高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方中獸藥栓劑中沒(méi)食子酸的含量

陳 穎，高媛媛，鐘留情，范云鵬，麻武仁，宋曉平

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)藥研究所，陜西楊凌712100）

奶牛子宮內(nèi)膜炎是導(dǎo)致奶牛不孕癥的主要原因，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率高達(dá)30%以上［1-2］。目前，抗生素及化學(xué)合成類(lèi)藥物在奶牛子宮內(nèi)膜炎等感染性疾病的治療中仍占有主導(dǎo)地位，但隨著這些藥物的廣泛使用，病原耐藥性、藥物殘留和環(huán)境危害亦愈發(fā)嚴(yán)重［3-6］，極大地限制了其臨床應(yīng)用。中藥多數(shù)來(lái)自天然，成分多樣，療效歷經(jīng)長(zhǎng)久歲月驗(yàn)證，也已成為人們普遍關(guān)注的新獸藥研發(fā)新途徑。本實(shí)驗(yàn)室崔恩慧等［7］對(duì)郁金散拆方抑菌和抗炎作用研究發(fā)現(xiàn)，以訶子和黃連組方，對(duì)金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸埃希菌等奶牛子宮內(nèi)膜炎常見(jiàn)致病菌具有顯著抑制作用，且具有顯著的抗炎作用。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，以訶子、黃連為主藥進(jìn)行復(fù)方中獸藥栓劑的制備，并對(duì)其質(zhì)量控制成分進(jìn)行高效液相色譜定量檢測(cè)，旨在為該復(fù)方中獸藥栓劑的進(jìn)一步應(yīng)用提供檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 復(fù)方中獸藥栓劑（每粒質(zhì)量重3.1g，訶子-黃連2∶1，生藥含量1.41g／g），由西北農(nóng)林科技大學(xué)中獸醫(yī)藥研究所研制；沒(méi)食子酸對(duì)照品（沒(méi)食子酸含量89.9%，批號(hào)110831-201204），中國(guó)食品藥品檢定研究院產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Waters 600E高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Waters 2487檢測(cè)器。

1.1.3 主要試劑 甲醇（色譜級(jí)），美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry ShieldTM RP 18（5μm，4.6mm×250mm）；流動(dòng)相：甲醇-5g／L磷酸（5∶95）；流速：1.0mL／min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：273nm［8］，進(jìn)樣量：10μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取一定量沒(méi)食子酸對(duì)照品5.600mg，置10mL棕色容量瓶中，加水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.503 44mg／mL的溶液作為儲(chǔ)備液。

1.2.3 供試品溶液的制備 參照文獻(xiàn)［9］中的方法，稱(chēng)取栓劑350mg，加甲醇50mL，回流提取1h，放冷，用甲醇補(bǔ)足量。濾過(guò)，取續(xù)濾液5mL蒸干，加100mL／L HCl 5mL沸水浴中加熱水解4h，迅速冷卻并移至25mL容量瓶中加水至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mL 沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液于5mL容量瓶中，加水稀釋至刻度作為對(duì)照品溶液，濃度分別為0.020 137 6、0.040 275 2、0.060 412 8、0.080 550 4、0.100 688、0.201 376μg／μL。精密吸取各對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液（0.060 412 8μg／μL），進(jìn)樣量為10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照1.2.4中方法進(jìn)樣測(cè)定峰面積，并計(jì)算其RSD。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按照1.2.4中方法，分別在0、2、4、6、10、24h等時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次栓劑6份，按照1.2.3中的方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含有量的同一批栓劑6份，加入一定量的沒(méi)食子酸對(duì)照品混合，按照1.2.3中的方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.2.9 樣品含量測(cè)定 取不同批次栓劑，按照上述方法，測(cè)定栓劑中沒(méi)食子酸平均值。

1.2.10 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按照復(fù)方中藥栓劑的處方比例和工藝，同法制成缺訶子的陰性樣品，分別精密吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按1.2.1中的色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 沒(méi)食子酸含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

沒(méi)食子酸含量測(cè)定的回歸方程為y＝6.9×106x-39 068，r＝1.000 0，進(jìn)樣 量在0.201 376μg～2.01 376μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（圖1和表1）。

2.2 精密度試驗(yàn)

沒(méi)食子酸峰面積RSD為1.10%（表2），說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

沒(méi)食子酸峰面積RSD為1.17%（表3），說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

沒(méi)食子酸含量的RSD為1.30%（表4），說(shuō)明此方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

沒(méi)食子酸的平均回收率為100.02%，RSD為1.26%（表5），說(shuō)明本試驗(yàn)的準(zhǔn)確性高。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Calibration curve of gallic acid

表1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量與峰面積Table 1 The content of gallic acid standard and peak area

表2 沒(méi)食子酸的精密度試驗(yàn)Table 2 The precision test of gallic acid

表3 沒(méi)食子酸的穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 The stability test of gallic acid

表4 復(fù)方中獸藥栓劑中沒(méi)食子酸的重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 4 The results of repeated test of gallic acid in suppository of Chinese veterinary medicine

表5 復(fù)方中獸藥栓劑中沒(méi)食子酸的加樣回收率測(cè)定結(jié)果Table 5 The results of recovery rate of gallic acid in suppository of Chinese veterinary medicine

2.6 樣品含量測(cè)定

復(fù)方中獸藥栓劑樣品中沒(méi)食子酸測(cè)定的平均值為3.80%，RSD為0.37%（表6），說(shuō)明該測(cè)定方法準(zhǔn)確、可靠，可用于復(fù)方中獸藥栓劑中沒(méi)食子酸含量的測(cè)定。

2.7 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

供試品中沒(méi)食子酸的分離度好，與相鄰峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)算不低于6 000，且陰性樣品在沒(méi)食子酸出峰處無(wú)色譜峰，說(shuō)明復(fù)方中獸藥栓劑中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響（圖2）。

表6 復(fù)方中獸藥栓劑中沒(méi)食子酸含量的測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination of gallic acid content in suppository of Chinese veterinary medicine

圖2 復(fù)方中獸藥栓劑中沒(méi)食子酸的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of gallic acid in suppository of Chinese veterinary medicine

3 討論

訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz或絨毛訶子TerminaliachebulaRetz vartomentellaKurt的干燥成熟果實(shí)。其味苦、酸、澀、平，歸肺、大腸經(jīng)，具有澀腸、斂肺的功能［10］，現(xiàn)代藥理研究證明，訶子具有顯著的抗菌、抗炎和抗病毒作用［7，11-13］。訶子主要含有鞣質(zhì)、三萜和酚酸類(lèi)化合物，其中鞣質(zhì)包括水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)。水解鞣質(zhì)具有酯鍵和苷鍵，在酸、堿、酶的作用下可水解產(chǎn)生沒(méi)食子酸或沒(méi)食子酸聚合物和糖［14-15］?？s合鞣質(zhì)是一類(lèi)由兒茶素或其衍生物以碳-碳鍵聚合而成的化合物，由于結(jié)構(gòu)中無(wú)甙鍵與酯鍵，故不能被酸、堿水解［16］。在進(jìn)行復(fù)方中獸藥栓劑供試品溶液制備時(shí)，曾采用樣品中加入500mL／L甲醇，再超聲處理的方法［8］，但所測(cè)得的沒(méi)食子酸含量較低，隨后采用先在供試品中加甲醇回流提取，再于濾液中加100 mL／L HCl沸水浴加熱處理，所測(cè)定的沒(méi)食子酸含量明顯提高，這可能與復(fù)方中獸藥栓劑中的水解鞣質(zhì)分解為游離沒(méi)食子酸有關(guān)。本試驗(yàn)所建立的復(fù)方中獸藥栓劑中沒(méi)食子酸含量的測(cè)定方法，簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可作為該復(fù)方中獸藥栓劑中訶子質(zhì)量控制的有效檢測(cè)方法。

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