口服百草枯建立帕金森病模型及其評價研究

羅烘權(quán)，袁 進，徐名襯，鄭春華，王玉玨，吳麗紅，顧為望＊

（1.南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，廣東廣州510515；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣東廣州510140）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）又稱震顫麻痹（Paralysis agitans，Shaking palsy），是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)椎體外系退行性疾病。主要的病理特征是黑質(zhì)致密部大量多巴胺能神經(jīng)元的壞死，紋狀體內(nèi)多巴胺（dopamine，DA）含量減少。臨床上以靜止性震顫、肌強直、姿勢異常和運動遲緩以及平衡功能障礙為主要表現(xiàn)，可伴有記憶力減退、抑郁等精神障礙。PD與年齡、遺傳、環(huán)境等因素相關(guān)，發(fā)病率有逐年增加并有年輕化的趨勢。近年來，農(nóng)藥（如百草枯）在飲水、食品中的殘留被認為是PD的重要誘發(fā)因素［1-2］。有研究報道，國內(nèi)外農(nóng)民以及除草劑（如百草枯）暴露人群中帕金森病的發(fā)病率會相對增加［3］。

百草枯（paraquat，PQ），也叫克蕪蹤、對草快等，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。其結(jié)構(gòu)與經(jīng)典PD造模劑1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrehydropyridine，MPTP）及其活性代謝產(chǎn)物MPP＋極為相似，具有與MPTP相似的神經(jīng)毒性作用。百草枯可通過皮膚接觸或吸入、經(jīng)服食沾有該除草劑的食物、飲用水進入人體內(nèi)。

國外已經(jīng)報道百草枯的暴露是帕金森病的一個重要致病因素［4］。國內(nèi)外常通過腹腔注射或腦內(nèi)注射或皮下注射百草枯建立小鼠、大鼠PD模型［5-7］，這與人類的主要經(jīng)口暴露方式相差甚遠。通過大鼠口服百草枯建立PD模型的研究尚未見報道。因此，本研究通過口服途徑使大鼠較長時間暴露于百草枯，模擬人類長期、慢性暴露于該除草劑建立大鼠的PD模型，為PD的發(fā)病機制及其防治研究提供理想的模型動物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠（♂，220g～250 g）64只，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號：SCXK［粵］2011-0015）。

1.1.2 主要試劑 200g／L百草枯，南京杜邦生物化工有限公司產(chǎn)品；DA、HVA、5-HT標準品，Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 RC5C高速低溫離心機，美國杜邦公司產(chǎn)品；PHS-2C精密酸度計，上海理達儀器廠產(chǎn)品；Waters HPLC系統(tǒng)（510輸液泵，420熒光檢測器，Baseline810色譜工作站）；RD1112-OF-R-1鼠博士曠場實驗視頻分析系統(tǒng)、RD1101-MWM-G鼠博士MORRIS水迷宮視頻分析系統(tǒng)，上海移數(shù)信息科技有限公司產(chǎn)品；HF-240全自動生化分析儀，海力孚公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 將大鼠隨機分為4組，分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組16只，每天分別按生理鹽水、5、10、20mg／kg百草枯給藥，連續(xù)灌胃4個月，監(jiān)測大鼠試驗前后體重變化情況。

1.2.2 行為學(xué)檢測

1.2.2.1 日常行為觀察 主要觀察動物精神狀況，行為動作，給藥前后有無異常表現(xiàn)等。

1.2.2.2 曠場試驗 4個月后，每組隨機抽取8只大鼠進行試驗，把大鼠分別放入100cm×100cm×45cm的曠場箱內(nèi)，通過動物曠場實驗視頻分析系統(tǒng)采集分析大鼠在5min內(nèi)的運動總路程和中央活動時間。

1.2.2.3 水迷宮試驗 定位航行試驗：試驗共歷時4d，4次／d，每次分別從4個不同象限將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間，即為其逃避潛伏期。若大鼠在90s內(nèi)未找到平臺則由試驗者將其引向平臺，潛伏期記為90s。大鼠爬上平臺后，讓其在上休息15s，之后再進行下1次訓(xùn)練。將4次／d的算術(shù)平均值記為當(dāng)天的成績?？臻g探索試驗：于第5天撤除平臺，在第1象限將大鼠面壁投入水池，視頻分析系統(tǒng)記錄其2min內(nèi)水中游泳路徑及穿過原平臺的次數(shù)。

1.2.3 各組大鼠肝腎功能的檢測 試驗結(jié)束時，3組大鼠中每組隨機抽取8只，用30g／L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后通過眼眶靜脈叢采集血液1.5mL，分離血清，測定 ATL、BUN、Cr。

1.2.4 病理學(xué)觀察 將每組隨機抽取6只大鼠，采集肺、中腦組織并用100g／L甲醛固定后制作石蠟切片，進行HE染色。觀察各組大鼠肺、中腦黑質(zhì)部組織病理學(xué)變化。

1.2.5 HPLC-FD法檢測多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量

1.2.5.1 色譜條件 采用 Waters-510泵；Nucleosil-C18（4mm×250mm）色譜柱；流動相：5.89g／L檸檬酸三鈉緩沖液（用鹽酸調(diào)節(jié)pH為3.5）∶甲醇∶乙腈＝85∶10∶5，經(jīng)0.45μm的濾膜真空抽濾；脫氣，流速1.0mL／min；柱溫：室溫。熒光檢測器波長設(shè)置為：激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長315nm；以峰面積定量。

1.2.5.2 標準品和樣品的制備與測定 標準品制備：DA、HVA、5-HT分別溶解于10.05g／L HClO4中，濃度為0.5g／L，貯存于-20℃冰箱中；分析時將上述溶液稀釋成20μg／L作為標準溶液。樣品制備：每組大鼠用30g／L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后快速斷頭取腦，在預(yù)冷的PBS緩沖液中剝離出紋狀體，經(jīng)干冰固化稱重后迅速置-80℃冰凍保存。測定時取出標本置于勻漿器中，加入1mL預(yù)冷的HClO4，制成勻漿。于臺式冷凍離心機中15 000 r／min離心20min，取上清液0.22μm濾器過濾進樣檢測。根據(jù)外標法進行定量，計算出樣本中各項指標的濃度，并表示為ng／mg組織（濕重）。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進行分析，組間比較為Independent sample t檢驗，試驗數(shù)據(jù)均用±SD表示，P＜0.05則具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 日常行為觀察

給藥1周后，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)給藥的兩組部分大鼠出現(xiàn)拉稀和鼻孔出血；2周后中劑量組大鼠會出現(xiàn)呼吸急促，甚至出現(xiàn)嚎叫的現(xiàn)象、喂藥后豎毛、翹尾和異?；顫?，隨時間推移，以上癥狀逐漸減輕；4周后，中劑量組大鼠呆滯、反應(yīng)遲鈍；10周后，中劑量組部分大鼠動作僵硬和四肢震顫，且維持到試驗結(jié)束；而低劑量組大鼠整個過程沒有明顯上述變化。另外，高劑量組大鼠在試驗過程出現(xiàn)大量死亡（圖1），4個月后所剩大鼠數(shù)量無統(tǒng)計意義，因此，在進行檢測時把高劑量組剔除。

2.2 大鼠體重的變化

由表1可知，造模前各組大鼠體重比較，差異不顯著（P＞0.05），造模后各組大鼠體重都有明顯的增加，但組間差異不顯著（P＞0.05）。

表1 造模前后各組大鼠的體重比較Table 1 Comparison of body weights of rats among groups before and after modeling g

2.3 曠場試驗

由圖2結(jié)果顯示，對照組大鼠5min內(nèi)中央活動時間是中劑量組的13.69倍，差異顯著（P＜0.05），低劑量組的中央活動時間與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。各組大鼠5min內(nèi)運動總路程分別為2 610.41cm±633.55cm、2 556.90cm±837.97cm、2 507.69cm±780.07cm，雖然對照組＞低劑量組＞中劑量組，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，各組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠5min中央活動時間和運動總路程Fig.2 The time in the center of open field and the total walking distance in 5min among groups of rats

2.4 水迷宮試驗

定位航行試驗：在連續(xù)的4d的訓(xùn)練中，中劑量組和低劑量組與對照組相比，每天平均逃避潛伏期均增加，但是只有中劑量組與對照組比較，差異顯著（P＜0.05）；而低劑量組與對照組比較，差異不顯著（P＞0.05）（圖3）。

空間探索試驗統(tǒng)計結(jié)果表明，中劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)（2.14±0.69）與對照組（3.86±0.69）相比明顯減少，差異極顯著（P＜0.01），但是低劑量組（3.14±1.57）與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠日均尋臺潛伏期Fig.3 Daily average escape latency time in each groups of rats

2.5 肝腎功能檢測

采血后測定BUN、Cr以及ALT指標，結(jié)果見表2。各組之間的腎功能（BUN、Cr）差異不顯著（P＞0.05），而中劑量組的ALT雖然比低劑量組和對照組有所增高，但均差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同處理組的大鼠肝腎功能指標變化Table 2 Changes of hepatic and renal function indexes in different treatment groups of rats

2.6 病理學(xué)觀察

2.6.1 中腦病理觀察 由圖4中A、B、C可以看出，對照組大鼠大致正常，中劑量組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細胞大量萎縮，色素大量減少，膠質(zhì)細胞增生，低劑量組大鼠有輕度上述變化。

2.6.2 肺組織病理觀察 由圖4中D、E、F結(jié)果顯示，中劑量組大鼠肺泡腔嚴重淤血，肺泡上皮壞死脫落，肺泡間質(zhì)中炎細胞浸潤，低劑量組大鼠肺組織損傷程度較輕，而對照組大鼠正常。

2.7 紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)含量

通過HPLC檢測測定結(jié)果顯示，中劑量組大鼠4個月后紋狀體中的DA及HVA含量較對照組均明顯下降，分別下降20.0%（P＜0.01）和11.3%（P＜0.01）。而低劑量組大鼠紋狀體中的DA和HVA含量較對照組也有下降，但差異不顯著（P＞0.05）。5-HT檢測結(jié)果顯示，兩個試驗組與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）（表3。）

圖4 中腦和肺組織HE染色結(jié)果（400×）Fig.4 The HE results of midbrain and lung tissue（400×）

表3 各組大鼠暴露4個月后紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)的含量Table 3 The concentration of DA and its metabolites in the striatum of each groups of rats after 4moth exposure

3 討論

PD是常見于中老年人群的第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，在我國大于65歲以上人群中的PD患病率為1.7%，且有逐年遞增的趨勢［8］。近年一項研究表明，到2030年50歲以上的中老年人患PD的人數(shù)會增加1倍，估計相當(dāng)于全世界900萬的人口［9］。PD作為嚴重危害老年人身體健康的神經(jīng)退行性疾病，對其進行研究具有重要的國民保健和社會經(jīng)濟意義。

近年來，雖然農(nóng)藥種類和使用方法不斷更新改進，用藥水平和殘留水平也在下降，但農(nóng)產(chǎn)品和加工食品中種類繁多的農(nóng)藥殘留，給食品安全問題帶來了隱患。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常接觸農(nóng)藥、除草劑（如百草枯）的農(nóng)民，飲用被污染的河水、井水的居民，其PD發(fā)病率明顯增高［10］。

通過試驗研究不斷證實了百草枯具有致PD的神經(jīng)毒性作用。本試驗通過灌胃給予大鼠百草枯稀釋液，模擬人類經(jīng)消化道暴露該除草劑的方式，大鼠出現(xiàn)了PD的臨床癥狀和中腦病變。與大量報道的其他研究方法一樣，大鼠出現(xiàn)自發(fā)活動減少、運動遲緩、四肢震顫、腦內(nèi)神經(jīng)細胞明顯萎縮、黑質(zhì)神經(jīng)元受損、膠質(zhì)細胞增生、DA及其代謝物含量降低等一系列變化。有報道稱帕金森患者焦慮障礙的發(fā)生率為3.6%～40%［11］，曠場試驗表明，口服中劑量百草枯的大鼠在進入一個廣闊的空間后會產(chǎn)生一定程度的焦慮，Morris水迷宮試驗結(jié)果說明了其學(xué)習(xí)記憶能力也相對減退，這與對照組形成了鮮明的對比；從該研究各結(jié)果顯示，本試驗采用的方法可以建立具典型PD樣行為學(xué)表現(xiàn)的疾病模型。

人們常用腹腔或腦內(nèi)注射或皮下注射百草枯的方法進行建立帕金森模型［5-7］，采用單次或短期較高劑量多次給藥誘導(dǎo)出神經(jīng)元壞死的模型，這與生活中人類暴露于百草枯的方式完全不一致；且所用藥物大多為試劑級，價格昂貴；制備技術(shù)上，腦內(nèi)注射需立體定位特殊設(shè)備，有一定技術(shù)難度。雖丁正同等［12］已經(jīng)采用該方法在小鼠進行研究，同為嚙齒類動物，來源容易，觀察方便，但小鼠個體小，在取腦組織研究等方面相對較難。本研究方法模擬了人類暴露該除草劑的方式，采用商用百草枯水劑，價格低廉，操作簡便，試驗周期較長，符合了PD患者自然病程較長，病情進展緩慢的特點，較經(jīng)濟有效的進行模型制備。

近年來百草枯其神經(jīng)毒性作用被廣泛研究，但肺是百草枯毒性作用的靶器官。有研究表明，長期給予低劑量的百草枯，其慢性毒性作用主要對基底節(jié)造成損害而不產(chǎn)生肺毒性作用［3］。但本研究結(jié)果顯示，大鼠肺泡腔嚴重淤血，肺泡上皮壞死脫落，肺泡間質(zhì)中炎細胞浸潤，這表明該研究方法會對肺組織產(chǎn)生毒副作用，該毒副作用可能也是高劑量組的高死亡率原因。另外，雖然肝臟和腎臟是百草枯的主要代謝器官，但檢測結(jié)果顯示，本研究方法尚未損傷動物肝腎功能，這與相關(guān)報道［12］是一致的。

綜上所述，百草枯可能是導(dǎo)致PD的環(huán)境因素之一。SD大鼠通過口服方式暴露于百草枯可以發(fā)生典型的PD樣改變，行為學(xué)方面出現(xiàn)日?；顒訙p少，震顫，學(xué)習(xí)記憶能力下降等；形態(tài)學(xué)方面大鼠中腦黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)細胞減少明顯；生化方面大鼠紋狀體中DA及其代謝物HVA降低明顯等等。這些結(jié)果提示，通過亞慢性暴露于百草枯可導(dǎo)致大腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的變化，說明該方法建立PD模型是有效可行的，這為PD的機制和治療研究奠定基礎(chǔ)。

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