結(jié)核分枝桿菌rBCG-Rv2029c重組疫苗的構(gòu)建與鑒定

薛士鵬，吳建勇,宋 彬，齊紅雙，李 英，黨潁徐，滿永宏

結(jié)核分枝桿菌rBCG-Rv2029c重組疫苗的構(gòu)建與鑒定

薛士鵬1，吳建勇1,宋 彬1，齊紅雙2，李 英2，黨潁徐2，滿永宏1

目的構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌rBCG-Rv2029c重組疫苗并鑒定。方法通過(guò)PCR擴(kuò)增Rv2029c抗原編碼基因，然后用雙酶切法將Rv2029c和pMV261質(zhì)粒酶切，再將酶切產(chǎn)物連接成rpMV261-2029c重組質(zhì)粒，用電穿孔法將該質(zhì)粒導(dǎo)入BCG中構(gòu)建成rBCG-Rv2029c重組疫苗，最后用SDS-PAGE和Western blotting鑒定表達(dá)的重組蛋白。結(jié)果通過(guò)PCR成功擴(kuò)增出1 020 bp的Rv2029c基因，插入到pMV261質(zhì)粒中，再把融合基因成功導(dǎo)入BCG中，經(jīng)雙酶切及基因比對(duì)鑒定證實(shí)，再通過(guò)熱誘導(dǎo)后用Western blotting顯示重組蛋白具有免疫原性。結(jié)論成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌rBCG-Rv2029c重組活疫苗，為重組疫苗的免疫機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

卡介苗；重組疫苗；結(jié)核桿菌；Rv2029c

BCG(卡介苗)的免疫保護(hù)功能對(duì)兒童較理想，但其遠(yuǎn)期的免疫效果并不理想，在各類人群中的免疫保護(hù)作用不等[1]。其主要原因是MTB(結(jié)核分枝桿菌)感染為休眠感染及BCG中的基因丟失、突變，并且環(huán)境中分枝桿菌和MTB存在交叉抗原，從而影響了BCG接種效果[2]。所以各國(guó)學(xué)者近幾年來(lái)，正致力于新型結(jié)核病疫苗的研究，如改良病毒疫苗[3]、DNA疫苗[4]、蛋白疫苗[5]、MTB減毒活疫苗[6]。

有研究發(fā)現(xiàn)，Rv2029c蛋白能在結(jié)核病病人和潛伏感染者中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，尤其在潛伏感染者中，其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)遠(yuǎn)超過(guò)結(jié)核病病人，Rv2029c蛋白能起到較好的免疫刺激作用[7]，且Rv2029c重組蛋白在人T細(xì)胞中也可刺激產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，同時(shí)，在感染MTB的人體中，Rv2029c具有顯著的免疫原性[8]。所以本次實(shí)驗(yàn)擬將Rv2029c作為目的基因構(gòu)建重組DNA疫苗，為新型結(jié)核病疫苗的免疫機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 從結(jié)核分枝桿菌H37Rv分離的基因組DNA，以及含有大腸埃希菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMV261的大腸埃希菌菌液均由本實(shí)驗(yàn)室保存；BCG上海株(BCG-China strain)：購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所，由南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校研究中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)并凍存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 用于質(zhì)粒重組的限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和EcoR I、 TaqDNA聚合酶、dNTP、 DNA連接試劑盒、PCR清潔回收試劑盒、基因組提取試劑盒、膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：購(gòu)于大連寶生物科技有限公司；N-N`-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、Marker、TB-PPD：購(gòu)于上海生物工程有限公司；結(jié)核病人血清：河南省南陽(yáng)市第六人民醫(yī)院提供；羊抗人抗體為L(zhǎng)ife Technologies(Invitrogen)公司產(chǎn)品。

1.3 重組基因的構(gòu)建

1.3.1 Rv2029c基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中報(bào)道的結(jié)核分枝桿菌Rv2029c基因序列，并結(jié)合質(zhì)粒pMV261酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)-對(duì)引物即：P1: 5′-TA GGATCC TAC TGC CTC GGT CGC CGC A-3′；P2:5′-AT GAATTC TCA TGG CGA GGC TTC CGG GT-3′以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.2 rpMV261-2029c重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用質(zhì)粒提取試劑盒按操作步驟提取含有pMV261質(zhì)粒的大腸埃希菌菌液。將目的基因和空質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切，將酶切產(chǎn)物加入連接液中 16 ℃過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后挑取pMV261的卡拉霉素陽(yáng)性質(zhì)粒菌接種至LA(胰化蛋白胨:10 g;酵母提取物:5 g;氯化鈉：10 g；瓊脂粉：3 g；水：1 L)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。如果轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌能在LA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，則可初步判定質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。再增菌培養(yǎng)，重提質(zhì)粒，以重組質(zhì)粒為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切鑒定。將初步鑒定正確的菌液送上海生物公司測(cè)序。

1.4 重組卡介苗rBCG-Rv2029c的構(gòu)建

1.4.1 BCG感受態(tài)細(xì)胞的制備[9]將BCG菌苗加入細(xì)菌培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)約4～6 周，當(dāng)菌膜鋪滿培養(yǎng)基表面，即可制備感受態(tài)細(xì)胞。加入甘氨酸使其終濃度為5%，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)瓶中加入高壓滅菌玻璃珠，置于搖床上充分震蕩培養(yǎng)，直至菌膜被打碎成單菌。50 mL離心管收集菌體，用10%超純水稀釋的甘油洗滌，以去除培養(yǎng)基中的離子和其它雜質(zhì)，連續(xù)洗滌3次，最后再用10%甘油重懸BCG，即制成BCG感受態(tài)細(xì)胞。

1.4.2 重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入 取400 μL BCG感受態(tài)細(xì)胞懸液加入電穿孔杯中，再加入20 μL重組質(zhì)粒rpMV261-2029c或pMV261空載體，輕輕混勻后，冰上放置30 min，即進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件設(shè)置為：電阻720 Ω，電壓1.8 kv～2.2 kv(可調(diào))，其它參數(shù)自動(dòng)調(diào)節(jié)，放電2～3次，2次放電間隔為2 min，以確保菌液溫度不至于過(guò)高或BCG細(xì)胞破壞，3次放電結(jié)束后，置冰浴30 min，而后，將菌懸液加入含有20 μg/mL卡那霉素的Sauton 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫孵箱培養(yǎng)。

1.5 重組卡介苗rBCG-Rv2029c的鑒定

1.5.1 卡拉霉素抗生素篩選 將上述電擊轉(zhuǎn)化后菌液經(jīng)37 ℃靜置培養(yǎng)后，若能夠生長(zhǎng)，說(shuō)明該重組BCG卡介苗表達(dá)卡拉霉素抗性基因，由于pMV261上含有卡拉霉素抗性基因，則間接說(shuō)明重組質(zhì)粒已通過(guò)電轉(zhuǎn)化成功導(dǎo)入卡介苗基因組，此重組卡介苗可進(jìn)行如下鑒定。

1.5.2 重組卡介苗基因組DNA的提取、PCR鑒定及測(cè)序鑒定 擴(kuò)增菌量，采集菌液重提重組卡介苗基因組，以重組卡介苗基因組為模板，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，如有明顯的擴(kuò)增條帶，則可初步判定該重組質(zhì)粒已成功通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入BCG基因組。將PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性的重組卡介苗基因組保存，并送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行blast比對(duì)。

1.5.3 重組蛋白的熱誘導(dǎo)表達(dá)[10]和western-blot鑒定 取經(jīng)鑒定后的陽(yáng)性的重組卡介苗菌苗，從37 ℃的培養(yǎng)環(huán)境中迅速移入45 ℃的水浴中，使其處于熱應(yīng)激環(huán)境，作用30 min后將其取出。收集單菌菌液于PBS中，在冰浴下進(jìn)行超聲破菌。用PEG6000對(duì)破碎后的菌液進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積1/50左右即可。收集破菌上清及沉淀、細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。然后，取目的膠帶用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原1 h，TBST(TBS液中加入終濃度為0.5%的Tween80分散劑)緩沖液洗滌5 min×3次，加入結(jié)核病病人血清(1∶100稀釋)，4 ℃過(guò)夜，次日復(fù)溫至室溫后再放置1 h，TBST洗滌5 min×3次，加入熒光標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育1 h后，DAB顯色。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因Rv2029c的PCR獲取 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析顯示，在約1 020 bp處可見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與目的基因Rv2029c大小一致(如圖1示)

M:M2000；1. Rv2029c基因M：DNA Marker D2000; 1. PCR product of rv2029c gene圖1 目的基因Rv2029c的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳 Fig.1 Agarose electrophoresis for PCR product of rv2029c

2.2 重組穿梭質(zhì)粒的鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒rpMV261-Rv2029c的抗生素篩選 將目的基因Rv2029及空質(zhì)粒pMV261經(jīng)雙酶切后過(guò)夜連接，而后將鏈接子轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5a，結(jié)果在含卡那霉素的LB(胰化蛋白胨10 g;酵母提取物5 g;氯化鈉10 g；水1 L)固體培養(yǎng)板上篩選得到數(shù)株重組菌落。挑取單菌落在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中仍可增量，說(shuō)明重組菌落可表達(dá)卡拉霉素抗性基因，初步判定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2.2 重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增鑒定 以重組質(zhì)粒rpMV361-Rv2029c為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約1 020 bp處可見(jiàn)明顯電泳條帶，其大小與Rv2029c基因大小相符(圖2-1泳道)。提取上述3種鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒，送Invitrogen公司測(cè)序，通過(guò)在NCBI中進(jìn)行blast比對(duì)后，提示目的基因Rv2029c與GenBank中收錄的一致，未發(fā)生突變、錯(cuò)配、缺失等。

1. Rv2029c基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2. 重組質(zhì)粒rpMV261-Rv2029c；3.BamH I和EcoR I對(duì)重組質(zhì)粒rpMV261-Rv2029c進(jìn)行雙酶切，在1 020 bp處可見(jiàn)特異性酶切產(chǎn)物；4. BamH I和EcoR I對(duì)pMV261空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，未見(jiàn)酶切產(chǎn)物；M：DNA marker IV1: PCR product of rv2029c gene; 2: rpMV261-Rv2029c; 3：rpMV261-Rv2029/BamH I+EcoR I; 4： pMV261/BamH I+EcoR I; M: DNA Marker IV圖2 重組質(zhì)粒rpMV261-Rv2029c的雙酶切鑒定Fig.2 PCR and restriction digestion of recombinant plasmid rpMV261-Rv2029c DNA Marker IV

2.2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定和測(cè)序鑒定 將重組質(zhì)粒命名為rpMV261-Rv2029c，提取經(jīng)抗生素篩選的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和EcoR I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳顯示，分別在4 500 bp和1 020 bp處可見(jiàn)清晰的電泳條帶(圖2)，分別與pMV261空質(zhì)粒載體和目的基因Rv2029c大小相符。

3.3 重組疫苗rBCG-R的鑒定

3.3.1 重組疫苗的抗生素篩選 將電轉(zhuǎn)化后的菌液在含有卡那霉素的Sauton(蘇通瓊脂培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，8周后可見(jiàn)少量菌落在培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出，12周后重組菌體則可鋪滿培養(yǎng)基表面。將菌體轉(zhuǎn)種后，經(jīng)4周的培養(yǎng)，菌膜則可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，呈侵襲性生長(zhǎng)。

3.3.2 重組疫苗基因組DNA的PCR擴(kuò)增鑒定和測(cè)序鑒定 將鑒定陽(yáng)性的重組菌增菌培養(yǎng)，提取其基因組DNA并以此為模板，以P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果如圖3顯示：凝膠電泳在1 020 bp處可見(jiàn)明顯擴(kuò)增條帶，與Rv2029c基因大小相符。而以rBCG-261和BCG基因組DNA為模板，相同條件下擴(kuò)增則無(wú)特異性條帶。提取經(jīng)鑒定均為陽(yáng)性的重組菌體基因組DNA送測(cè)序，結(jié)果通過(guò)NCBI進(jìn)行blast比對(duì)后，顯示目的基因未發(fā)生突變、缺失、錯(cuò)配等。

1．rBCG-R基因組DNA；2. 以rBCG-R基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增條帶； M：Marker1. Genomic DNA of rBCG-R; 2. PCR amplification was performed using rBCG-R genomic DNA as template 圖3 重組卡介苗rBCG-R的基因組提取及PCR鑒定Fig.3 PCR and restriction digestion of recombinant plasmid rBCG-R

3.3.3 目的蛋白在重組疫苗rBCG-R中的熱誘導(dǎo)表達(dá)和Western-blot鑒定 重組卡介苗經(jīng)過(guò)熱誘導(dǎo)后表達(dá)目的蛋白，然后將目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，最后進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，DAB顯色后在相對(duì)分子量約35 KD處出現(xiàn)了一條特異性反應(yīng)條帶，在菌體培養(yǎng)液和破菌上清中均可檢出重組蛋白，如圖4。

圖4 重組蛋白的West-blot鑒定Fig.4 Recombinant protein identified by Western blot

3 討 論

由于目前1/3以上的MTB感染以休眠菌的形式存活于體內(nèi)，一種理想的TB疫苗不僅能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)活動(dòng)性MTB的免疫反應(yīng)，還要求結(jié)核菌疫苗能有效提供針對(duì)休眠M(jìn)TB的免疫保護(hù)，從而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌免疫保護(hù)的能力。

MTB休眠存活調(diào)節(jié)子系統(tǒng)為DosR[11](Dormancy survival regulon),該系統(tǒng)包含近50個(gè)基因，其表達(dá)產(chǎn)物與MTB休眠密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MTB處于營(yíng)養(yǎng)素缺乏、缺氧及酸性微環(huán)境等應(yīng)激條件下，Rv2029c呈持續(xù)高表達(dá)狀態(tài)，提示Rv2029c在MTB休眠中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。

所以，本研究以MTB休眠相關(guān)基因Rv2029c為目的基因[12]構(gòu)建重組卡介苗新型結(jié)核病疫苗rBCG-Rv2029c，主要目的是使該疫苗具有針對(duì)休眠M(jìn)TB的免疫保護(hù)能力。此外，我們以BCG為基礎(chǔ)構(gòu)建重組卡介苗，BCG中含有眾多活動(dòng)性MTB表達(dá)抗原，使rBCG-Rv2029c既具備誘導(dǎo)針對(duì)活動(dòng)性MTB免疫應(yīng)答的能力，同時(shí)，由于重組蛋白為休眠相關(guān)抗原Rv2029c，使rBCG-Rv2029c又具備誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)休眠M(jìn)TB的免疫反應(yīng)。

另外，rBCG是活疫苗，接種體內(nèi)后能自我繁殖，可持續(xù)表達(dá)其自身蛋白和重組蛋白，不斷刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)的免疫應(yīng)答。該應(yīng)答不僅針對(duì)BCG表達(dá)的眾多免疫顯性抗原，更重要的是其表達(dá)的重組蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，如針對(duì)MTB休眠顯性抗原的免疫應(yīng)答，通過(guò)該方式，可顯著提高重組疫苗的免疫預(yù)防效果。同時(shí)，rBCG疫苗具備保存條件不高(4°C冷藏即可)、適合大量生產(chǎn)、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、獲取容易、價(jià)格低廉[13-16]等有利條件。并且，rBCG疫苗構(gòu)建的基礎(chǔ)是BCG，具有較高的安全性[17]。

本次實(shí)驗(yàn)把MTB休眠相關(guān)基因Rv2029c成功的轉(zhuǎn)化入了BCG活疫苗中，通過(guò)抗生素初篩及基因的比對(duì)，Rv2029c沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有錯(cuò)配，缺失等，并且在熱誘導(dǎo)的條件下能夠表達(dá)休眠相關(guān)蛋白，只不過(guò)表達(dá)的量及進(jìn)入機(jī)體后能否表達(dá)尚有待進(jìn)一步研究，為該類新型疫苗的免疫性及安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

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Man Yong-hong, Email: man-yh@foxmail.com

ConstructionandidentificationofrecombinantrBCG-Rv2029cvaccineofMycobacteriumtuberculosis

XUE Shi-peng1，WU Jian-yong1，SONG Bin1，QI Hong-shuang2, LI Ying2,DAGN Ying-xu2，MAN Yong-hong1

(1.DepartmentofBasicMedical,NanyangMedicalCollege,Nanyang473061,China; 2.NanshiHospitalAffiliatedtoHenanUniversity,Nanyang473006,China)

We constructed a recombinant vaccine ofMycobacteriumtuberculosisrBCG-Rv2029c, and then identified it. Rv2029c antigen encoding gene was amplified by PCR. The enzyme digestion products were ligated into rpMV261-2029c recombinant plasmid,after double digestion of Rv2029c and pmv261 vector, and then we introduced the plasmid into BCG to construct rBCG-Rv2029c recombinant vaccine by electroporation method. Finally, we analyzed the expression of the recombinant protein by SDS-PAGE and Western blotting. A total of 1 020 bp Rv2029c gene successfully amplified by PCR was inserted into the plasmid pmv261, then the fusion gene was successfully transduced into BCG. After identified by double enzyme digestion, confirmed by gene alignment and by thermally induced with Western blotting, the recombinant protein had a free primary. The recombinant live vaccine ofM.tuberculosisrBCG-Rv2029c is successfully constructed, which lay a foundation for the study of the immune mechanism of recombinant vaccine.

BCG vaccine; recombinant vaccine;Mycobacteriumtuberculosis; Rv2029c

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.016

校自科NYYZ006

滿永宏，Email: man-yh@foxmail.com

1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部,南陽(yáng) 473061； 2.河南大學(xué)附屬南陽(yáng)南石醫(yī)院，南陽(yáng) 473006

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R378

：B

：1002-2694(2017)08-0744-04

2016-01-15編輯：梁小潔