煙曲霉Bem46基因敲除株構(gòu)建及其功能初步研究

李 雯，李佳娟，馮文莉，馬 彥

煙曲霉Bem46基因敲除株構(gòu)建及其功能初步研究

李 雯，李佳娟，馮文莉，馬 彥

目的構(gòu)建煙曲霉Bem46基因敲除株，初步明確Bem46基因在煙曲霉生長(zhǎng)出芽和各種壓力傳導(dǎo)中的作用，以及對(duì)細(xì)胞壁形成的影響。方法采用生物信息學(xué)方法查找煙曲霉中Bem46基因，設(shè)計(jì)引物，并以pyrG作為篩選標(biāo)記構(gòu)建煙曲霉Bem46基因敲除株(ΔBem46)。觀察含不同壓力物質(zhì)培養(yǎng)基上對(duì)照菌株和ΔBem46徑向生長(zhǎng)速度，觀察兩菌株發(fā)芽狀況以及在含有細(xì)胞壁抑制劑培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果通過(guò)序列比對(duì)在煙曲霉基因組中找到了Bem46基因，其編號(hào)為Afu7g04660，由1 116 bp堿基組成，編碼311個(gè)氨基酸。使用原生質(zhì)體法得到煙曲霉ΔBem46并經(jīng)PCR和Southernblot確認(rèn)。經(jīng)觀察在含有山梨醇作為滲透壓力來(lái)源的培養(yǎng)基上ΔBem46生長(zhǎng)明顯較對(duì)照菌株快。顯微鏡下觀察到在GMM液體培養(yǎng)基中，ΔBem46發(fā)芽速度慢于對(duì)照株。結(jié)論煙曲霉Bem46基因涉及由山梨醇引起的滲透壓壓力傳導(dǎo)，并且該基因?qū)Υ龠M(jìn)孢子發(fā)芽可能有作用。

Bem46；煙曲霉；發(fā)芽率；信號(hào)傳導(dǎo)

煙曲霉是自然界常見(jiàn)的一種絲狀真菌，在正常人群并不會(huì)由于經(jīng)常暴露于煙曲霉而發(fā)生感染。然而近年來(lái)隨著新技術(shù)的開(kāi)展和免疫抑制劑的應(yīng)用，免疫力低下的患者往往由于暴露于煙曲霉而引起侵襲性曲霉病的發(fā)生，其發(fā)病率在臨床呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)且病死率極高，因此探討煙曲霉感染的發(fā)病機(jī)制刻不容緩。煙曲霉致病同多種因素有關(guān)，而菌株在宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)芽，快速適應(yīng)宿主環(huán)境是致病的重要環(huán)節(jié)[1]。出芽蛋白Bem46是α/β水解酶超家族成員，在進(jìn)化上相對(duì)保守，在模式真菌粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)中出芽蛋白Bem46在其子囊孢子發(fā)芽及菌絲形成的過(guò)程中有重要作用[2]。該基因在常見(jiàn)的致病真菌如白念珠菌、煙曲霉中的作用目前尚不了解，為了進(jìn)一步了解其在煙曲霉致病中的作用，幫助我們深入了解煙曲霉的致病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)可能的新藥物靶點(diǎn)，我們對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的研究。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 煙曲霉Ku80作為對(duì)照菌株，煙曲霉轉(zhuǎn)化用宿主菌為Ku80 pyrG-，該菌株為嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷株，在沒(méi)有尿苷和尿嘧啶的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。篩選標(biāo)記pyrG來(lái)源于質(zhì)粒pJW24(由杜克大學(xué)William J. Steinbach教授贈(zèng)送)。

1.2 培養(yǎng)基 GMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1L)：20×鹽溶液50 mL，微量元素液1 mL，D-葡萄糖10 g，瓊脂15 g(1.5%)，pH值6.5；溶壁酶: Vinoflow FCE (Novozymes公司)；Osmotic Media：1.2 mol/L MgSO4, 10 mmol/L sodium phosphate，4 ℃保存；STC溶液：1.2 mol/Lsorbitol, 10 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，在4 ℃保存；PEG-CaCl2溶液：60% PEG, 50 mmol/L CaCl2, 50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5在室溫(25 ℃)保存。0.7%頂層瓊脂培養(yǎng)基(SMM) ： 20×鹽溶液 50 mL，微量元素液1 mL，葡萄糖10 g，瓊脂7 g，山梨醇218.6 g，酵母提取物 1g，pH值6.5，加水至1 L，高壓滅菌20 min。

1.3 生物信息學(xué)分析 在煙曲霉基因組中(www.aspergillusgenome.org)找出與N.crassa同源的Bem46基因開(kāi)放讀碼框及其上下游各約1 000 bp序列，進(jìn)行分析,并與常見(jiàn)致病真菌進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.4 構(gòu)建Bem46基因敲除株

1.4.1Bem46基因克隆及敲除載體的構(gòu)建 煙曲霉Ku80 pyrG-在過(guò)夜培養(yǎng)，收集菌絲；采用冷凍干燥法提取基因組DNA。設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增Bem46基因5′和3′側(cè)翼序列各約1.0 kb的DNA序列。使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI，SalI，XbaI和BamHI，將相應(yīng)克隆片段連接入質(zhì)粒pJW24，最后得到目的片段產(chǎn)物大小4 869 bp，定量5μg后進(jìn)行煙曲霉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。試驗(yàn)中用到的引物見(jiàn)表1。

1.4.2 原生質(zhì)體法構(gòu)建Bem46基因敲除株 Ku80 pyrG-菌懸液2 mL，30 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)(16～20 h)。40mLOsmotic Media中溶解3 g Vinoflow FCE，加入收集的菌絲并混勻，28 ℃，75 r/min搖床培養(yǎng)3～4 h。4 ℃，3 500 r/min離心10 min，吸出離心管夾層的原生質(zhì)體，并加3倍體積的STC混勻，離心。吸出原生質(zhì)體層，用1 mL的STC重懸原生質(zhì)體。取5 μg的融合酶切產(chǎn)物加入到200 μL的原生質(zhì)體中，冰上靜置1 h。將200 μLDNA-原生質(zhì)體放入到1.25 mL的PEG-CaCl2中混勻，室溫(25 ℃)放置20 min，加入4 mLSTC混勻，取400 μL與10 mL SMM頂層培養(yǎng)基混合后鋪板，放置于37 ℃孵箱中培養(yǎng)。具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

1.5 Bem46基因敲除株驗(yàn)證

1.5.1 首先使用PCR法進(jìn)行驗(yàn)證 在GMM液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)化子，并提取基因組DNA。并設(shè)計(jì)相關(guān)引物進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證用引物見(jiàn)表1。1.5.2 通過(guò)Southernblot進(jìn)行驗(yàn)證 設(shè)計(jì)探針，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。探針設(shè)計(jì)上下游引物序列命名為Bem46-probe-F，Bem46-probe-R 具體序列見(jiàn)表1。

1.6 Bem46相關(guān)功能研究

1.6.1 Ku80與ΔBem46在不同生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)狀況對(duì)比。生長(zhǎng)條件分別為：37 ℃時(shí)GMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含卡泊芬凈(1 μg/mL和4 μg/mL)和尼可霉素(1 μg/mL)的培養(yǎng)基、含過(guò)氧化氫(1 mmol/L, 2 mmol/L，3 mmol/L)和甲酰胺(10 μmol/L和50 μmol/L)的培養(yǎng)基、含有氯化鈉(1 mol/L)和山梨醇(1.2 mol/L)的培養(yǎng)基，及55 ℃時(shí)GMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別將Ku80與ΔBem46孢子10 μL( 1×106個(gè))點(diǎn)種于平皿中央，每日記錄菌落直徑，并拍照。

1.6.2 孢子發(fā)芽率實(shí)驗(yàn) 分別取100 μL濃度為1×107個(gè)/mL的Ku80及ΔBem46菌懸液，并分別加入到10 mL的GMM液體培養(yǎng)基，在37 ℃以200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床孵育。從腫脹孢子階段(大約4 h)開(kāi)始，每30 min在顯微鏡下觀察一次，并計(jì)數(shù)孢子的發(fā)芽百分率，重復(fù)3次。

1.6.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 采用SPSS22.0重復(fù)測(cè)量方差分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果 在煙曲霉基因組中通過(guò)序列比對(duì)找到了Afu7g04660，1 116 bp個(gè)堿基編碼311個(gè)氨基酸。380-715堿基間編碼水解酶的保守區(qū)域。在細(xì)胞極性，孢子發(fā)芽，以及定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜都有重要的意義。序列比對(duì)見(jiàn)圖1,可知煙曲霉Bem46基因同常見(jiàn)致病菌種的同源基因有較強(qiáng)的同源性。

2.2 構(gòu)建Bem46基因敲除載體結(jié)構(gòu) 如圖2Bem46全基因使用篩選標(biāo)記pyrG替代。設(shè)計(jì)探針并使用KpnI酶切, Suthernblot驗(yàn)證時(shí)在對(duì)照菌株和ΔBem46產(chǎn)生不同條帶，分別為4.8 kb和2.3 kb。

2.3 基因敲除株驗(yàn)證結(jié)果 經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化煙曲霉共得到6株轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證主要通過(guò)PCR法和Southernblot進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 試驗(yàn)中使用到的引物Tab.1 Primer were used in the construction of ΔBem46

圖1 煙曲霉，構(gòu)巢曲霉，白念珠菌和粗糙脈孢霉中 Bem46基因序列同源性比對(duì)Fig.1 Homologous sequence alignment results of Bem46 gene among the A. fumigatus, A. nidulans, Candida albicans and Neurospora crassa

圖2 構(gòu)建Bem46基因敲除載體示意圖Fig.2 Strategy for deleting Bem46 gene by replacing with pyrG gene by homologous recombination

2.3.1 驗(yàn)證 根據(jù)Bem46序列設(shè)計(jì)了如下引物擴(kuò)增和驗(yàn)證使用了2對(duì)引物來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證，第1對(duì)引物證明有篩選標(biāo)記的插入，第2對(duì)引物證明基因敲除株同對(duì)照之間的不同。具體實(shí)驗(yàn)用引物見(jiàn)表1。

2.3.2 用PCR及Southernblot驗(yàn)證ΔBem46 圖3a為PCR驗(yàn)證所需引物擴(kuò)增Ku80及ΔBem46引物的相應(yīng)片段大?。粓D3b為使用第1對(duì)引物PCR驗(yàn)證結(jié)果；圖3c為使用第2對(duì)引物PCR驗(yàn)證結(jié)果；圖3d為Southernblot驗(yàn)證結(jié)果。

由圖3b可見(jiàn)對(duì)照菌株未擴(kuò)增出該基因，而轉(zhuǎn)化子1,2,4,5,6,7均有篩選標(biāo)記擴(kuò)增成功，說(shuō)明轉(zhuǎn)化子中有pyrG成功插入；由圖3c可見(jiàn)只有2號(hào)和4號(hào)擴(kuò)增出大約5.3 kb的片段；根據(jù)煙曲霉Bem46基因敲除構(gòu)建示意圖可見(jiàn)對(duì)基因DNA酶切后進(jìn)行探針標(biāo)記驗(yàn)證，在對(duì)照菌株和煙曲霉Bem46基因敲除株應(yīng)該有2條明顯不同的條帶，在煙曲霉Bem46基因敲除大約可見(jiàn)2.3 kb大小條帶，而在對(duì)照菌株可見(jiàn)約為4.8 kb大小的條帶。由圖3d可見(jiàn)在2號(hào)菌株確實(shí)只有一條大小約為2.3 kb的條帶，而對(duì)照菌株和1、3、5號(hào)基因敲除株均有大小約為4.8 kb的條帶，說(shuō)明只有2號(hào)菌株為正確的基因敲除株。該菌株用來(lái)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.4 觀察Bem46基因?qū)熐瓜嚓P(guān)功能的影響：

2.4.1 對(duì)照菌株與ΔBem46在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況 圖4a為二者在普通GMM培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)比較；圖4b為二者在含有卡泊芬凈和尼可霉素2種藥物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)結(jié)果比較；圖4c為在含有不同濃度過(guò)氧化氫培養(yǎng)基上二者菌落直徑生長(zhǎng)速度比較；圖4d為在含有不同濃度甲酰胺培養(yǎng)基上二者生長(zhǎng)速度比較；圖4e為在含有氯化鈉、山梨醇的培養(yǎng)基上和不同溫度條件下二者生長(zhǎng)結(jié)果比較。

圖3 PCR及Southernblot驗(yàn)證ΔBem46Fig.3 Confirmation of ΔBem46 by PCR and Southernblot

圖4 Ku80與ΔBem46在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況比較Fig.4 Comparison on the growth diameter of the Ku80 and the ΔBem46 on different medium

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在GMM培養(yǎng)基上，Ku80與ΔBem46生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異；在對(duì)抑制真菌細(xì)胞壁藥物敏感試驗(yàn)中可見(jiàn)煙曲霉對(duì)照菌株與Bem46基因敲除株在含有卡泊芬凈和尼可霉素這2種藥物的平皿上生長(zhǎng)無(wú)明顯差異；對(duì)氧化壓力敏感性試驗(yàn)中，對(duì)照菌株與ΔBem46在含有不同濃度過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基、及含有不同濃度甲酰胺的培養(yǎng)基上二者的生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異；對(duì)滲透壓敏感試驗(yàn)和溫度敏感試驗(yàn)中，55 ℃條件下，二者生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異，以氯化鈉介導(dǎo)的滲透壓變化也沒(méi)有對(duì)二者的生長(zhǎng)狀況產(chǎn)生影響，但在以山梨醇介導(dǎo)的滲透壓變化使得二者的生長(zhǎng)狀況產(chǎn)生了差異，即在濃度為1.2 mol/L的山梨醇培養(yǎng)基上，煙曲霉Bem46基因缺陷株明顯較對(duì)照菌株Ku80生長(zhǎng)要快。以上菌落直徑結(jié)果均經(jīng)SPSS22.0軟件分析。

圖5 Ku80與ΔBem46發(fā)芽率百分率比較Fig.5 Comparison on the germination rate of the Ku80 and the ΔBem46

2.4.2 觀察煙曲霉Bem46基因在孢子發(fā)芽中的作用見(jiàn)圖5，經(jīng)SPSS22.0軟件分析，由圖可見(jiàn)，在13 h時(shí)，對(duì)照株Ku80已經(jīng)完全發(fā)芽，而缺陷株ΔBem46在15 h時(shí)才實(shí)現(xiàn)完全發(fā)芽，缺陷株ΔBem46出芽明顯滯后于對(duì)照株Ku80(F=3536.191，P<0.05)。15 h后二者均全部發(fā)芽。

3 討 論

煙曲霉是主要的致病絲狀真菌，尤其在中性粒細(xì)胞減少的患者中感染煙曲霉可以發(fā)展成為侵襲性曲霉病，如果造成播散型感染就可能有較差的預(yù)后[5]。盡管在診斷技術(shù)和抗真菌藥物的研究上取得了很大的進(jìn)步，但是侵襲性曲霉病的發(fā)病和致死率仍然很高，也就顯得對(duì)煙曲霉生理生化性質(zhì)以及其同煙曲霉的致病性，抗真菌藥物敏感性相關(guān)性的一些細(xì)節(jié)研究更有必要[6]。目前對(duì)Bem46蛋白了解有限，只對(duì)模式絲狀真菌N.crassa有所研究，在N.crassa中該基因在子囊孢子發(fā)芽是必須的，且該基因定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜[2]，在N.crassa該基因編碼的蛋白在細(xì)胞特異性種類(lèi)極性的形成是必不可少的，Bem46基因定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周，在靠近細(xì)胞膜處形成斑點(diǎn)狀[7-8]。鑒于N.crassa同致病真菌煙曲霉基因同源性較高，是非常好的絲狀真菌的模式菌，我們推測(cè)該基因可能在煙曲霉中有類(lèi)似作用。因而我們構(gòu)建了該基因缺陷株。通過(guò)原生質(zhì)體法我們成功獲得煙曲霉Bem46基因缺陷株ΔBem46，并且觀察了其對(duì)煙曲霉一般生長(zhǎng)性狀的影響。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，我們發(fā)現(xiàn)該基因的缺失對(duì)于煙曲霉的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。煙曲霉細(xì)胞壁的合成是其生長(zhǎng)過(guò)程中重要的一環(huán)，如果合成出現(xiàn)異常，則可能為我們提供新的藥物靶點(diǎn)。因此，我們選擇了臨床常用的2種影響細(xì)胞壁合成的藥物卡泊芬凈和尼克霉素Z。卡泊芬凈主要抑制β-1，3葡聚糖合成酶，阻礙葡聚糖的形成，而尼克霉素Z的作用機(jī)制抑制細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的合成，這2種藥物從不同的方面來(lái)驗(yàn)證該基因是否在煙曲霉細(xì)胞壁形成過(guò)程中發(fā)揮作用，由我們的結(jié)果可見(jiàn)Bem46這個(gè)基因在含有此2種物質(zhì)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度同對(duì)照菌株并沒(méi)有明顯差異，因此我們推測(cè)該基因可能并不參與煙曲霉細(xì)胞壁的合成。以往的研究表明氧化壓力、滲透壓力以及溫度對(duì)于煙曲霉的致病都有重要的意義[9]，因此我們進(jìn)一步研究了該基因在氧化壓力、滲透壓力和溫度敏感性中的作用。本研究顯示該基因?qū)τ谶^(guò)氧化氫和甲酰胺產(chǎn)生的氧化壓力和對(duì)照菌株沒(méi)有明顯的差異，也就是對(duì)這兩種物質(zhì)產(chǎn)生的氧化壓力不敏感，可能不參與其產(chǎn)生的氧化壓力的傳導(dǎo)。在滲透壓力的敏感性中，由氯化鈉產(chǎn)生的滲透壓力并未對(duì)二者生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因缺陷株ΔBem46對(duì)山梨醇產(chǎn)生的滲透壓力呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，即相比野生對(duì)照菌株而言其生長(zhǎng)明顯加快，推測(cè)也許Bem46參與了由山梨醇介導(dǎo)的滲透壓力傳導(dǎo)通路，在山梨醇存在的條件下，Bem46基因有抑制生長(zhǎng)的作用。在比較二者孢子發(fā)芽的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，缺陷株實(shí)現(xiàn)完全發(fā)芽的時(shí)間明顯慢與對(duì)照株實(shí)現(xiàn)完全發(fā)芽的時(shí)間，即Bem46基因的缺失導(dǎo)致了其發(fā)芽滯后，而15 h后二者均全部發(fā)芽，表明Bem46基因的缺失并不會(huì)阻止煙曲霉孢子發(fā)芽。所以我們推測(cè)，Bem46基因極有可能有促進(jìn)孢子出芽的作用，參與孢子的出芽生長(zhǎng)過(guò)程,但其并不是煙曲霉孢子出芽的決定性基因。

總之，研究通過(guò)構(gòu)建煙曲霉Bem46基因缺陷株，初步了解該基因?qū)熐股L(zhǎng)狀況的影響，提示可以從山梨醇介導(dǎo)的滲透壓傳導(dǎo)通路入手，研究Bem46基因?qū)熐股L(zhǎng)的抑制作用；Bem46基因缺陷使得發(fā)芽速度減慢提示可從參與孢子出芽過(guò)程的基因入手，研究其對(duì)出芽生長(zhǎng)的傳導(dǎo)通路產(chǎn)生的影響；研究也將進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，以期發(fā)現(xiàn)該基因更多更有意義的性狀。

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ConstructionofBem46knockoutstrainandtheroleoftheBem46geneinAspergillusfumigatus

LI Wen, LI Jia-juan, FENG Wen-li, MA Yan

(DepartmentofDermatologyandVenereology,theSecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

The aims of this study are to construct theBem46 knockout strain ofAspergillusfumigatus, investigate the effect of theBem46 in the growth and germination, and observe the sensitivity of the oxidative stress, the osmotic stress, the temperature and the response to caspofungin and nikkomycin. TheBem46 gene was identified by sequence alignment inA.fumigatusgenome database. TheBem46 knockout strain was construction by the protoplast. The growth was observed and compared between Ku80 and ΔBem46 on different culture medium, such as GMM, GMM containing hydrogen peroxide, formamide, sodium chloride and sorbitol. The growth diameter was measured under the different temperatures. The germination rate was observed and compared by microscope. Results showed that theBem46 gene, Afu7g04660, contained 1 116 bp bases pair and encoding 311 amino acids. Six transformants were obtained by gene cloning and protoplast method and only one was confirmed by PCR and Southernblot. The ΔBem46 grew significantly faster than the control strain on the medium containing sorbitol. And there were no visible difference between ΔBem46 and Ku80 on the other medium. The germination rate of the ΔBem46 was more retarded than the Ku80 in GMM liquid medium. In conclusion, theBem46 gene plays a role in osmotic stress inA.fumigatusand involved in osmotic pressure induced by sorbitol. And there is no visible effect in oxidative stress. TheBem46 gene has a positive effect on spore germination.

Bem46;Aspergillusfumigatus; germination rate; signal transduction

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.006

國(guó)家青年科學(xué)基金項(xiàng)目資助(No.81101233)，山西省青年科技研究基金(No.2010021036-2)，山西省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(No.2015043)，山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No.2016-052)聯(lián)合資助

馬 彥： Email:mayan197522@163.com

山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，太原 030001

Supported by the National Science Foundation for Young Scientists of China(No. 81101233), the Natural Science Foundation for Youth in Shanxi Province (No.2010021036-2), the Research Project of Health and Family Planning Commission of Shanxi Province (No.2015043), and the Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China (No.2016-052) Corresponding author: Ma Yan, Email: mayan197522@163.com

R378

：A

：1002-2694(2017)08-0694-06

2016-11-14編輯：梁小潔