冠心顆粒的標(biāo)準(zhǔn)研究

胡北　張朝紳　姜范成

[摘要] 目的 建立冠心顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 采用薄層色譜法（TLC）對(duì)冠心顆粒中丹參、三七進(jìn)行定性鑒別；采用2015年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并對(duì)2批次樣品進(jìn)行微生物限度檢查；采用高效液相色譜法對(duì)丹酚酸B進(jìn)行含量測(cè)定：色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為以甲醇-乙腈-1%甲酸水溶液（29∶9∶62），流速為1.0 mL/min檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm。 結(jié)果 TLC鑒別斑點(diǎn)清晰、分離較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；2批冠心顆粒微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)各菌的回收率均在50%～200%，且均未檢出大腸埃希菌，驗(yàn)證組可檢出大腸埃希菌，該方法可行；丹酚酸B在0.06～0.54 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.9998），平均加樣回收率為98.61%，RSD = 1.24%（n = 6）；2批樣品含量測(cè)定結(jié)果均符合要求。 結(jié)論 本方法所用定性、定量及微生物限度檢查方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，能有效控制冠心顆粒的藥品質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 冠心顆粒；薄層色譜法；微生物限度檢查；丹酚酸B；高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R286.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）07（a）-0012-05

[Abstract] Objective To establish the quality standard of Guanxin Keli. Methods TLC method was used for the qualitative identification of Salvia miltiorrhiza Bge.， Panax notoginseng （Burk） F.H.Chen； the method validation was conducted by using microbial limit test in Chinese Pharmacopoeia 2015. 2 batches of Guanxin granules were tested under the validated method. HPLC was used to determine the content of salvianolic acid B. The determination was performed on KromasilC18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-1% formic acid water （29∶9∶62） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 286 nm. Results TLC spots were clear and well-separated without negative interference. The recoveries of each validation strain for the total aerobic micribial count， total yeasts and mold count were among 50%-200%， and did not test E. coli. This validation of method could test E. coli， and was capable. The linear range of salvianolic acid B was 0.06-0.54 mg/mL （r = 0.9998） with an average recovery of 98.61 %， RSD = 1.24% （n = 6）； the content of two batchs samples were satisfactory. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible. It is effective in controlling the quality of Guanxin Keli and providing the basis for improving the quality standas of Guanxin Keli.

[Key words] Guanxin Keli； TLC； Microbial limit test； Salvianolic acid B； HPLC

冠心顆粒是沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）自主研發(fā)的制劑，在我院已臨床應(yīng)用多年，由丹參、當(dāng)歸、川芎、三七、降香5味中藥組成，此制劑用于治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、供血不足導(dǎo)致的冠心病、心絞痛、心肌梗塞即中醫(yī)的“胸痹”。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)丹參中丹酚酸B的含量進(jìn)行檢測(cè)，并采用薄層色譜法（TLC）對(duì)方中丹參、三七進(jìn)行鑒別；參照2015年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法進(jìn)行微生物驗(yàn)證試驗(yàn)，建立了完善的冠心顆粒標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器）；島津紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1750）；AUW 120D型電子分析天平（島津公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ3200）。

1.2 試藥與試劑

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]和大腸埃希菌[CMCC（B）44102]均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

冠心顆粒（批號(hào)：20151101、20150809）及各陰性樣品均由我院自制；丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111562-201313），丹參對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120923-200610），三七皂苷R1對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110745-200312）；水為重蒸水（自制），甲醇和乙腈均為色譜純（購(gòu)自Fisher公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 丹參的薄層鑒別

取冠心顆粒1.3 g，研細(xì)，加10 mL水使其溶解，用稀鹽酸將pH值調(diào)至2，加20 mL乙酸乙酯，進(jìn)行萃取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇，作為供試品溶液。此外再取丹參對(duì)照藥材0.5 g，加水30 mL，煎煮30 min[1-3]，濾過(guò)，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方配比，取除丹參外的其他藥材，制成顆粒劑，再按上述方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取5 μL上述溶液，再各自點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮-甲酸（10∶4∶1.6）為展開劑[4-5]，展開，取出，晾干，置氨氣熏蒸后，放置10 min，最后置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照不干擾丹參的鑒別（圖1）。

2.1.2 三七的薄層鑒別

取冠心顆粒10 g，研細(xì)，加水50 mL使溶解，加入水飽和正丁醇30 mL，超聲提取10 min，離心，取上清液，加3倍量以正丁醇飽和的水，搖勻，靜置使其分層，分取正丁醇液[6-7]，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇，作為供試品溶液。再取三七皂苷R1對(duì)照品，加甲醇制成1.5 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方配比，取除三七外的其他藥材，制成顆粒劑，再按上述方法制得陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取10 μL上述溶液，各自點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22：10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑[8-9]，展開，取出，晾干，然后用10%硫酸乙醇溶液進(jìn)行顯色，最后在105℃情況下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照不干擾三七的鑒別（圖2）。

2.2 微生物限度檢查

2.2.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，制成需要濃度的菌懸液（用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行配置）；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，用3～5 mL含0.05%聚山梨酸酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫。吸出孢子混懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，制成需要濃度的黑曲霉孢子懸液（用含0.05%聚山梨酸酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行配置）[10-12]。

2.2.2 供試液制備

取冠心顆粒10 g，加入100 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，振搖使其充分溶散，混勻，制成1∶10的供試液。

2.2.3 微生物計(jì)數(shù)法

2批次冠心顆粒的5株驗(yàn)證菌中，樣品的回收率均在50%～200%的范圍內(nèi)，常規(guī)平皿傾注法適用于冠心顆粒的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

2.2.4 大腸埃希菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

取冠心顆粒10 g，加入100 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，振搖使其充分溶散，混勻，制成1∶10的供試液。

2.2.4.1 供試品組 取供試液10 mL，接種于100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

2.2.4.2 陰性對(duì)照組 取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL，接種于100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

2.2.4.3 陽(yáng)性驗(yàn)證組 取供試液10 mL，接種于100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入菌落數(shù)在10～100 cfu的大腸埃希菌菌懸液1 mL。

陰性對(duì)照組和供試品組均未見(jiàn)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性驗(yàn)證組麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，經(jīng)分離、純化和鑒定試驗(yàn)確證為大腸埃希菌。結(jié)果表明直接接種法可用于冠心顆粒大腸埃希菌檢查。

2.2.5 微生物限度檢查結(jié)果

2批冠心顆粒微生物限度檢驗(yàn)結(jié)果表明：2批冠心顆粒需氧菌總數(shù)均小于103 cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)均小于102 cfu/g；2批冠心顆粒均未檢出大腸埃希菌。符合2015版《中國(guó)藥典》微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-1%甲酸水溶液（29∶9∶62）[13-16]；以286 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定丹酚酸B對(duì)照品，用75%甲醇制成0.3 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取本品，研細(xì)，取約5.0 g，放在具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 75%甲醇，密塞，稱定其重量，超聲30 min后，放冷，再稱定其重量，用75%甲醇補(bǔ)足其減失的重量，搖勻，濾過(guò)，得供試品溶液[17-20]。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取按處方除去丹參的陰性樣品5.0 g，按上述方法制備陰性對(duì)照溶液，即可。

2.3.5 專屬性考察

分別精密吸取10 μL上述陰性對(duì)照溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明，丹酚酸B的保留時(shí)間約為13 min，陰性對(duì)照樣品不干擾丹酚酸B的測(cè)定，丹酚酸B與其他成分或雜質(zhì)的分離度大于1.5，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算均不低于4000。試驗(yàn)結(jié)果表明此法專屬性強(qiáng)。

2.3.6 線性范圍

精密吸取10 μL丹酚酸B對(duì)照品溶液，濃度分別為0.06、0.18、0.3、0.42、0.48、0.54 mg/mL，注入液相色譜儀，按“2.3.1”色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定各自丹酚酸B的峰面積，以丹酚酸B對(duì)照品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，丹酚酸B峰面積值為縱坐標(biāo)，求得線性回歸方程：y = 12299 x-49.236，r = 0.9998。結(jié)果表明丹酚酸B在0.06～0.54 mg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取10 μL對(duì)照品溶液，按“2.3.1”色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄丹酚酸B色譜峰的峰面積，測(cè)得其峰面積值的RSD為0.46%（n = 6），結(jié)果證明儀器精密度較好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取冠心顆粒約5.0 g，精密稱定，按照“2.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件分析，分別在0、2、4、6、8、10 h，測(cè)定樣品中丹酚酸B峰面積值，其RSD為1.73%（n = 6），結(jié)果表明冠心顆粒供試品溶液放置10 h穩(wěn)定。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取冠心顆粒6份，每份約5.0 g，精密稱定，按照“2.3.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件分析，測(cè)定每份樣品中丹酚酸B含量。結(jié)果6份樣品中丹酚酸B平均含量為2.2982 mg/g，RSD為2.52%（n = 6），結(jié)果證明本方法重復(fù)性較好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn)

取冠心顆粒6份，每份約2.5 g，精密稱定，分別加入6 mL丹酚酸B對(duì)照品溶液（濃度為1.0000 mg/mL），按照“2.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件分析，計(jì)算每份樣品中丹酚酸B含量，求得回收率，結(jié)果表明，冠心顆粒中丹酚酸B的平均回收率為98.61%，RSD為1.24%（n = 6），符合要求。

2.3.11 樣品含量測(cè)定

取2批冠心顆粒，按照上述方法制備供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定每份樣品中丹酚酸B的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 薄層鑒別

本實(shí)驗(yàn)對(duì)丹參薄層鑒別中提取溶劑乙酸乙酯、乙醚等溶劑進(jìn)行考察，并對(duì)二氯甲烷-丙酮-甲酸、環(huán)已烷-乙酸乙酯等不同展開系統(tǒng)及不同比例進(jìn)行比較，得到上述最佳薄層鑒別方法，使結(jié)果斑點(diǎn)清晰、陰性無(wú)干擾。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)三七薄層鑒別中提取溶劑正丁醇、甲醇等溶劑進(jìn)行考察，并對(duì)二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水等不同展開系統(tǒng)及不同比例進(jìn)行比較，得到上述最佳薄層鑒別方法，使結(jié)果斑點(diǎn)清晰、陰性無(wú)干擾。

3.2 微生物限度檢查

2015年版《中國(guó)藥典》由于培養(yǎng)體系的變化，微生物限度方法將需要重新驗(yàn)證。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2015年版《中國(guó)藥典微生物限度檢查》可以參照2010年版驗(yàn)證過(guò)的方法，采用類似的稀釋步驟，建立滿足2015年版《中國(guó)藥典》需求的微生物限度檢查方。2015年版《中國(guó)藥典》方法在需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)上，檢出率和檢出數(shù)量都明顯高于2010年版的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。

3.3 含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)考察了超聲和回流的提取方法，結(jié)果采用超聲提取方法與加熱回流提取方法的含量基本相同，但考慮到超聲提取方法較為簡(jiǎn)便，故將提取方法定為超聲提取?？疾?0%甲醇、75%甲醇、甲醇不同提取溶劑，結(jié)果表明：提取溶劑為75%甲醇時(shí)，測(cè)得的樣品含量稍高于其他兩種溶劑，故采用75%甲醇為提取溶劑?？疾?5%甲醇25、50、75 mL的溶劑用量，結(jié)果表明，溶劑用量為50 mL和70 mL時(shí)，測(cè)得的樣品含量明顯高于25 mL；溶劑用量為70 mL和50 mL時(shí)，測(cè)得的樣品含量差別不大，故將提取溶劑用量定為50 mL。分別考察超聲提取10、20、30 min，結(jié)果表明提取時(shí)間為30 min時(shí)測(cè)得的含量大于10 min和20 min，故將提取時(shí)間定為30 min。根據(jù)考察的結(jié)果確定下供試品溶液制備方法，此方法簡(jiǎn)便易行，且丹酚酸B含量較高，陰性無(wú)干擾，符合要求。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 林超，劉兆國(guó)，錢星，等.丹酚酸B在心血管疾病中藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（4）：449-452.

[2] 朱麗玲，許漢林，吳寧，等. 仙靈骨葆顆粒的薄層鑒別及含量測(cè)定[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（2）：43 -46.

[3] 喻明潔，陳青竹，戴青，等.滋陰生發(fā)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（17）：143 -145.

[4] 鄭永萍，江先合，施文平.丹參五味子片的薄層色譜鑒別[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8（5）：3-4.

[5] 樊暉，田原.益腎康顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30（12）：1001-1003.

[6] 仕海濤.扶正化積合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，12（6）：91-94.

[7] 張淑香，王萌影，王術(shù)平.舒樂(lè)沖劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥師，2014，17（10）：1765 -1767.

[8] 韓德強(qiáng)，付瑋辰，劉彥，等.參葛降脂濃縮丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27（3）：520-522.

[9] 郭強(qiáng).活血通脈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥事，2014，28（12）：1374-1379.

[10] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].四部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1105-1107.

[11] 李建志，王曉源，王亞賢.8種中草藥抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥信息，2015，32（1）：32-34.

[12] 陳志禹，夏佳，席時(shí)東.八珍顆?！吨袊?guó)藥典》2015年版微生物限度檢查法的建立及檢驗(yàn)結(jié)果分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，25（23）：4051-4055.

[13] 任萃文，楊晶.丹參舒心寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15 （6）：507 -509.

[14] 朱芹，黃湘杰.HPLC法測(cè)定生骨膠囊中丹酚酸B的含量[J].中國(guó)藥師，2013，16 （8）：1137-1138.

[15] 李小妹，康志英，梁詠，等.HPLC測(cè)定中風(fēng)回春膠囊中丹酚酸B的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（13）：122-124.

[16] 陶樹青，鄢必新.HPLC法測(cè)定丹參凍干粉針中丹酚酸B的含量[J].中醫(yī)藥信息，2009，26（3）：89-90.

[17] 黎春彤，何世榮，劉皈陽(yáng)，等.高效液相色譜法測(cè)定腎復(fù)康膠囊中丹酚酸B的含量[J].實(shí)用藥物與臨床，2016， 19（5）：617-619.

[18] 馬慧萍，李蘭茹，董志臣，等.HPLC法測(cè)定安神益智膠囊中丹酚酸B的含量[J].中國(guó)藥師，2014，17（2）：314-316.

[19] 劉茹麗.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方黨參片中丹酚酸B含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2016，25（8）：67-68.

[20] 陳英紅，周婷婷，王穎.反相高效液相色譜法測(cè)定婦炎舒膠囊中丹酚酸B的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（6）：150-152.

（收稿日期：2017-03-08 本文編輯：蘇 暢）