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    青蒿素抑制胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

    2017-08-26 02:14錢(qián)斌李小軍陳蔚
    關(guān)鍵詞:侵襲增殖青蒿素

    錢(qián)斌 李小軍 陳蔚

    [摘要] 目的 研究青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響。 方法 培養(yǎng)胃癌SGC-7901細(xì)胞株并用含有不同劑量青蒿素的無(wú)血清DMEM進(jìn)行干預(yù),分別作為75、150、300 μmol/L青蒿素組,以不含青蒿素的無(wú)血清DMEM作為對(duì)照組。干預(yù)后48 h時(shí),測(cè)定細(xì)胞的增殖活力、侵襲數(shù)目及增殖基因、侵襲基因的mRNA表達(dá)量。 結(jié)果 處理后48 h時(shí),75、150、300 μmol/L青蒿素組的細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目以及細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組,TIMP1、TIMP2的mRNA表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P < 0.05),且青蒿素劑量越大,細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目以及細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量越低,TIMP1、TIMP2的mRNA表達(dá)量越高(P < 0.05)。 結(jié)論 青蒿素能夠通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

    [關(guān)鍵詞] 青蒿素;胃癌;增殖;細(xì)胞周期;侵襲

    [中圖分類(lèi)號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2017)07(a)-0039-04

    [Abstract] Objective To study the effect of artemisinin on the proliferation and invasion of gastric cancer cells. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured and dealt with different doses of artemisinin in serum-free DMEM, respectively as 75, 150, 300 μmol/L artemisinin group, serum-free DMEM without artemisinin as control group. After 48 h of intervention, cell proliferation activity, invasion numbers and mRNA expression of proliferation gene, invasion gene were determined. Results After 48 h of intervention, cell proliferation activity, invasion numbers and Ki-67, CyclinD1, CDK4, CDK6, MMP2, MMP9 mRNA expression of 75, 150, 300 μmol/L artemisinin group were significantly lower than those of control group, TIMP1 and TIMP2 mRNA expression were significantly higher than those of control group (P < 0.05), and the higher the dose of artemisinin, the lower the cell proliferation activity, invasion numbers and Ki-67, CyclinD1, CDK4, CDK6, MMP2, MMP9 mRNA expression, the higher the TIMP1 and TIMP2 mRNA expression (P < 0.05). Conclusion Artemisinin can inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cells by inhibiting the expression of cell cycle proteins and matrix metalloproteinases.

    [Key words] Artemisinin; Gastric cancer; Proliferation; Cell cycle; Invasion

    胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來(lái)的發(fā)病率呈逐步升高趨勢(shì)。目前,胃癌的早期診斷率較低,多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展至中晚期且錯(cuò)過(guò)了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)?;熓侵型砥谖赴┑闹饕委熓侄?,但在化療過(guò)程中胃癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性并影響化療效果、造成化療失敗[1-2]。因此,尋找治療中晚期胃癌的有效輔助藥物是臨床研究和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。青蒿素是從中藥材青蒿中分離得到的有效成分,臨床上主要用于瘧疾的治療。近年來(lái)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),青蒿素具有廣泛的抗癌活性,對(duì)膀胱癌[3]、宮頸癌[4]、乳腺癌[5]等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用。但是,青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)的影響尚不明確。本研究分析了青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的抑制作用,現(xiàn)報(bào)道如下:

    1 材料與方法

    1.1 材料

    胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所,DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶均購(gòu)買(mǎi)于Hyclone公司(批號(hào)2016C0482),青蒿素購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司(批號(hào)2016C215),MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Promega公司(批號(hào)2016-394),RNA抽提試劑盒(批號(hào)E2016-24)、cDNA第一鏈合成試劑盒(批號(hào)F2016-039)、熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)A2016-77)購(gòu)買(mǎi)于上??禐槭兰o(jì)公司,PCR引物由上海生工公司合成。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 SGC-7901細(xì)胞株復(fù)蘇后用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度,每2天更換1次培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%~90%后用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代,消化后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中并用于后續(xù)處理。

    1.2.2 細(xì)胞處理方法 培養(yǎng)板中的細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%~90%后,棄去培養(yǎng)基并用不含血清的DMEM清洗2遍,而后加入含有不同劑量青蒿素的無(wú)血清DMEM進(jìn)行干預(yù),分別作為75、150、300 μmol/L青蒿素組,以不含青蒿素的無(wú)血清DMEM作為對(duì)照組。處理后48 h進(jìn)行細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目及基因表達(dá)的檢測(cè)。

    1.2.3 細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)方法 用于細(xì)胞增殖活力檢測(cè)的細(xì)胞消化后接種在96孔細(xì)胞板中,不同條件處理48 h后,向培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μL MTS試劑盒的檢測(cè)液,而后將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱、繼續(xù)孵育3~4 h;待培養(yǎng)基變色后,將培養(yǎng)板放置在多功能酶標(biāo)儀上,測(cè)定450 nm處的吸光度值并以該吸光度值作為細(xì)胞的增殖活力值。

    1.2.4 細(xì)胞侵襲數(shù)目的檢測(cè)方法 用于細(xì)胞侵襲數(shù)目檢測(cè)的細(xì)胞消化后接種在Transwell小室內(nèi),不同條件處理48 h后取出小室,PBS洗2遍后去下小室底部的濾膜,結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察濾膜,隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野并對(duì)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù),而后計(jì)算平均值,并以該平均值作為細(xì)胞侵襲數(shù)目。

    1.2.5 細(xì)胞中基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)方法 用于基因mRNA表達(dá)量檢測(cè)的細(xì)胞消化后接種在12孔細(xì)胞板中,不同條件處理48 h后,棄去培養(yǎng)基并用PBS洗2遍,而后使用RNA抽提試劑盒分離細(xì)胞中的總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,所擴(kuò)增的基因包括Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、β-actin,擴(kuò)增條件如下:95℃預(yù)變性3 min后95℃ 20 s、特異性退火溫度15 s、72℃ 20 s重復(fù)45個(gè)循環(huán),根據(jù)擴(kuò)增曲線、以β-actin為內(nèi)參計(jì)算上述基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 20.0軟件錄入并分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間計(jì)量資料比較采用方差分析,對(duì)方差分析有差異的數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD-t兩兩比較,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 青蒿素處理后的細(xì)胞增殖活力和侵襲數(shù)目

    處理后48 h時(shí),75、150、300 μmol/L青蒿素組的細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目均顯著低于對(duì)照組(P < 0.05),150、300 μmol/L青蒿素組的細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目均顯著低于75 μmol/L青蒿素組(P < 0.05),300 μmol/L青蒿素組的細(xì)胞增殖活力、侵襲數(shù)目均顯著低于150 μmol/L青蒿素組(P < 0.05)。見(jiàn)表1。

    2.2 青蒿素處理后細(xì)胞中增殖基因的表達(dá)量

    處理后48 h時(shí),75、150、300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P < 0.05),150、300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量均顯著低于75 μmol/L青蒿素組(P < 0.05),300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量顯著低于150 μmol/L青蒿素組(P < 0.05)。見(jiàn)表2。

    2.3 青蒿素處理后細(xì)胞中侵襲基因的表達(dá)量

    處理后48 h時(shí),75、150、300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組,TIPM1、TIMP2的mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P < 0.05);150、300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量均顯著低于75 μmol/L青蒿素組,TIPM1、TIMP2的mRNA表達(dá)量顯著高于75 μmol/L青蒿素組(P < 0.05),300 μmol/L青蒿素組細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量顯著低于150 μmol/L青蒿素組,TIPM1、TIMP2的mRNA表達(dá)量顯著高于150 μmol/L青蒿素組(P < 0.05)。見(jiàn)表3。

    3 討論

    中晚期胃癌目前尚缺乏有效的靶向治療藥物,常規(guī)化療容易產(chǎn)生耐藥性并影響化療效果[6-7]。因此,尋找治療中晚期胃癌的有效輔助藥物是臨床研究和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。青蒿素是從中藥材青蒿中提取得到的具有抗瘧疾作用的活性成分。近年來(lái)關(guān)于青蒿素的藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),青蒿素包括雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等衍生物,其中以雙氫青蒿素的作用最為廣泛,具有廣泛的抗癌特性,能夠殺傷癌細(xì)胞,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,抑制癌細(xì)胞增殖[8-10]。相關(guān)基礎(chǔ)研究證實(shí),青蒿素對(duì)膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有抑制作用。目前,關(guān)于青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響尚不明確。在本研究中,為了明確青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,首先對(duì)不同劑量青蒿素處理后胃癌細(xì)胞的增殖活力和侵襲數(shù)目進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示:不同劑量青蒿素組的細(xì)胞增殖活力和侵襲數(shù)目均顯著低于對(duì)照組,且青蒿素劑量越大,細(xì)胞增殖活力和侵襲數(shù)目越低。這就說(shuō)明青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲具有抑制作用且該抑制作用呈劑量依賴(lài)性的趨勢(shì)。

    胃癌細(xì)胞的增殖是造成胃癌病灶生長(zhǎng)、體積增大的重要病理環(huán)節(jié),細(xì)胞周期進(jìn)程的加速與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。CyclinD1是目前研究較為廣泛的細(xì)胞周期蛋白,主要作用于細(xì)胞周期G/S期的轉(zhuǎn)換并發(fā)揮正性調(diào)控作用[11-12]。CyclinD1與CDK4、CDK6形成復(fù)合體后能夠引起pRb發(fā)生磷酸化并釋放E2F,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周G1期進(jìn)入S期。細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期的加速能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。Ki-67是在細(xì)胞增殖細(xì)胞核中特異性表達(dá)的分子,能夠識(shí)別細(xì)胞周期中核抗原上的決定簇,Ki-67的表達(dá)量能夠反映細(xì)胞周期進(jìn)展的速度以及細(xì)胞增殖的活力[14-15]。本研究通過(guò)分析不同劑量青蒿素處理對(duì)胃癌細(xì)胞中上述增殖基因表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)不同劑量青蒿素組細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組,且青蒿素劑量越大,細(xì)胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表達(dá)量越低。這就說(shuō)明青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞中增殖基因的表達(dá)具有抑制作用且該抑制作用呈劑量依賴(lài)性的趨勢(shì)。

    胃癌細(xì)胞的侵襲是造成胃癌病灶向臨近組織浸潤(rùn)、向遠(yuǎn)處組織浸潤(rùn)的重要病理環(huán)節(jié),細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞基底膜的降解與細(xì)胞的侵襲密切相關(guān)。MMPs是目前已知對(duì)多種蛋白質(zhì)具有降解作用的一族鋅離子依賴(lài)性蛋白水解酶。MMPs家族中的MMP2和MMP9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞基底膜中的膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等多種成分具有降解作用,是細(xì)胞中重要的促侵襲基因[16-17]。胃癌病灶中高表達(dá)的MMP2和MMP9能夠通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞基底膜中的多種成分來(lái)促進(jìn)細(xì)胞侵襲[18-19]。在局部組織中,MMP2和MMP9的活性受到TIMP1和TIMP2的抑制,TIMP1和TIMP2也是細(xì)胞中重要的侵襲抑制基因[20]。本研究通過(guò)分析不同劑量青蒿素處理對(duì)胃癌細(xì)胞中上述增殖基因表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)不同劑量青蒿素組細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組,TIMP1、TIMP2的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組,且青蒿素劑量越大,細(xì)胞中MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)量越低,TIMP1、TIMP2的mRNA表達(dá)量越高。這就說(shuō)明青蒿素對(duì)胃癌細(xì)胞中促侵襲基因的表達(dá)具有抑制作用,對(duì)侵襲抑制基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用,且該調(diào)節(jié)作用呈劑量依賴(lài)性。

    綜上所述,青蒿素能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲,抑制細(xì)胞周期蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),是青蒿素發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Jomrich G,Schoppmann SF. Targeted therapy in gastric cancer [J]. Eur Surg,2016,48(5):278-284.

    [2] Shi WJ,Gao JB. Molecular mechanisms of chemoresistance in gastric cancer [J]. World J Gastrointest Oncol,2016,8(9):673-681.

    [3] Jia J,Qin Y,Zhang L,et al. Artemisinin inhibits gallbladder cancer cell lines through triggering cell cycle arrest and apoptosis [J]. Mol Med Rep,2016,13(5):4461-4468.

    [4] Mondal A,Chatterji U. Artemisinin represses telomerase subunits and induces apoptosis in HPV-39 infected human cervical cancer cells [J]. J Cell Biochem,2015,116(9):1968-1981.

    [5] Zhang YJ,Zhan X,Wang L,et al. pH-responsive artemisinin dimer in lipid nanoparticles are effective against human breast cancer in a xenograft model [J]. J Pharm Sci,2015, 104(5):1815-1824.

    [6] Abdelfatah E,Kerner Z,Nanda N,et al. Epigenetic therapy in gastrointestinal cancer:the right combination [J]. Therap Adv Gastroenterol,2016,9(4):560-579.

    [7] Chang HR,Park HS,Ahn YZ,et al. Improving gastric cancer preclinical studies using diverse in vitro and in vivo model systems [J]. BMC Cancer,2016,9(16):200.

    [8] Zhou Y,Li W,Xiao Y. Profiling of multiple targets of artemisinin activated by hemin in cancer cell proteome [J]. ACS Chem Biol,2016,11(4):882-888.

    [9] Ooko E,Saeed ME,Kadioglu O,et al. Artemisinin derivatives induce iron-dependent cell death(ferroptosis)in tumor cells [J]. Phytomedicine,2015,22(11):1045-1054.

    [10] 吳孟軒.青蒿素和順鉑聯(lián)合干預(yù)對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞株上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管新生及ATP生成的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016,22(18):2073-2076.

    [11] 王軍,趙醒,趙宇陽(yáng),等.CyclinD1、CDC25B和p27在胃癌組織中的表達(dá)[J].廣東醫(yī)學(xué),2016,37(10):1495-1498.

    [12] Matsuhashi N,Takahashi T,Yamaguchi K,et al. The significant role of Cyclin D1 in the synergistic growth-inhibitory effect of combined therapy of Vandetanib with 5-Fluorouracil for gastric cancer [J]. Anticancer Res,2016,36(10):5215-5226.

    [13] Kumari S,Puneet,Prasad SB,et al. Cyclin D1 and Cyclin E2 are differentially expressed in gastric cancer [J]. Med Oncol,2016,33(5):40.

    [14] 陳超,姚莉敏.胃癌中β-catenin、ki-67和Her-2/Neu表達(dá)及對(duì)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(18):2504-2507.

    [15] Bger C,Behrens HM,Rcken C. Ki67——An unsuitable marker of gastric cancer prognosis unmasks intratumoral heterogeneity [J]. J Surg Oncol,2016,113(1):46-54.

    [16] 李波,周爛.血清VEGF、MMP及MK與胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016,22(9):928-930.

    [17] Bornschein J,Seidel T,Langner C,et al. MMP2 and MMP7 at the invasive front of gastric cancer are not associated with mTOR expression [J]. Diagn Pathol,2015,12(10):212.

    [18] Kim TH,Jung JY,Roh HJ,et al. Comparative expression of matrix metalloproteinases in internal malignancies and paired cutaneous metastatic lesions [J]. Am J Dermato-pathol,2015,37(5):381-388.

    [19] Verma S,Kesh K,Gupta A,et al. An overview of matrix metalloproteinase 9 polymorphism and gastric cancer risk [J]. Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(17):7393-7400.

    [20] Gurgel DC,Valenca-Junior JT,Dornelas CA,et al. Immunoexpression of metalloproteinases 2 and 14 and TIMP-2 inhibitor in main types of primary gastric carcinomas and lymph node metastasis [J]. Pathol Oncol Res,2015,21(1):73-81.

    (收稿日期:2017-02-27 本文編輯:張瑜杰)

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