不同采收期葛根中總黃酮含量的動態(tài)變化研究

裴莉昕　紀寶玉　陳隨清

[摘要] 目的 研究同一產(chǎn)地、不同采收期葛根中總黃酮含量的動態(tài)變化情況，確定葛根的最佳采收期。方法 采用紫外-可見分光光度法，取供試品用95%乙醇回流提取20 min，于250 nm處測定其吸光度，計算總黃酮含量。 結(jié)果 不同月份采收的葛根中總黃酮的含量范圍為3.79%～11.86%，以9～10月最高，4～5月最低。 結(jié)論 以總黃酮為評價指標，葛根的最佳采收期應為9～10月，該結(jié)果可為葛根采收期的確定提供了可靠的科學依據(jù)。

[關鍵詞] 葛根；總黃酮；動態(tài)變化；采收期

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0028-03

[Abstract] Objective To study the dynamic change of total flavonoids content of Radix Puerariae in the same area and different harvest times， and determine the best harvest period of Radix Puerariae. Methods UV-Vis spectrophotometry was used， the test sample was extracted with 95% ethanol for 20 min， the absorbance was measured at 250 nm， and the total flavonoid content was calculated. Results The content of total flavonoids in Radix Puerariae harvested in different months was 3.79%-11.86%， the highest from September to October， the lowest from April to May. Conclusion As to the total flavonoids as the evaluation index， the best harvest period of Radix Puerariae should be September to October， the results can provide a reliable scientific basis for determining root harvest period.

[Key words] Radix Puerariae； Total flavonoids； Dynamic change； Harvest period

葛根為豆科（Leguminosae）植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根，明朝著名醫(yī)學家李時珍對野葛進行了系統(tǒng)的研究，認為野葛的莖、葉、花、果、根均可入藥?！侗静菥V目》中記載：“葛，性甘、辛、平、無毒，主治：消渴、身大熱、嘔吐、諸弊，起陰氣，解諸毒”[1]。葛根具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉之功效，主要活性成分是異黃酮類化合物，其總異黃酮類化合物含量是葛屬植物中最高者。包括大豆（黃豆）苷、大豆苷元、葛根素等10余種成分[1]；并含有胡蘿卜苷、氨基酸、香豆素類等[2-3]。野葛分布廣，資源豐富，主要分布在河南、云南、湖北、陜西、浙江、湖南、四川等省，除西藏、青海等少數(shù)幾個省份外，全國大部分省份都有分布，但是以長江流域和黃河流域各省自然分布較多。

葛根總黃酮在國內(nèi)外研究和應用也已有多年，具有明顯擴張冠狀動脈、預防心律失常等作用，臨床廣泛應用于預防和治療動脈粥樣硬化、偏癱、大腦萎縮、降血脂、降血壓、防治糖尿病、突發(fā)性耳聾乃至醒酒等，除了入藥之外，葛根還具有多方面的保健功能，例如調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，提高免疫力，抗衰延年、調(diào)經(jīng)養(yǎng)顏，對女性更年期癥狀，如便秘、面部色斑、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、乳腺疾病及骨質(zhì)疏松等癥均有較好的療效，因而越來越引起人們的關注[4-7]。但葛根藥材總黃酮成分的現(xiàn)代研究方向多為臨床藥效和藥理方面[8-11]，對其動態(tài)積累的研究較少[12-13]，因此本實驗系統(tǒng)研究了同一產(chǎn)地、不同采收期（12個月）的葛根總黃酮含量變化情況，為葛根的合理采收提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

AB135-S十萬分之一分析天平（梅特勒）恒溫干燥箱、UV-2201型紫外分光光度計（島津）、KQ-500DV數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）、葛根素對照品（11075200511，中國藥品生物制品檢定所，純度為99%）、蒸餾水、95%乙醇（分析純，天津市化學試劑三廠）、甲醇（分析純，天津市化學試劑三廠）。

1.2 材料

樣品采自河南省太行山區(qū)，采收時間分別為2013年1～12月的12批三年生葛根樣品。經(jīng)河南中醫(yī)藥大學生藥學科陳隨清教授鑒定為豆科（Leguminosae）植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑濃度的選擇 取藥材粉末約0.1 g（過3號篩），精密稱定，置50 mL具塞平底燒瓶中，分別精密加甲醇、65%乙醇、95%乙醇各10 mL，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用提取溶劑補足重量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量。結(jié)果分別為9.06%、5.44%、9.58%，95%乙醇提取總黃酮效果明顯好于65%乙醇提取，而甲醇與95%乙醇的提取效果差不多，考慮到甲醇毒性較大，故本實驗采用95%乙醇作為提取葛根總黃酮的溶劑。

2.1.2 提取時間的選擇 取藥材粉末約0.1 g（過3號篩），精密稱定，置50 mL具塞平底燒瓶中，精密加95%乙醇10 mL，稱定重量，分別加熱回流提取10、20、30 min，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足重量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量，結(jié)果分別為4.27%、8.99%、9.02%，回流提取20、30 min時兩種成分的含量基本沒有變化，表明回流提取20 min基本達到充分提取，因此本實驗選用回流提取20 min。

2.1.3 提取方法的選擇 取藥材粉末約0.1 g（過3號篩），精密稱定，置50 mL具塞平底燒瓶中，精密加95%乙醇10 mL，稱定重量，分別加熱回流提取與超聲提取各20 min，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足重量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量，結(jié)果分別為9.62%、7.78%，表明加熱回流提取比超聲提取效率更高，因此本實驗選用加熱回流提取。

2.2 對照品溶液的制備

取葛根素對照品適量，精密稱定，加95%乙醇制成每毫升含20 μg的溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取葛根粉末約0.1 g，精密稱定，置于50 mL三角瓶中，加95%乙醇30 mL，加熱回流20 min，并時時振搖，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減失的重量，搖勻，吸取上清液1 mL于10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。

2.4 最大吸收峰的確定

精密吸取對照品溶液和供試品溶液各適量，以1 mL 95%乙醇加水至10 mL量瓶中，作為空白對照，于200～500 nm波長掃描，結(jié)果均在250 nm處有最大吸收。精密吸取供試品溶液，以1 mL 95%乙醇加水至10 mL量瓶中，作為空白對照，于200～500 nm波長掃描，結(jié)果均在250 nm處有最大吸收。見圖1。

2.5 測定方法

取供試品于250 nm處測定其吸光度，并按外標法計算供試品溶液中總黃酮的含量。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察 精密稱取葛根素對照品適量，置量瓶中，用95%乙醇溶解至刻度，搖勻，分別制成0.004、 0.008、0.012、0.016、0.02 mg/mL的對照品儲備溶液，在250 nm測定吸收值，以葛根素濃度（mg/mL）為橫坐標（X），吸收度為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得線性回歸方程為：Y=77.15X+0.0923，r = 0.9997，表明總黃酮在0.004～0.02 mg/mL的范圍內(nèi)，濃度與吸收度呈良好的線性關系。

2.6.2 精密度試驗 精確稱取總黃酮對照品溶液，在250 nm測定吸光度，重復測定6次，結(jié)果吸光度的RSD值為2.44%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在制備后0、2、4、6、8、10、12 h時分別測定吸光度，結(jié)果吸光度的RSD值為2.36%，表明供試液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.4 加樣回收率試驗 取已知含量的同一樣品粉末6份，各約0.05 g，每份樣品中加入適量葛根素對照品，按“2.3”項下方法制備供試液，在250 nm下測定吸光度，計算回收率，結(jié)果回收率平均值為98.1%，RSD為1.28%，表明該實驗方法的回收率良好。見表1。

2.6.5 重復性試驗 精密稱取同一樣品粉末6份，各0.1 g，按“2.3”項下制備供試液，在250 nm下測定吸光度，計算總黃酮含量，結(jié)果RSD值為2.09%，表明該實驗方法重復性良好。

2.7 不同采收期葛根藥材中總黃酮的含量測定結(jié)果

取不同月份采收的葛根藥材按“2.3”項下制備供試品溶液并測定其吸光度，計算葛根總黃酮含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 為了避免產(chǎn)地帶來的影響，我們選擇同一產(chǎn)地的葛根進行研究，結(jié)果表明，一年中不同月份采收的葛根總黃酮含量存在差異。4～6月總黃酮含量最低，可能由于此時溫度適宜、雨量充沛，植物地上部分處于快速生長階段，營養(yǎng)主要供于地上植物生長，因此導致根部總黃酮含量較少；9～10月總黃酮含量最高，可能由于此時進入冬季，地上植物枯萎，所有營養(yǎng)集中供給地下部分，此時根部總黃酮含量較高。從結(jié)果可知，9～10月的秋季采收葛根藥材最佳，與傳統(tǒng)葛根藥材采收期一致。

3.2 對于葛根中總黃酮的提取方法，研究表明，醇提法效果比較好，優(yōu)于水提法和其他方法，這主要是由于葛根總黃酮類化合物更易溶于醇溶媒中的緣故。通過優(yōu)化，得總黃酮最佳提取條件為95%乙醇回流提取20 min。

3.3 中藥質(zhì)量的好壞，取決于有效物質(zhì)含量的多少，有效物質(zhì)含量的多少與采收期密切相關，因此藥材采收期是中藥材生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)，直接影響藥材的質(zhì)量與產(chǎn)量。藥材適宜采收期確立以質(zhì)量最優(yōu)和產(chǎn)量最大化為基本原則。藥材品質(zhì)優(yōu)良的主要評價指標是藥物的活性成分的組成和量。葛根主要活性成分是葛根素、大豆苷、大豆苷元等黃酮類物質(zhì)。本實驗對不同采收期葛根總黃酮含量進行了研究，所得結(jié)果為確定葛根采收期提供科學依據(jù)。同時也避免了不適時宜的亂采亂挖葛根藥材，造成葛根資源的浪費，為葛根資源的有效利用提供有效的、科學的保障。

總之，本實驗建立的葛根中總黃酮含量的紫外分光光度測定法簡便、準確、可靠，重復性良好，可用于葛根的質(zhì)量評價。

[參考文獻]

[1] 羅瓊，郝近大，楊華，等.葛根的本草考證[J].中國中醫(yī)藥志，2007，32（12）：1141.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：北京化學工業(yè)出版社，2015：233.

[3] 董英，徐斌，林琳，等.葛根的化學成分研究[J].食品與機械，2005，21（6）：85-100.

[4] 狄靈，于燕，楊海俠，等.葛根素對心血管病作用機制的研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009，7（3）：328-329.

[5] 楊艷.葛根素治療冠心病心絞痛60例臨床觀察[J].臨床合理用藥，2009，2（8）：61.

[6] 吳慧軒.葛根素注射液治療高脂血癥療效觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2003，10（7）：49-50.

[7] 程麗彩.葛根素對機體免疫系統(tǒng)影響研究進展[J].實用中醫(yī)藥雜志，2010，26（6）：440-442.

[8] 張艷梅，王越，董大偉，等.葛根的解肌作用及藥理學研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2010，23（3）：416-417.

[9] 白東義，佟春玲，韓慧，等.葛根素的藥理作用及其臨床應用研究進展[J].江蘇中醫(yī)藥，2009，41（3）：76-78.

[10] 張東華，董強波，彭曙光.葛根的化學成分、藥理作用和臨床應用研究[J].首都醫(yī)藥，2007（12）：44-45.

[11] 郭建平，周全，孫其榮.葛根藥理作用研究進展[J].中草藥，1995，26（3）：163-165.

[12] 曾明，張漢明，鄭水慶，等.葛屬植物藤莖的化學成分分析[J].中國中藥雜志，1999，24（3）：59-61.

[13] 劉建林，羅強.攀西野生葛資源的開發(fā)利用與可持續(xù)發(fā)展研究[J].中國林副特產(chǎn)，2004（6）：52-54.

（收稿日期：2017-03-02 本文編輯：李亞聰）