諸氏鯔蝦虎魚致病性創(chuàng)傷弧菌的分離與鑒定

余露軍，蔡 磊，陳小曲，葉惠欣，李建軍

（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510663）

弧菌廣泛分布于近海及河口的海洋環(huán)境，能引起多種魚類、蝦、貝類等水生動(dòng)物的暴發(fā)性疾病，是海水水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中危害最大的一類細(xì)菌性病原。其中大部分為人獸共患病病原，尤以霍亂弧菌、副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、創(chuàng)傷弧菌（Vibriovulnificus）最為重要［1］。諸氏鯔蝦虎魚（Mugilogobiuschulae）屬于鱸形目（Perciformes），蝦虎魚亞目（Gobioidei），蝦虎魚科（Gobiidae），鯔蝦虎魚屬（Mugilogobius），為暖水性底層小型魚類，棲息于河口、咸淡水水域中，具有體形小、繁殖周期短、對(duì)許多毒物敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)［2］，作為一種海洋水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，已開展海洋污染物的相關(guān)毒性評(píng)價(jià)［3-4］，但對(duì)其病害的研究尚未見報(bào)道。疾病問題一直是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖過程中關(guān)注的焦點(diǎn)，魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病害在研究中可引起大量的死亡，因此，開展諸氏鯔蝦虎魚病原的研究對(duì)其質(zhì)量控制尤為重要。

2014年8月，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)諸氏鯔蝦虎魚疾病情況進(jìn)行了調(diào)查，從番禺南沙采樣的諸氏鯔蝦虎魚在暫養(yǎng)過程中發(fā)生病害，病魚主要癥狀為腹部紅腫，甚至潰爛，腹腔積液。分別從病魚的肝臟組織中分離得到1株優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)分離菌株的生物學(xué)性狀、HSP60基因序列系統(tǒng)發(fā)育及其毒力基因進(jìn)行研究，以期了解創(chuàng)傷弧菌對(duì)諸氏鯔蝦虎魚的致病性，為諸氏鯔蝦虎魚病原微生物的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚 發(fā)病諸氏鯔蝦虎魚采自番禺南沙。人工感染用的試驗(yàn)魚：廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)繁殖的子9代封閉群諸氏鯔蝦虎魚（4月齡～5月齡），半靜態(tài)方式養(yǎng)殖，體長24mm～30mm，水質(zhì)條件為鹽度25±2，溫度26℃±2℃，光周期14 h∶10h（光照∶黑暗）。

1.1.2 主要試劑和儀器 TCBS、TSA培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，用于弧菌的分離培養(yǎng)和純化；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；Taq酶、PCR反應(yīng)相關(guān)試劑、瓊脂糖凝膠純化等相關(guān)試劑，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?；PCR擴(kuò)增儀（Mastercycler），Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；ATB系統(tǒng)細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀，法國Biomerieux公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、純化與生化鑒定 從患病魚肝臟組織取樣，劃線接種于TSA瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)24h后，挑選優(yōu)勢(shì)菌菌落在TCBS平板上劃線純化培養(yǎng)，用于進(jìn)行生物學(xué)性狀、生理生化分析、分子鑒定和人工感染試驗(yàn)。選取純化分離菌株菌落，觀察菌落特征，經(jīng)革蘭染色、氧化酶等試驗(yàn)后，采用ATB細(xì)菌半自動(dòng)鑒定儀（API ID32E）進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。

1.2.2 分離菌株回歸感染 純化培養(yǎng)的分離菌株，用8.5g／L無菌生理鹽水洗滌，配制成懸液。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，麥?zhǔn)媳葷岱ǚ謩e稀釋成5個(gè)濃度梯度（表1），腹腔注射健康諸氏鯔蝦虎魚。注射劑量20μL／尾，10尾／組，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。試驗(yàn)期間水溫28℃～30℃，觀察和記錄試驗(yàn)魚的癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察10d，SPSS17.0計(jì)算LD50。從感染出現(xiàn)癥狀的病魚中再次分離菌株并進(jìn)行感染試驗(yàn)。

1.2.3 弧菌HSP60基因序列測(cè)定分析和hemo毒力基因檢測(cè) 純化培養(yǎng)的分離菌株，按照DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA?；【鶫SP60基因［5］擴(kuò)增的引物為 P1：ACA ACA GCA ACG GTA CTA GC，P2：CAA CTT TCA CGA TGC CAC；根據(jù)GenBank登錄的創(chuàng)傷弧菌hemo基因設(shè)計(jì)毒力檢測(cè)基因，Hemo1：5′-GGA GCT GAG TAT CCC TGC TGT G-3′，Hemo2：5′-GAT TTG TGA CTT ATC GTC CGA A-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以提取的DNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：95℃4min；94℃30s，55℃45s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。HSP60產(chǎn)物回收純化后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

獲得的HSP60序列采用Blast進(jìn)行相似性比對(duì)。根據(jù)比較的結(jié)果，采用MEGA4軟件，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，自舉數(shù)集1 000。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)

分離菌株P(guān)YMc14-2在TCBS培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h后，菌落呈綠色菌落，革蘭陰性，桿菌，對(duì)弧菌抑制劑O／129（50μg／片）敏感，氧化酶陽性，葡萄糖發(fā)酵型，符合弧菌屬特征。經(jīng)API系統(tǒng)鑒定菌株P(guān)YMc14-2為創(chuàng)傷弧菌（%id＝99.9／T＝0.49），試劑條顯示為非常好的鑒定結(jié)果，生化結(jié)果見表2。

2.2 分離菌株回歸感染試驗(yàn)

分離菌株P(guān)YMc14-2回歸感染試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，菌株P(guān)YMc14-2對(duì)諸氏鯔蝦虎魚具有致病性，LD50為2.4×104CFU／尾。接種后3d出現(xiàn)死亡高峰，嚴(yán)重感染的魚出現(xiàn)與自然發(fā)病相似的癥狀，鰭條、腹部充血發(fā)紅，甚至潰爛，腹水。對(duì)照組在10d內(nèi)無死亡。從感染后癥狀明顯的病魚再次分離細(xì)菌，與原感染菌形態(tài)、生化特征完全相同，并再次感染成功，證實(shí)所分離的菌株為諸氏鯔蝦虎魚的致病菌。

表1 人工感染試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of artificial infection experiment

表2 API-ID32E系統(tǒng)菌株P(guān)YMc14-2生化反應(yīng)結(jié)果Table 2 The biochemical reaction results of PYMc14-2 by API-ID32Esystem

2.3 菌株P(guān)YMc14-2的HSP60基因序列分析及hemo毒力基因檢測(cè)

PCR擴(kuò)增分離菌株P(guān)YMc14-2的HSP60基因，獲得486bp的片段，毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，菌株P(guān)YMc14-2的hemo基因檢測(cè)結(jié)果陽性（圖1）。HSP60基因測(cè)序結(jié)果Blast分析顯示，PYMc14-2與GenBank上登錄的創(chuàng)傷弧菌（登錄號(hào)AF230955.1）同源性最高，為94%。分離的菌株HSP60片段與GenBank已登錄的序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，PYMc14-2與創(chuàng)傷弧菌（登錄號(hào)AF230955.1）聚為一簇（圖2）。

圖1 菌株P(guān)YMc14-2的HSP60、hemo基因PCR產(chǎn)物電泳Fig.1 Electrophoresis PCR products of HSP60gene，hemo gene of strain PYMc14-2

圖2 基于弧菌HSP60基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on HSP60sequences of Vibrio

3 討論

基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)分類方法已經(jīng)成為細(xì)菌分類的標(biāo)準(zhǔn)方法之一［6-7］。熱激蛋白（heat shock protein）是一類常用于生物進(jìn)化及分類的大分子物質(zhì)，廣泛存在于細(xì)菌及真核生物細(xì)胞中［8］，由于進(jìn)化速度比16SrRNA快，HSP60基因廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌的分類鑒定［9］。李寧求等［10］研究表明，HSP60基因比16SrRNA攜帶更多的多態(tài)信息，更適合于海水魚類致病性弧菌的分類研究。本研究中，菌株P(guān)YMc14-2與GenBank上登錄的創(chuàng)傷弧菌（登錄號(hào)AF230955.1）同源性最高，為94%，與其他弧菌同源性小于85%，表明HSP60基因適合于創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行分類。此外，溶血素（hemolysin）是魚類感染弧菌病的重要毒力決定簇，會(huì)引起宿主的溶血性敗血癥和腸炎等癥狀［11］。本研究中分離菌株hemo毒力基因檢測(cè)結(jié)果陽性，表明菌株含有溶血素毒力基因，這與患病魚腹部紅腫等癥狀表現(xiàn)相符。利用毒力基因快速鑒定菌株是否具有致病性是一種行之有效的方法［12］，但由于弧菌的感染和致病是由多種致病毒力因子相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，因此毒力基因檢測(cè)方法確定創(chuàng)傷弧菌致病性還需要進(jìn)一步的研究。

創(chuàng)傷弧菌廣泛分布于沿海地區(qū)的養(yǎng)殖魚類和水產(chǎn)品中，可以感染鰻鱺［13］、石斑魚［14］、黃姑魚［15］、羅非魚［16］等多種魚類，也有發(fā)現(xiàn)蝦虎魚科的矛尾腹蝦虎魚感染創(chuàng)傷弧菌的報(bào)道［17］。創(chuàng)傷弧菌不僅危害海水養(yǎng)殖業(yè)，還能引起人類傷口感染和敗血癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，為重要的人魚共患病病原［18］。本研究從患病的諸氏鯔蝦虎魚肝臟組織分離到1株革蘭陰性桿菌PYMc14-2，經(jīng)回歸感染證實(shí)其為諸氏鯔蝦虎魚的病原菌，通過細(xì)菌生物學(xué)特征和生理生化特性分析，初步鑒定為創(chuàng)傷弧菌。采用分子生物學(xué)方法對(duì)該菌的HSP60基因序列進(jìn)行了同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，進(jìn)一步確定菌株P(guān)YMc14-2為創(chuàng)傷弧菌，該菌導(dǎo)致諸氏鯔蝦虎魚發(fā)生疾病尚屬首次報(bào)道。創(chuàng)傷弧菌為條件致病菌，本研究中諸氏鯔蝦虎魚為采樣暫養(yǎng)過程中患病，推測(cè)自然環(huán)境中的諸氏鯔蝦虎魚可能攜帶有創(chuàng)傷弧菌，由于采樣過程的損傷和應(yīng)激導(dǎo)致魚體抵抗力下降，從而暴發(fā)疾病。本實(shí)驗(yàn)室在諸氏鯔蝦虎魚養(yǎng)殖過程中極少發(fā)生疾病，但隨著養(yǎng)殖條件變化和養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病原菌的感染和傳播應(yīng)該引起足夠的重視。

魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屬于較低等的動(dòng)物，具有方便、易得等多方面的優(yōu)勢(shì)，符合國際上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代理念，近年魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在科研試驗(yàn)上的應(yīng)用快速增加，但其標(biāo)準(zhǔn)化研究明顯落后于嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。因此，建立魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)需求十分迫切。本試驗(yàn)對(duì)諸氏鯔蝦虎魚創(chuàng)傷弧菌引起的疾病進(jìn)行了研究，為我國海水魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物諸氏鯔蝦虎魚病原的控制以及標(biāo)準(zhǔn)化研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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