• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    沙門菌基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜方法研究

    2017-09-03 10:17:28趙劍虹李書明張士堯王恒偉韓慶華
    關(guān)鍵詞:靶板沙門分型

    趙劍虹,高 艷,李書明,張士堯,王恒偉,顧 琳,韓慶華,焦 洋,陳 倩

    沙門菌基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜方法研究

    趙劍虹1,高 艷1,李書明1,張士堯1,王恒偉1,顧 琳1,韓慶華1,焦 洋1,陳 倩2

    目的優(yōu)化基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法對(duì)沙門菌鑒定的條件,研究不同前處理方法對(duì)MALDI靶板污染情況,建立安全高效的檢測(cè)沙門菌的方法。方法應(yīng)用MALDI-TOF-MS 法對(duì)4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行不同培養(yǎng)條件、樣品前處理方式檢驗(yàn),確立優(yōu)化的鑒定程序,對(duì)不同處理方式下MALDI靶板進(jìn)行檢測(cè),采用優(yōu)化的前處理方法對(duì)33株腹瀉病人糞便標(biāo)本中分離的沙門菌進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖譜比對(duì),所得鑒定結(jié)果與常規(guī)血清學(xué)分型結(jié)果比較。結(jié)果不同前處理方法、不同的培養(yǎng)基上沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均準(zhǔn)確鑒定為沙門菌。 33株沙門菌用MALDI-TOF-MS方法全部準(zhǔn)確鑒定為沙門菌屬,19株沙門菌在種的鑒定水平上與血清分型結(jié)果完全一致,14株沙門菌在種的鑒定水平上與血清分型結(jié)果不一致。不同前處理方法的MALDI靶板上均未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)論MALDI-TOF-MS方法能快速、簡(jiǎn)便、安全、準(zhǔn)確鑒定屬水平沙門菌,是一種有效的沙門菌檢測(cè)鑒定的手段。

    基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS);沙門菌;鑒定

    沙門菌(Salmonella)種類繁多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過(guò)2 500個(gè)沙門菌血清型,我國(guó)已發(fā)現(xiàn)血清型超過(guò)290個(gè)。沙門菌是常見(jiàn)的腸道致病菌之一,不僅可以引起家禽及動(dòng)物發(fā)生感染,還能通過(guò)污染的食物導(dǎo)致人的食物中毒。在世界各國(guó)的各類細(xì)菌性食物中毒中,沙門菌引起的食物中毒常居榜首;我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)以沙門菌為首位[1]。因此,建立一種快速而準(zhǔn)確的沙門菌檢測(cè)鑒定及分型方法具有重要意義。

    目前,沙門菌的檢測(cè)和分型方法很多,主要包括傳統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)分型和耐藥譜分型等。以細(xì)菌表面蛋白為檢測(cè)對(duì)象的基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization-time of light mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的微生物檢測(cè)技術(shù),它是通過(guò)檢測(cè)未知微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜并與質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)中特征性譜圖進(jìn)行對(duì)比,從而對(duì)待測(cè)微生物進(jìn)行快速鑒定[2]。它所具有的靈敏、準(zhǔn)確、自動(dòng)化以及高通量等優(yōu)勢(shì)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)鑒定方法的缺陷,對(duì)致病菌的檢測(cè)與鑒定、分型及溯源有十分重要的意義。目前MALDI-TOF MS技術(shù)已經(jīng)成為商業(yè)的微生物鑒定技術(shù)[3],但不同的培養(yǎng)基和樣品的前處理方式會(huì)影響MADLI—TOF MS鑒定細(xì)菌的結(jié)果[4-5]。本研究通過(guò)采用MALDI-TOF-MS對(duì)4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同培養(yǎng)基和不同前處理方式下進(jìn)行鑒定,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,尋找簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的鑒定方式,并將血清學(xué)分型和MALDI-TOF-MS分型方法進(jìn)行比較,探討分型方法的可比性。

    MALDI-TOF-MS在微生物鑒定領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)間較短,對(duì)于MADLI靶板在使用過(guò)程中是否會(huì)污染外環(huán)境國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究對(duì)沙門菌鑒定的靶板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),初步探討該技術(shù)方法的安全性。

    1 材料與方法

    1.1 菌株 4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(鼠傷寒沙門菌CMCC50013、乙型副傷寒沙門菌CMCC50004、傷寒沙門菌CMCC50071和鼠傷寒沙門菌ATCC14028)購(gòu)置于中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心、33株北京市朝陽(yáng)區(qū)腹瀉病人糞便中分離的沙門菌。

    1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(成品),賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;沙門菌增菌液;沙門誘導(dǎo)培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)有限公司。

    1.3MALDI-TOF-MS基質(zhì)和溶液系統(tǒng) 甲酸(formic acid,F(xiàn)A),Sigma,Germany;乙醇,Sigma,USA;三氟乙酸(trifluoracetic acid,TFA),Sigma,Germany;乙腈(acetonitrile,CAN),Dikmapure,USA;去離子水:通過(guò)Milipore過(guò)濾;基質(zhì)2-氰基-4-羥基肉桂酸( α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA)、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)溶劑(德國(guó)布魯克公司)。(BrukerDaltonics);沙門菌A~F多價(jià)、O、H血清(Statens serum institut,Danmark和寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司);BD鑒定卡(Becton,Dickinson and Company)。

    1.4 儀器 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MicroflexTMMALDI-TOF)和配套分析軟件(德國(guó)布魯克公司),儀器參數(shù)為:氮?dú)饧す夤庠?,線性正離子(LP-BioTyper)采樣模式,質(zhì)量范圍2 000-20 000 D,激光隨機(jī)機(jī)打40/次,打5個(gè)點(diǎn),激光頻率為60 Hz,每次實(shí)驗(yàn)前用校準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)量校正;全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀(PhoenixTM100)(美國(guó)BD公司)。

    1.5 菌株鑒定 33株受試菌株均按照《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)WS271—2007》和《傷寒、副傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則WS280—2008》中的檢測(cè)方法進(jìn)行生化反應(yīng)和血清學(xué)檢測(cè)鑒定為沙門菌。

    1.6 鑒定條件的優(yōu)化

    1.6.1 前處理?xiàng)l件的選擇

    1.6.1.1 甲酸提取法:參考文獻(xiàn)[6]樣本制備的方法進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)。

    1.6.1.2 直接轉(zhuǎn)移法:參考文獻(xiàn)[7]對(duì)沙門菌鑒定的方法進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)。

    1.6.1.3 加熱提取法:向EP管中加入300 μL去離子水,取4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株單一菌落至離心管中,充分混勻,在沸水浴中加熱 30 min,13 000 r/min離心2 min,棄上清。取沉淀均勻涂在靶板上,干燥后,在上述樣品上覆蓋1 μL HCCA基質(zhì)溶液,晾干后進(jìn)行檢測(cè)。

    1.6.1.4 乙醇提取法 向EP管中加入300 μL75%乙醇,取4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株單一菌落至離心管中,充分混勻,反應(yīng) 30 min后13 000 r/min離心2 min,棄上清。取沉淀均勻涂在靶板上,干燥后,在上述樣品上覆蓋1 μLHCCA基質(zhì)溶液,晾干后進(jìn)行檢測(cè)。

    1.6.2 MALDI靶板污染情況比較 實(shí)驗(yàn)完成后,將甲酸提取法、直接轉(zhuǎn)移法、加熱滅菌提取法、乙醇滅菌提取法點(diǎn)在MALDI靶板上的靶點(diǎn)用1 μL 生理鹽水溶解后,分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂和血平板,放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng),并進(jìn)行分純鑒定。

    1.6.3 培養(yǎng)基的選擇 將4株沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)18~24 h,用甲酸提取法上樣,每種菌株上3個(gè)靶點(diǎn),MALDI-TOF-MS對(duì)每個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行5次鑒定和圖譜匹配性分析,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,得到每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的平均匹配分?jǐn)?shù)。

    1.7 菌株的鑒定 將33株北京市朝陽(yáng)區(qū)腹瀉病患者糞便中分離的沙門菌菌株接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)18~24 h,用直接轉(zhuǎn)移法進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

    2 結(jié) 果

    2.1 條件優(yōu)化的結(jié)果

    2.1.1 前處理方法

    2.1.1.1 匹配分值 采用甲酸處理法、直接轉(zhuǎn)移法、加熱提取法和乙醇提取法鑒定沙門菌的匹配分值均>2.0,說(shuō)明可以保守鑒定到菌屬,其中甲酸提取法和直接轉(zhuǎn)移法的分值均>2.3,說(shuō)明鑒定到菌種的可信度高,見(jiàn)表1。

    表1 不同前處理方式的鑒定分值Tab.1 Identification score value of different sample preparation methods

    2.1.1.2 質(zhì)譜圖質(zhì)量 比較甲酸提取法、直接轉(zhuǎn)移法、加熱提取法和乙醇提取法這4種方法的圖譜發(fā)現(xiàn)峰形基本一致,但甲酸處理法的圖譜基線平穩(wěn),雜峰相對(duì)較少(見(jiàn)圖1)。

    2.1.2 培養(yǎng)基的選擇 5種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的沙門菌在MALDI-TOF-MS檢測(cè)的匹配分值均>2.0說(shuō)明可以保守鑒定到菌屬,其中營(yíng)養(yǎng)瓊脂和XLD培養(yǎng)基上的各標(biāo)準(zhǔn)菌株在 MALDI-TOF-MS上的匹配分?jǐn)?shù)在>2.300,說(shuō)明可準(zhǔn)確鑒定到種。具體數(shù)值見(jiàn)表2。結(jié)果表明:不同培養(yǎng)基上的沙門菌的指紋圖譜峰值強(qiáng)度有所差別,但是所獲取的圖譜均可以得到正確的鑒定結(jié)果。

    2.2 沙門菌分離株鑒定結(jié)果 33株沙門菌均能鑒定到種屬水平。MALD-TOF-MS鑒定結(jié)果型別與血清型結(jié)果比較結(jié)果見(jiàn)表3。33株不同血清型的沙門菌中,用MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果為:19株鑒定結(jié)果與血清凝集結(jié)果一致,14株鑒定結(jié)果與血清凝集結(jié)果不一致。

    圖1 不同處理方法的質(zhì)譜圖比較Fig.1 Mass spectra comparing of different pretreatment methods

    表2 5種培養(yǎng)基上的菌株鑒定分值Tab.2 Identification score value in 5 kinds of culture medium

    表3 沙門菌MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果與菌株的血清型結(jié)果比較Tab.3 Comparison of MALDI-TOF-MS and the serotype of Salmonella strains

    3 討 論

    MALDI-TOF-MS法作為一種快速鑒定微生物的方法得到廣泛應(yīng)用[8],本文針對(duì)多種樣本前處理方法和5種常用培養(yǎng)基培養(yǎng)的沙門菌采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行檢測(cè)鑒定,得到的結(jié)果與梁達(dá)煒等[7]研究結(jié)果基本一致,說(shuō)明MALDI-TOF-MS可直接使用選擇性平板上沙門菌進(jìn)行鑒定,節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。

    通過(guò)對(duì)不同血清型沙門菌的分析,本文研究結(jié)果表明使用MALDI-TOF-MS法進(jìn)行沙門菌血清分型鑒定與常規(guī)血清學(xué)凝集分型方法具有一定的相關(guān)性,但不能達(dá)到完全一致,與鄭秋月等[9]研究的結(jié)果一致,其主要原因其一是二者原理有所差異:常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)是針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜表面的抗原蛋白,而MALDI-TOF-MS檢測(cè)則針對(duì)的是細(xì)菌體內(nèi)所有的生物大分子,包括核糖體蛋白等。其二與MALDI-TOF數(shù)據(jù)庫(kù)容量有關(guān),提示繼續(xù)補(bǔ)充沙門菌鑒定數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)菌株進(jìn)行溯源分析,進(jìn)一步分析不同來(lái)源的沙門菌對(duì)MALDI-TOF-MS檢測(cè)分型的影響因素[10],以及不同耐藥譜對(duì)MALDI-TOF-MS的鑒定分型的影響[11]是今后的研究方向。

    國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道MALDI-TOF-MS樣品前處理方法對(duì)MALDI靶板污染情況,使該方法的應(yīng)用存在一定生物安全隱患,本文初步探討了沙門菌不同前處理方法對(duì)MALDI靶板污染,說(shuō)明使用不同的常規(guī)前處理方法均不會(huì)導(dǎo)致MALDI靶板污染,但因各種細(xì)菌對(duì)外界抵抗力的不同,其他非沙門菌是否會(huì)造成MALDI靶板污染尚需進(jìn)一步研究。

    [1] Zhu Q,Lu BX,Tan YQ,et al. Research progress on biologicalSalmonellaenteric[J]. J Dis Monitor Control,2015,9(7):474-478.(in Chinese)

    朱奇,陸斌興,覃有泉,等.沙門氏菌生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 疾病監(jiān)測(cè)與控制,2015,9(7):474-478.

    [2] Wieser A, Schneider L, Jung J, et al. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review)[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(3): 965-974.DOI: 10.1007/s00253-011-3783-4

    [3] Wu A,Zhang LJ. Application of mass spectrometry technology in the diagnosis of pathogenic microorganism[J]. Chin J Zoonoses,2016,32(9): 838-842,849. DOI:10 3969/j.issn.1002—2694.2016.09014 (in Chinese)

    吳傲,張麗軍.質(zhì)譜技術(shù)在病原微生物診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2016,32(9): 838-842,849.

    [4] Valentine N, Wunschel S, Wunschel D, et al. Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(1): 58-64. DOI: 10.1128/AEM.71.1.58-64.2005

    [5] Martiny D, Visscher A, Catry B, et al. Optimization ofCampy-lobactergrowth conditions for further identification by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)[J]. J Micro Methods, 2013, 94(3): 221-223. DOI: 10.1016/j.mimet.2013.06.018

    [6] Hu X,Lin XH,Tong W,et al. Study on establishment of mass spectrometry database ofSalmonellaspecies by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. J Hygiene Res, 2014,43(1):40-46. (in Chineses)

    胡驍,林肖惠,佟巍,等.沙門菌MALDI-TOF-MS 標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)的建立及應(yīng)用研究[J]. 衛(wèi)生研究,2014,43(1):40-46.

    [7] Liang DW,Liang QH,Fang YP,et al. Rapid identification onSalmonellaisolated from clinical specimens by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry[J]. Chin J Zoonoses, 2016,32 (7):600-603. DOl:10.3969/j.issn.1002—2694.2016.07.002(in Chinese)

    梁達(dá)煒,梁權(quán)輝,方艷平,等.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒定沙門菌臨床分離株[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2016,32 (7):600-603.

    [8] Sauer S, Kliem M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria[J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(1): 74-82. DOI: 10.1038/nrmicro2243

    [9] Zheng QY,Zhan XW,Xiao SS,et al. Establishment of MALDI-TOF-MS typing forSalmonella[J]. Chin J Public Health, 2014, 30(10): 1344-1347. DOI:10.11847/zgggws2014-30-10-0(in Chinese)

    鄭秋月,戰(zhàn)曉薇,肖珊珊,等.沙門氏菌MALDI-TOF-MS分型方法建立[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2014,30(10):1344-1347.

    [10] Carbonnelle E, Grohs P, Jacquier H, et al. Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification[J]. J Microbiol Methods, 2012, 89(2): 133-136.DOI: 10.1016/j.mimet.2012.03.003

    [11] Wolters M, Rohde H, Maier T. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistantStaphylococcusaureuslineages[J]. Int J Med Microbiol, 2011, 301(1): 64-68.DOI: 10.1016/j.ijmm.2010.06.002

    DetectingSalmonellawithmatrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry

    ZHAO Jian-hong1, GAO Yan1, LI Shu-ming1, ZHANG Shi-yao1, WANG Heng-wei1, GU Lin1, HAN Qing-hua1, JIAO Yang1, CHEN Qian2

    (1.ChaoyangCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100021,China;2.BeijingCenterforDiseaseControlandPrevention,BeijingCenterforPreventiveMedicalResearch,Beijing100013,China)

    In order to optimize the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) method forSalmonellaidentification, study the target board pollution situation of different pretreatment methods, and establish a safe and effective method for detection ofSalmonella, we applied MALDI-TOF-MS technique to detect 4 standard strains ofSalmonellaunder different culture conditions and sample preparation method, and established optimization program. MALDI target board was detected under different preparation treatments. The optimization method was used to detect 33 strainsSalmonellawhich isolated from diarrhea patients’ stool. Identification results were compared with serological results. The study found that MALDI-TOF-MS method could accurate identify ofSalmonellain different pretreatment methods and culture medium. Thirty-three strains ofSalmonellaidentified by MALDI-TOF-MS method were all accurate appraisal in genus level, 19 strains of them were completely consistent with the serotyping identification results, 14 strains of them were not consistent with the serotyping identification results. There was no bacteria growth on the target board in different pretreatment methods. MALDI-TOF-MS method can in a fast,convenient,safe and accurate way identifySalmonella, and it can become an effective means for identification ofSalmonella.

    10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.008

    北京市開放基金(No.2015BZ0063-03)

    陳 倩,Email:cchenqian@263.net

    1.北京市朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心,北京 100021; 2.北京市疾病預(yù)防控制中心,北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100013

    R378.2

    :A

    :1002-2694(2017)08-0705-05

    2017-01-12編輯:梁小潔

    猜你喜歡
    靶板沙門分型
    一株雞白痢沙門菌噬菌體的發(fā)酵及后處理工藝研究
    沙門菌噬菌體溶菌酶LysSHWT1的制備及抑菌活性分析
    疊合雙層靶抗球形破片的侵徹能耗
    失眠可調(diào)養(yǎng),食補(bǔ)需分型
    具有攻角的鎢合金彈侵徹運(yùn)動(dòng)靶板的數(shù)值模擬研究
    彈丸斜撞擊間隔靶板的數(shù)值模擬
    2013-2017年北京市順義區(qū)腹瀉病例中沙門菌流行特征
    便秘有多種 治療須分型
    基于分型線驅(qū)動(dòng)的分型面設(shè)計(jì)研究
    頸椎病中醫(yī)辨證分型與影像探討
    午夜av观看不卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 两个人看的免费小视频| 秋霞在线观看毛片| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 免费看不卡的av| 大陆偷拍与自拍| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久精品免费免费高清| 51午夜福利影视在线观看| 成人国产麻豆网| 天美传媒精品一区二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 黄色视频不卡| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜日韩欧美国产| 丁香六月天网| 51午夜福利影视在线观看| 操美女的视频在线观看| 无限看片的www在线观看| 韩国精品一区二区三区| 亚洲视频免费观看视频| 波野结衣二区三区在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产野战对白在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产成人精品福利久久| 99国产综合亚洲精品| 18在线观看网站| 精品久久久久久电影网| 狂野欧美激情性xxxx| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 超碰97精品在线观看| 黄片小视频在线播放| 日韩av不卡免费在线播放| www.精华液| 欧美国产精品va在线观看不卡| 伊人久久国产一区二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 免费不卡黄色视频| 无限看片的www在线观看| av在线app专区| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 最近手机中文字幕大全| 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产精品久久久久成人av| 99久久人妻综合| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜av观看不卡| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲成人手机| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品一区蜜桃| 国产不卡av网站在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av | 丰满迷人的少妇在线观看| 久久精品国产综合久久久| 午夜激情av网站| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| h视频一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久av网站| 久久久国产精品麻豆| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产探花极品一区二区| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲成色77777| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品自拍成人| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩大片免费观看网站| 国产精品一区二区在线不卡| 天堂8中文在线网| 无限看片的www在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲人成网站在线观看播放| 51午夜福利影视在线观看| 成人国产麻豆网| 精品卡一卡二卡四卡免费| 97在线人人人人妻| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 丝瓜视频免费看黄片| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品一品国产午夜福利视频| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 多毛熟女@视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 中文天堂在线官网| 午夜免费鲁丝| 嫩草影视91久久| 国产av精品麻豆| 少妇的丰满在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品视频人人做人人爽| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 乱人伦中国视频| 丝袜美腿诱惑在线| 久久影院123| 老司机靠b影院| 精品酒店卫生间| 少妇人妻久久综合中文| 黄色视频在线播放观看不卡| 午夜福利,免费看| 波多野结衣一区麻豆| 日日爽夜夜爽网站| videos熟女内射| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 夫妻午夜视频| 中文字幕亚洲精品专区| 在线看a的网站| 久久久久精品国产欧美久久久 | 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 男女免费视频国产| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 黄色怎么调成土黄色| 免费黄网站久久成人精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美 日韩 精品 国产| 大陆偷拍与自拍| 一边亲一边摸免费视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产成人精品在线电影| 男女边吃奶边做爰视频| 久久久久久人妻| 午夜福利免费观看在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 国产一区二区在线观看av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲在久久综合| 精品久久久久久电影网| 久久人人爽人人片av| 黄色视频不卡| 日韩av免费高清视频| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲免费av在线视频| 欧美日韩精品网址| 看免费成人av毛片| 各种免费的搞黄视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 男女床上黄色一级片免费看| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 欧美xxⅹ黑人| 天美传媒精品一区二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 午夜老司机福利片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲国产精品国产精品| 麻豆av在线久日| av在线播放精品| 在现免费观看毛片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av男天堂| 国产精品免费视频内射| 99国产综合亚洲精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 18禁观看日本| 最新的欧美精品一区二区| 美女福利国产在线| 久久亚洲国产成人精品v| 精品国产一区二区久久| 亚洲精品第二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲伊人色综图| 一级片免费观看大全| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产xxxxx性猛交| 91aial.com中文字幕在线观看| 一级毛片我不卡| 少妇被粗大的猛进出69影院| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲人成77777在线视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品视频女| 美女福利国产在线| 久热这里只有精品99| 99热国产这里只有精品6| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲久久久国产精品| 国产成人免费观看mmmm| 久久久精品区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 一级毛片我不卡| 尾随美女入室| 少妇的丰满在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 免费观看性生交大片5| 国产免费又黄又爽又色| 日本午夜av视频| 在现免费观看毛片| 色网站视频免费| 成人漫画全彩无遮挡| 国产野战对白在线观看| 99香蕉大伊视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 91成人精品电影| 国产精品成人在线| 超碰成人久久| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲美女视频黄频| 欧美久久黑人一区二区| 下体分泌物呈黄色| 男女午夜视频在线观看| kizo精华| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人91sexporn| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品二区激情视频| 69精品国产乱码久久久| 久久青草综合色| 国产精品久久久久久精品古装| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 曰老女人黄片| 精品人妻在线不人妻| 最近中文字幕2019免费版| 观看av在线不卡| 搡老乐熟女国产| 一二三四在线观看免费中文在| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久亚洲精品成人影院| 丰满迷人的少妇在线观看| 丝袜喷水一区| 精品久久久久久电影网| 中文字幕制服av| 亚洲精品视频女| 婷婷色综合www| 看免费成人av毛片| 综合色丁香网| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久久久国产精品人妻一区二区| 制服丝袜香蕉在线| 一级毛片我不卡| 捣出白浆h1v1| 9色porny在线观看| 人妻 亚洲 视频| 七月丁香在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久性视频一级片| 久久久久国产精品人妻一区二区| 人成视频在线观看免费观看| 99久久综合免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 看免费av毛片| 乱人伦中国视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 午夜激情久久久久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久热这里只有精品99| 又大又爽又粗| 欧美中文综合在线视频| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人精品福利久久| 日韩制服骚丝袜av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 满18在线观看网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 美国免费a级毛片| www.自偷自拍.com| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 青草久久国产| 成人影院久久| 一区二区三区激情视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久精品久久精品一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产高清不卡午夜福利| 国产男人的电影天堂91| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产毛片在线视频| 性少妇av在线| av女优亚洲男人天堂| 黄色一级大片看看| av一本久久久久| 久久久国产欧美日韩av| 丝袜人妻中文字幕| 久久97久久精品| 亚洲第一青青草原| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 大码成人一级视频| 丝袜喷水一区| 久久久久视频综合| 日本91视频免费播放| 日韩制服骚丝袜av| 国产乱人偷精品视频| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲精品国产区一区二| 国产一区二区三区av在线| 久久影院123| 免费少妇av软件| 人人妻人人澡人人看| 免费日韩欧美在线观看| 成年动漫av网址| 又大又爽又粗| 美女福利国产在线| 男女午夜视频在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 黄片播放在线免费| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美在线黄色| 日韩大码丰满熟妇| 一级片'在线观看视频| www日本在线高清视频| 1024香蕉在线观看| av福利片在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费在线观看黄色视频的| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 五月天丁香电影| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 9色porny在线观看| 99国产精品免费福利视频| 欧美中文综合在线视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 曰老女人黄片| 久久天堂一区二区三区四区| 免费观看a级毛片全部| 亚洲成人手机| 免费黄频网站在线观看国产| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲av福利一区| 亚洲欧美激情在线| 亚洲成色77777| 精品一区在线观看国产| 久久精品国产a三级三级三级| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲国产欧美网| 日本欧美视频一区| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 高清不卡的av网站| 天天添夜夜摸| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av.在线天堂| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 如何舔出高潮| 亚洲av成人精品一二三区| 嫩草影视91久久| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 男人添女人高潮全过程视频| svipshipincom国产片| 男人添女人高潮全过程视频| www.熟女人妻精品国产| 高清视频免费观看一区二区| 高清不卡的av网站| 人体艺术视频欧美日本| 老司机亚洲免费影院| 成人毛片60女人毛片免费| www日本在线高清视频| 永久免费av网站大全| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久亚洲精品成人影院| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产黄色免费在线视频| 激情视频va一区二区三区| 制服诱惑二区| 老熟女久久久| 国产精品人妻久久久影院| 精品视频人人做人人爽| 国产高清国产精品国产三级| 国产一区二区三区综合在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 99精国产麻豆久久婷婷| 男人爽女人下面视频在线观看| 美女大奶头黄色视频| 少妇 在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产一级毛片在线| 性少妇av在线| 青春草视频在线免费观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费在线观看完整版高清| 黄色怎么调成土黄色| 女人久久www免费人成看片| 美女福利国产在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 少妇人妻精品综合一区二区| 免费观看a级毛片全部| 丝瓜视频免费看黄片| 一级毛片 在线播放| 国产xxxxx性猛交| 日韩制服骚丝袜av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 免费观看性生交大片5| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 大香蕉久久成人网| 久久精品国产综合久久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 国产日韩欧美亚洲二区| 街头女战士在线观看网站| 日本欧美国产在线视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 秋霞在线观看毛片| 精品免费久久久久久久清纯 | 18在线观看网站| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产成人一区二区在线| 国产精品 欧美亚洲| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产 一区精品| 日韩一区二区三区影片| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 色94色欧美一区二区| 国产精品久久久av美女十八| 少妇人妻久久综合中文| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美精品av麻豆av| 亚洲中文av在线| 美国免费a级毛片| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | videosex国产| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线观看免费日韩欧美大片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一级片'在线观看视频| a级片在线免费高清观看视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美激情高清一区二区三区 | 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲成人免费av在线播放| 国产精品欧美亚洲77777| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 丝袜脚勾引网站| 中文欧美无线码| 国产深夜福利视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲国产欧美一区二区综合| 青春草国产在线视频| 免费在线观看黄色视频的| 久久久国产欧美日韩av| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜福利免费观看在线| 老司机在亚洲福利影院| 婷婷色综合大香蕉| 免费少妇av软件| 亚洲国产精品一区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 下体分泌物呈黄色| 观看av在线不卡| av在线老鸭窝| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成人免费观看视频高清| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美精品一区二区免费开放| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 伦理电影免费视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久久视频综合| 国产成人一区二区在线| 亚洲综合精品二区| 超色免费av| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品三级大全| 伦理电影大哥的女人| 国产片特级美女逼逼视频| 国产一区二区三区av在线| 精品亚洲成a人片在线观看| www.熟女人妻精品国产| 90打野战视频偷拍视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 国产亚洲最大av| 国产免费现黄频在线看| 97人妻天天添夜夜摸| 看非洲黑人一级黄片| 青春草视频在线免费观看| 日本av手机在线免费观看| 国产av码专区亚洲av| 99热全是精品| 99热网站在线观看| 亚洲第一青青草原| 人妻人人澡人人爽人人| 在线观看免费日韩欧美大片| 在线观看人妻少妇| 人人澡人人妻人| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 十分钟在线观看高清视频www| 18禁国产床啪视频网站| 99九九在线精品视频| 1024视频免费在线观看| 国产乱人偷精品视频| 国产高清国产精品国产三级| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲精品第二区| 性少妇av在线| 尾随美女入室| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 黄片无遮挡物在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品久久久久成人av| 制服诱惑二区| 男人添女人高潮全过程视频| 黄色毛片三级朝国网站| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲伊人色综图| 中国国产av一级| 国产有黄有色有爽视频| 热re99久久精品国产66热6| e午夜精品久久久久久久| 亚洲第一青青草原| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲天堂av无毛| 精品视频人人做人人爽| 午夜福利视频精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲伊人色综图| 成人漫画全彩无遮挡| 国产伦人伦偷精品视频| 国产一级毛片在线| 午夜久久久在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 久热爱精品视频在线9| 亚洲av男天堂| 99国产精品免费福利视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品久久久精品久久久| 制服诱惑二区| avwww免费| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品偷伦视频观看了| 搡老岳熟女国产| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜日本视频在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲色图综合在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 涩涩av久久男人的天堂| 校园人妻丝袜中文字幕| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 精品第一国产精品| 在线看a的网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 制服丝袜香蕉在线| 免费黄网站久久成人精品| 青春草亚洲视频在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久久久久人妻| 精品第一国产精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 精品午夜福利在线看| 国产一卡二卡三卡精品 | 新久久久久国产一级毛片| 色视频在线一区二区三区| 国产精品 国内视频| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品福利永久在线观看| av在线app专区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品视频女| 免费少妇av软件|