感疫苗免疫效果調(diào)查

汪招雄，歐陽(yáng)金旭，楊玉瑩，張平英，程太平，盧文婷

（1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；2.湖北省荊州市畜牧獸醫(yī)局，湖北荊州434100）

禽流感是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種急性傳染病，病毒毒力較強(qiáng)時(shí)雞群可表現(xiàn)嚴(yán)重的全身性、出血性、敗血性癥狀，病死率較高；毒力弱時(shí)雞群表現(xiàn)為輕度的呼吸道或消化道癥狀，病死率較低。禽流感病毒不僅威脅禽類的健康，也威脅人類健康，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WHO）將禽流感列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。在我國(guó)，高致病性禽流感以H5N1亞型為代表，低致病性禽流感以H9N2亞型為主。

1994年我國(guó)首次從廣東省雞場(chǎng)中分離到第一株H9N2亞型禽流感病毒，此后，該亞型禽流感病毒迅速向臨近省份蔓延。隨著H9N2亞型滅活疫苗在我國(guó)廣泛應(yīng)用，該病在一定程度上得到有效的控制。然而，在部分地區(qū)，由于防疫意識(shí)不高、免疫程序不合理，該病毒在部分蛋雞場(chǎng)仍然時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致雞群出現(xiàn)呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋率下降，雞蛋品質(zhì)嚴(yán)重下降。本研究從湖北省不同地區(qū)隨機(jī)采集不同日齡蛋雞樣本，監(jiān)測(cè)H9N2亞型禽流感疫苗免疫效果，以期制定符合當(dāng)?shù)仉u群的防控H9N2亞型禽流感免疫程序，減少疫情發(fā)生幾率。

1 材料與方法

1.1 材料

H9N2亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)抗原（生產(chǎn)批號(hào)：201305）、陽(yáng)性血清，中國(guó)哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品；8.5g／L生理鹽水作為稀釋液，紅細(xì)胞保存液（PBS液），38g／L檸檬酸鈉抗凝劑。

1.2 方法

1.2.1 血液血液采集及血清制備 對(duì)湖北不同地區(qū)（公安、京山、沙洋、天門(mén)、浠水、仙桃、襄陽(yáng)區(qū)、孝感、應(yīng)城、棗陽(yáng)）規(guī)模蛋雞場(chǎng)的雞隨機(jī)采血，每只翅下靜脈采血2mL，共采集血樣1 631份。采集血樣靜置1h，待血清析出后，3 000r／min離心5min，取上層血清待檢。

1.2.2 10mL／L紅細(xì)胞懸液制備 用一次性注射器隨機(jī)采取健康非免疫公雞血液，放入加有抗凝劑的離心管中，抗凝劑與全血的比例約為1∶2左右，迅速混勻。然后放入離心機(jī)中以3 000r／min離心5 min，吸管吸去上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再次在離心管中加生理鹽水，慢慢混合均勻，3 000 r／min離心5min，棄去上清液，按照上述方法反復(fù)操作4次～5次，直到上清液澄清透明，最后一次離心后的紅細(xì)胞，棄去上清液，即為紅細(xì)胞泥。放入4.0℃冰箱中可保存2d～3d。每次抗體檢測(cè)時(shí)吸取0.1mL紅細(xì)胞泥，加入9.9mL的生理鹽水，即為10mL／L紅細(xì)胞懸液。注意紅細(xì)胞懸液要現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前需要觀察紅細(xì)胞是否變質(zhì)。

1.2.3 4單位抗原配制 取出凍干的濃縮抗原，加入2mL～3mL生理鹽水稀釋融化后，測(cè)其抗原效價(jià)，能夠完全引起血凝的病毒最高稀釋度視作抗原的效價(jià)，此稀釋度為1個(gè)HA單位抗原，以此稀釋度配制4個(gè)HA單位抗原。

1.2.4 待檢樣品測(cè)定 根據(jù)血凝抑制試驗(yàn)的方法及操作規(guī)范對(duì)血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 不同月份蛋雞場(chǎng)樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)分析

按照不同月份，分別對(duì)2013年6月至12月蛋雞血清1 631份進(jìn)行H9N2亞型禽流感病毒抗體檢測(cè)，抗體滴度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

由表1可以看到，所有樣本中，10月份H9N2亞型禽流感平均抗體滴度最高，達(dá)到9.55log2，8月份平均抗體滴度最低，為8.71log2。6、7、9、11、12月份平均抗體滴度介于兩者之間。

從表1、表2中可以看出各個(gè)月份血樣中禽流感病毒H9亞型抗體合格率（≥6）最低的是8月份，為88.1%，9月稍高，為94.3%，抗體滴度最高的是7月份，為100.0%，其他各月平均抗體滴度介于8月和7月之間；優(yōu)秀率（≧9）最低的是9月份，為73.8%，最高的是10月份，為90.7%，其他各月介于這二者之間。其中8月份和9月份的優(yōu)秀率要明顯低于其他幾個(gè)月。

表1 規(guī)?；半u場(chǎng)不同月份H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)Table 1 The antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different months

2.2 不同地區(qū)蛋雞場(chǎng)樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)分析

對(duì)10個(gè)不同地區(qū)樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體抗體滴度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表2 規(guī)模化蛋雞場(chǎng)不同月份H9N2亞型亞型禽流感抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 2 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different months

表3 規(guī)?；半u場(chǎng)不同地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)Table 3 The antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different areas

根據(jù)表3顯示，湖北省不同地區(qū)樣本中，抗體滴度平均值最低的來(lái)源于沙洋，H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)平均為7.94log2，抗體整齊度差，差值相差較大；抗體滴度最高的是來(lái)源于浠水的蛋雞樣本，H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)平均為9.88log2，其他各個(gè)地區(qū)蛋雞血樣的抗體效價(jià)平均值介于這二者之間。除了沙洋蛋雞樣本外，其他各個(gè)地區(qū)的H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)平均滴度值均在9.00log2以上。

表4 規(guī)?；半u場(chǎng)不同地區(qū)H9N2亞型禽流感抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 4 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different areas

從表4中可以看出各個(gè)地區(qū)采集來(lái)的血液樣本中，來(lái)源于沙洋血樣中H9N2亞型禽流感病毒抗體合格率（≥6）最低，為80.0%，合格率最高的是來(lái)源于浠水的血樣，為100.0%，其他各個(gè)地區(qū)的血液樣本的合格率介于這兩者之間。而來(lái)源于京山，沙洋，應(yīng)城和棗陽(yáng)的樣本中H9N2亞型禽流感病毒抗體優(yōu)秀率（≥9）均低于80.0%。

2.3 不同日齡蛋雞H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)分析

對(duì)不同日齡蛋雞樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)分析結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

由表5可以看到，不同日齡蛋雞血液樣本中，日齡小于等于105d的樣本H9N2亞型禽流感抗平均滴度值最低，為9.08log2，隨著日齡的不斷上長(zhǎng)，樣本的H9N2亞型禽流感抗平均滴度值不斷上升。

從表6中可以看到不同日齡蛋雞的樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體合格率均在90.0%以上，而在蛋雞日齡小于等于105d時(shí)的這段時(shí)間，H9N2亞型禽流感病毒抗體優(yōu)秀率為74.6%，明顯低于其他日齡蛋雞的血液樣本，而在蛋雞日齡在105d和300d之間，H9N2亞型禽流感病毒抗體滴度大于等于9的比例不超過(guò)81.2%。

表5 不同日齡蛋雞H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)Table 5 The antibody titers of H9N2subtype AIV from different day age layers

表6 不同日齡蛋雞H9N2亞型禽流感病毒抗體效價(jià)合格率和優(yōu)秀率Table 6 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from different day age layers

3 討論

歷時(shí)7個(gè)月對(duì)湖北省規(guī)?；半u場(chǎng)雞群禽流感病毒滅活疫苗免疫抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，在不同區(qū)域，整體上H9N2亞型禽流感疫苗的免疫效果良好，基本可以保護(hù)蛋雞群免受同型病毒的感染。該免疫效果與其免疫時(shí)所用的單價(jià)苗及接種時(shí)間的合理選擇有著必不可分的聯(lián)系。因?yàn)閱蝺r(jià)苗的純度較高，而且減少了其他疫苗的干擾，使得機(jī)體能夠產(chǎn)生大量的抗體，同時(shí)合理的接種時(shí)間也有效的維持了高抗體的時(shí)長(zhǎng)。

但是檢測(cè)結(jié)果還顯示，相較于其他幾個(gè)月檢測(cè)樣本，8月份和9月份樣本平均抗體效價(jià)均偏低，原因和可能和天氣炎熱有關(guān)系。一方面天氣炎熱會(huì)引起雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，影響疫苗免疫效果，另一方面天氣炎熱季節(jié)會(huì)造成部分養(yǎng)殖企業(yè)減低疫苗密度、延長(zhǎng)H9N2亞型禽流感疫苗免疫時(shí)間。因此，養(yǎng)殖企業(yè)要在夏季做好降溫措施，盡量降低蛋雞群機(jī)體的免疫應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)保證雞群對(duì)H9N2亞型禽流感合理的免疫密度顯得尤為重要。

在不同地區(qū)，蛋雞在接種H9N2亞型禽流感疫苗后免疫效果存在一定的差異，導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能與各地的免疫程序和選擇的疫苗有很大的關(guān)系。由于各個(gè)地方蛋雞場(chǎng)養(yǎng)殖習(xí)慣不一樣，養(yǎng)殖水平存在一定的差異，免疫程序、免疫途徑、免疫劑量和所免疫的疫苗也存在差異。因此，建議養(yǎng)殖者根據(jù)最近幾年病原流行的變化調(diào)整免疫程序，及時(shí)進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)，提高這些地區(qū)雞群康H9N2亞型禽流感病毒抗體水平。

對(duì)不同日齡蛋雞的樣本H9N2亞型禽流感病毒抗體進(jìn)行分析顯示，加強(qiáng)免疫能夠明顯提高免疫效果。但是在蛋雞日齡在105～200之間，部分雞群抗體滴度值小于4log2，并且存在抗體滴度離散度大，極差大的特點(diǎn)，這提示在雞群進(jìn)入產(chǎn)蛋后部分雞場(chǎng)免疫仍存在免疫不均、免疫程序不合理的漏洞，值得引起警示。在蛋雞日齡在105d和300d之間，H9N2亞型禽流感病毒抗體滴度大于等于9的比例不超過(guò)81.2%，還存在較大的提升空間。

［1］金愛(ài)華，沈 強(qiáng)，余紅梅，等.H9亞型禽流感流行病學(xué)調(diào)查［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2012（3）：36-37.

［2］孫泉云.H9N2亞型禽流感流行狀況的研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（10）：107-111.

［3］葛菲菲.2007年-2008年上海市H9N2亞型禽流感病毒的遺傳演化［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2011（8）：696-699.

［4］劉國(guó)乾，曹 藍(lán)，和 君，等.三株H9N2亞型禽流感病毒全基因組序列分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（5）：1-7.

［5］肖月蕊，顏瑞萍，李明義，等.H9N2亞型禽流感重組病毒的拯救［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（10）：20-26.

［6］熊江林，周華林，王長(zhǎng)義，等.鄂西北地區(qū)規(guī)?；u場(chǎng)H9亞型禽流感抗體水平監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：239-341.

［7］孫惠霞，宋金祥.當(dāng)前應(yīng)重視強(qiáng)毒新城疫和H9亞型禽流感的防控［J］.北方牧業(yè)，2012（14）：19.

［8］曹立輝，李秀英，王 輝，等.商品蛋雞H9亞型禽流感混合感染概述［J］.北方牧業(yè)，2012（19）：22.

［9］Yuan J，Xu L，Bao L，et al.Characterization of an H9N2avian influenza virus from aFringillamontifringillabrambling in northern China［J］.Virology，2015，476：289-297.

［10］Zhang W，Xu H，Meng F，et al.Evolution of H9N2influenza viruses isolated in Shandong Province［J］.Sci China Life Sci，2015，58（2）：212-214.

［11］Jin Y，Yu D，Ren H，et al.Phylogeography of avian influenza A H9N2in China［J］.BMC Genomics，2014，15（1）：1110-1120

［12］Sun Y，Liu J.H9N2influenza virus in China：a cause of concern［J］.Protein Cell，2015，6（1）：18-25.