山東地區(qū)非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)情況及臨床特征分析

喬秀麗 艾丹 梁洪陸 穆殿斌 郭其森

肺癌可分為小細(xì)胞癌和非小細(xì)胞癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）等，其中NSCLC約占80%-85%，傳統(tǒng)的化療和放療缺乏特異性，副作用較大，大約66%的NSCLC患者在確診時(shí)已是晚期，總體預(yù)后較差。2004年-2006年，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因作為新發(fā)現(xiàn)的NSCLC驅(qū)動(dòng)基因，引起全球腫瘤學(xué)領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注[1,2]。隨著人類(lèi)基因組學(xué)和蛋白組學(xué)突破性的進(jìn)步，目前在肺癌中發(fā)現(xiàn)10余種驅(qū)動(dòng)基因，這些驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè)為肺癌的治療和生存期的延長(zhǎng)提供重要幫助。2014年《非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》除了繼續(xù)推薦對(duì)于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的NSCLC患者進(jìn)行EGFR突變和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）重排檢測(cè)外，更加強(qiáng)調(diào)治療初期的多重癌基因檢測(cè)。本研究通過(guò)檢測(cè)山東地區(qū)NSCLC患者的EGFR、棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4-ALK（echinoderm microtubule-associated protein-ALK, EML4-ALK）、肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase, ROS1）、鼠類(lèi)肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS）基因表達(dá)情況，分析陽(yáng)性標(biāo)本的臨床病理特征，為篩選分子靶向治療特異人群提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2014年1月-2016年5月期間山東省腫瘤醫(yī)院確診的NSCLC患者的石蠟標(biāo)本，完善臨床信息，包括：年齡、性別、病理類(lèi)型、吸煙史等。所有標(biāo)本均為通過(guò)纖維支氣管鏡或計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）引導(dǎo)下肺腫瘤穿刺并病理檢測(cè)診斷為NSCLC病例標(biāo)本。

1.2 檢測(cè)方法 石蠟標(biāo)本RNA提取試劑盒和DNA提取試劑盒均為美國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品， EGFR基因29種突變檢測(cè)試劑盒（熒光探針PCR），EML4-ALK融合基因檢測(cè)試劑盒（熒光探針PCR)，ROS1融合基因檢測(cè)試劑盒（兩步RT-PCR法）、人類(lèi)K-ras基因7種突變檢測(cè)試劑盒（熒光探針PCR）均采用廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料采用卡方檢驗(yàn)或精確概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（雙側(cè)檢驗(yàn)）。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 共收集514例NSCLC病例標(biāo)本，其中2014年病例117例，2015年255例，2016年142例。最小年齡30歲，最大年齡85歲，平均年齡（59.68±11.19）歲。男性306例，女性208例，男女性別比為1.47:1。按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）肺癌組織分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織分型，腺癌為422例，鱗癌為72例，其他為20例（腺鱗癌、大細(xì)胞肺癌、肉瘤樣癌）。吸煙人數(shù)300例，不吸煙人數(shù)為214例，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)化放療。

2.2 EGFR基因突變情況及其與臨床特征的關(guān)系 共有466例病例開(kāi)展EGFR基因檢測(cè)，其中突變樣本數(shù)171例，陽(yáng)性率為36.70%，其中18外顯子突變2例，突變率為0.43%。19外顯子突變63例，突變率為13.52%，20外顯子突變6例，突變率為1.28%，21外顯子突變88例，突變率為18.88%。雙基因突變12例，突變率為2.58%。171例陽(yáng)性標(biāo)本中，21外顯子L858R突變所占比例最高為50.27%，其次為19外顯子缺失突變，占總突變數(shù)的36.61%，20外顯子T790M突變占突變總數(shù)的7.10%，其他類(lèi)型所占比例較低，詳見(jiàn)表1。此外，發(fā)現(xiàn)12例兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變的病例，其中4例19外顯子缺失突變合并20外顯子T790M位點(diǎn)突變，5例21外顯子L858R位點(diǎn)突變合并20外顯子T790M位點(diǎn)突變。2例18外顯子G719X合并20外顯子S768I位點(diǎn)突變，1例18外顯子G719X合并21外顯子L861Q位點(diǎn)突變。

≤60歲年齡組EGFR基因突變率略高于60歲以上年齡組人群，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.86, P＜0.05）。女性EGFR基因突變率顯著突變率高于男性，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.42, P＜0.05）。腺癌EGFR基因突變率顯著高于其他病理類(lèi)型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.86, P＜0.05）。不吸煙人群EGFR基因突變率顯著高于吸煙人群，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.93,P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表 1 山東地區(qū)NSCLC病例EGFR基因突變類(lèi)型分析Tab 1 Characteristic of EGFR gene mutation types in 466 NSCLC patients

表 2 山東地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系Tab 2 Correlation between EGFR gene mutation and clinical features in 466 NSCLC patients

2.3 EML4-ALK融合基因表達(dá)情況及與臨床特征的關(guān)系共491例病例開(kāi)展EML4-ALK融合基因檢測(cè)，融合基因陽(yáng)性率為9.37%。60歲以下年齡組EML4-ALK融合基因重排陽(yáng)性率明顯高于60歲以上年齡組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.10, P＜0.05）。女性EML4-ALK融合基因重排陽(yáng)性率高于男性，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.75,P＞0.05）。腺癌的EML4-ALK融合基因重排陽(yáng)性率略高于鱗癌，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.38, P＞0.05）。不吸煙人群的EML4-ALK融合基因重排陽(yáng)性率顯著高于吸煙人群，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.42, P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

2.4 ROS1融合基因表達(dá)及與臨床特征的關(guān)系 共136例病例開(kāi)展ROS1融合基因檢測(cè)，重排陽(yáng)性率為3.68%，60歲以下年齡組ROS1融合基因重排陽(yáng)性率明顯高于60歲以上年齡組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.032, P＜0.05）。未發(fā)現(xiàn)該基因陽(yáng)性與性別、吸煙史和組織類(lèi)型有明顯關(guān)聯(lián)，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表4。

2.5 KRAS基因表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 23份病例標(biāo)本開(kāi)展KRAS基因檢測(cè)，陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)2例，陽(yáng)性率為8.70%。2份陽(yáng)性標(biāo)本均為60歲以上病例，男女各占1例，病理類(lèi)型均為腺癌，均無(wú)吸煙史。

2.6 EGFR、EML4-ALK、ROS1、KRAS基因關(guān)聯(lián)性分析 454例病例開(kāi)展兩種及以上基因突變情況檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)有兩種基因同時(shí)陽(yáng)性的病例。

表 3 山東地區(qū)NSCLC病例EML4-ALK融合基因重排情況及其與臨床特征的關(guān)系Tab 3 Correlation between EML4-ALK fusion gene rearrangements and clinical features in 491 NSCLC patients

表 4 山東地區(qū)NSCLC病例ROS1融合基因重排情況及其與臨床特征的關(guān)系Tab 4 Correlation between ROS1 gene rearrangements and clinical features in 136 NSCLC patients

3 討論

EGFR是目前最主要的分子治療靶點(diǎn)，有文獻(xiàn)報(bào)道的EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的突變已達(dá)30余種，目前具有靶向治療意義的大致分為3類(lèi)：19外顯子的缺失、18和21外顯子的單核苷酸的替換突變及20外顯子的復(fù)制突變，其中21外顯子的L858R和19外顯子的缺失突變占絕大多數(shù)。不同地域EGFR基因突變種類(lèi)不盡相同，如我國(guó)昆明地區(qū)EGFR基因突變?nèi)堪l(fā)現(xiàn)在19外顯子，而江浙地區(qū)患者EGFR基因突變主要為19和21外顯子[3-6]。本研究顯示山東地區(qū)EGFR基因突變率為36.70%，突變主要為19和21外顯子突變，合計(jì)占突變總數(shù)的87.97%；突變?nèi)巳褐饕獮榕?、腺癌、不吸煙患者與既往研究一致，與江浙地區(qū)人群一致。

EGFR受體抑制劑包括小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）和單克隆抗體。研究[7]顯示并不是所有的患者都能從EGFR-TKI中獲益，易瑞沙肺癌生存評(píng)估（The IRESSA Survival Evaluation in Lung Cancer,ISEL）研究發(fā)現(xiàn)，女性、不吸煙者、腺癌及東亞人群從EGFR-TKI中獲益最大。2004年，Lynch[2]和Paez[1]等首次提出，EGFR-TKI對(duì)不同NSCLC的治療效果的差異是由于EGFR外顯子的突變狀態(tài)不同。EGFR19或/和21外顯子的突變異常將導(dǎo)致EGFR結(jié)合ATP的能力增加，從而加強(qiáng)了TKI的療效，而20外顯子突變可使腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生抵抗性[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)20外顯子T790M和S768I突變分別占到突變總數(shù)的7.10%和2.19%，12例兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變的病例中4例19外顯子缺失突變合并20外顯子T790M位點(diǎn)突變，5例21外顯子L858R位點(diǎn)突變合并20外顯子T790M位點(diǎn)突變。在開(kāi)展分子靶向治療人群選擇時(shí)應(yīng)引起重視。

既往研究[11-14]顯示，EML4-ALK融合基因在東亞地區(qū)肺癌患者中發(fā)生率為3%-7%，且更易表達(dá)于肺腺癌這一組織學(xué)亞型中。我國(guó)林小梅[15]等研究EML4-ALK融合基因陽(yáng)性率為7.8%，多出現(xiàn)在小年齡、女性、不吸煙患者中。鐘山等[16]研究268例NSCLC患者中EML4-ALK融合基因重排陽(yáng)性率為4.1%，多出現(xiàn)在≤60歲、女性、不吸煙患者中，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。朱翔等[17]研究發(fā)現(xiàn)525例肺癌患者中ALK免疫組化陽(yáng)性率為5.14%，多出現(xiàn)在年輕患者、女性、肺腺癌中，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。潘麗霞等[18]研究252例NSCLC患者EML4-ALK融合基因重排陽(yáng)性率為4.7%，基因突變多為女性、年齡較小者（≤60歲），與吸煙史和病理類(lèi)型無(wú)關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)山東NSCLC患者EML4-ALK融合基因重排陽(yáng)性率為9.37%，主要為60歲以下不吸煙人群，病理類(lèi)型和性別間無(wú)明顯差異，與既往研究略有差異，需要進(jìn)一步分析。

ROS1屬于酪氨酸激酶胰島素受體基因，在NSCLC中，最早確認(rèn)ROS1易位報(bào)道是在一位亞洲患者中，代表一類(lèi)新的獨(dú)特的NSCLC分子亞型，其發(fā)生頻率為1%-2%，遠(yuǎn)低于EGFR突變和ALK重排變異，且存在一定的種族差異[20,21]，但在EGFR/KRAS/ALK均陰性的人群中發(fā)生率則可明顯提高到5.7%[22]。ROS1基因重排陽(yáng)性與ALK重排陽(yáng)性的NSCLC患者具有相似性的臨床特征，即為年輕、從不吸煙且為高惡性度趨勢(shì)的肺腺癌患者[20-23]。研究顯示運(yùn)用即時(shí)PCR法檢測(cè)302例肺癌腫瘤組織樣本，12例檢測(cè)出ROS1融合基因陽(yáng)性，總陽(yáng)性檢出率為3.97%。但是年齡、性別、吸煙、組織類(lèi)型均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。本研究ROS1融合基因重排陽(yáng)性率為3.68%，突變?nèi)巳褐饕獮樾∧挲g組患者。由于ROS1與ALK的酪氨酸激酶區(qū)域約有49%的同源性，目前至少有4種ALK的抑制劑也可作為ROS1的抑制劑，因此雖然該基因突變率較低，但開(kāi)展ROS1基因研究具有重要意義。

KRAS陽(yáng)性表達(dá)會(huì)使患者的生存預(yù)后顯著降低，2014年《非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》明確指出：當(dāng)KRAS基因發(fā)生突變時(shí)，不建議使用EGFR-TKIs靶向治療藥物。該基因點(diǎn)突變以第2號(hào)外顯子11、12、13、59和61密碼子多見(jiàn)，其中96%發(fā)生在第2號(hào)外顯子12、13密碼子。這些密碼子編碼的氨基酸是KARS蛋白與GTP酶活化蛋白（GAP）作用位點(diǎn)。研究顯示與EGFR不同，KRAS突變常見(jiàn)于吸煙、腺癌患者，20%見(jiàn)于白種人，5%見(jiàn)于黃種人[23-26]。國(guó)內(nèi)研究[27]205例EGFR陰性NSCLC患者中KARS基因突變陽(yáng)性率為23.8%，多為男性、小于65歲、腺癌患者，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。張卉等[28]研究395例肺腺癌患者中KRAS基因突變率為7.8%，在性別、年齡、臨床分期、吸煙史組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本次研究發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)NSCLC病例KRAS基因突變率為8.70%，兩例陽(yáng)性突變均為G12A，均為60歲以上病例，男女各占1例，病理類(lèi)型均為腺癌，均無(wú)吸煙史。由于其檢測(cè)數(shù)量較少，人群特征需要進(jìn)一步觀察。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)有兩種基因同時(shí)陽(yáng)性的病例，與多數(shù)研究報(bào)告相一致。雖然有研究報(bào)道EGFR基因和EML4-ALK融合基因同時(shí)陽(yáng)性的病例，但是這種現(xiàn)象仍屬于罕見(jiàn)現(xiàn)象[29-31]。

綜上所述，NSCLC患者EGFR、EML4-ALK、ROS1、KARS基因突變?nèi)巳壕哂胁煌呐R床病理特征，對(duì)腫瘤患者進(jìn)行準(zhǔn)確的基因檢測(cè)，分析臨床病理特征，找到合適人群，可使治療效果最大化。