響應(yīng)面法優(yōu)化嶺南炮天雄生物堿提取工藝

覃軍　鄧廣?！￡惼G紅

[摘要] 目的 優(yōu)化嶺南特色飲片炮天雄總生物堿的提取工藝。 方法 采用響應(yīng)面分析法，依據(jù)Box-Behnken原理優(yōu)化炮天雄乙醇超聲提取工藝，實驗以總生物堿提取率為評價指標(biāo)，考察提取時間、乙醇濃度、液料比等主要影響因素，最終得出炮天雄最佳提取工藝。 結(jié)果 炮天雄總生物堿最佳提取工藝為乙醇比例75%，液料比8.0，提取時間30 min，在此條件下，總生物堿提取率理論值為31.1%，實際值為32.5%。 結(jié)論 基于響應(yīng)面法優(yōu)化的參數(shù)條件具有較高的實用價值，可為嶺南特色炮天雄的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 炮天雄；響應(yīng)面法；總生物堿；工藝優(yōu)化

[中圖分類號] R961 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0031-04

[Abstract] Objective To optimize extraction process of total alkaloids from Lingnan featured pieces Paotianxiong by response surface method. Methods Three-variables as extraction time， ratio of material to solution and ethanol concentration， and three-levels Box-Benhnken experimental design was used to optimize the effects of independent variables on the total alkaloid extraction efficiency. Results The optimum conditions were extraction time 30 min， ratio of material to solution 8.0， and 75% ethanol concentration. Under the optimum conditions， the theoretical total alkaloid extraction rate was 31.1%， and the actual rate was 32.5%. Conclusion Response surface method is an effective methodology to optimize the total alkaloid extraction process of Lingnan featured pieces Paotianxiong.

[Key words] Paotianxiong； Response surface method； Total alkaloid； Process optimization

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli debx.）的子根，傳統(tǒng)中醫(yī)認為子根中獨生個大者稱之為天雄[1]，嶺南地區(qū)根據(jù)傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，采用傳統(tǒng)炮制技術(shù)將其加工成獨具嶺南特色炮制品，習(xí)稱炮天雄[2]。炮天雄在嶺南地區(qū)具有廣泛臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，在港澳、東南亞地區(qū)，炮天雄常作為滋補食療上品，用于治療元陽素虛、腎虧陽虛證患者[3-5]?，F(xiàn)代研究表明，炮天雄富含生物堿類成分[6-8]，這類成分為炮天雄的主要藥效成分，因此從炮天雄分離提取生物堿類成分具有較高的現(xiàn)實意義。目前，嶺南特色炮天雄生物堿成分提取工藝的研究未見報道。響應(yīng)面法（RSM）是一種優(yōu)化多變量體系的有效實驗工具，采用多元二次回歸方程來擬合多個因素與響應(yīng)值之間、因素與因素之間的函數(shù)關(guān)系，找出各因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，有效地解決多變量問題[9-12]。由于響應(yīng)面分析法在優(yōu)化研究中具有實驗次數(shù)少、精確度高、成本低、產(chǎn)出高等優(yōu)點，已被廣泛用于生物、化學(xué)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[13-16]。本實驗采用響應(yīng)面方法，以總生物堿提取率為響應(yīng)值，考察不同提取時間、乙醇分數(shù)、液料比等主要提取因素及它們的相互作用對總生物堿提取率的影響，優(yōu)化炮天雄提取工藝。

1 材料

KQ-2200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS110S型電子天平（賽多利斯有限公司）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；炮天雄飲片（批號：YPA00001）購于廣州市藥材公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)院林華主任中藥師鑒定為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli debx.）的干燥根的炮制品。乙醇、氯仿等試劑均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠），水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

取樣品粉末（過三號篩）100 g，精密稱定，按照響應(yīng)面設(shè)計方案進行提取，回收提取液，濃縮，用1%鹽酸水溶劑定容至含藥材0.5 g/mL供試品液，2℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總生物堿測定

參照2010版《中國藥典》[17]一部附子項下總生物堿含量測定及相關(guān)文獻，采用滴定法測定炮天雄總生物堿含量。

2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計

實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對炮天雄乙醇超聲提取工藝中乙醇體積、固液比、提取時間等主要影響因素進行考察，每個因素設(shè)定3個水平，以總生物堿提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析實驗[18-19]。實驗因素及水平見表1。

實驗采用Box-Behnken設(shè)計，選取提取乙醇體積分數(shù)（A）、提取液料比（B）、提取時間（C）三因素三水平對總生物堿提取率的影響。實驗按照Design-Expert設(shè)計方案設(shè)計了15個實驗點，每個實驗點平行分析3次，結(jié)果見表2。15個實驗點可分為2類，包括12個析因點和3個零點重復(fù)實驗。

通過對響應(yīng)面實驗結(jié)果進行分析，利用Design-Expert軟件對上述實驗結(jié)果進行二次回歸擬合后，得到3個因素與炮天雄生物堿含量之間的模擬方程為：Y = 29.03+4.15A+0.62B+2.98C-0.35AB-0.95AC-1.20BC-2.17A2-3.32B2-2.62C2。

為考察回歸方程的有效性及各因素對總生物堿提取率的影響程度，對上述回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。由此可看出，該回歸模型的F檢驗為極顯著（P < 0.01），其失擬項為不顯著（P > 0.05），表明該二次多項模型可以較好地描述各因素與響應(yīng)值的真實關(guān)系，可用于總生物堿最佳提取工藝的篩選。該回歸方程的相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9657，即96.57%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋，方程擬合度良好。單因素A、C及二次項A2、B2、C2對響應(yīng)值有顯著影響（P < 0.05），其中單因素A、C和二次項A2、C2對響應(yīng)值有極其顯著影響（P < 0.01）。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化工藝分析

為了進一步研究各因素之間的交互關(guān)系，采用Design-Expert軟件模擬了3種影響因素對總響應(yīng)因子交互影響的3D響應(yīng)曲面圖和等高線圖（圖1～3），分別將其中1個因素固定在零水平，考察另外兩個因素之間的交互影響。在等高線圖中，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，在響應(yīng)曲線圖中，曲線走勢越陡，其影響越顯著，曲線走勢越平滑，其影響越小。

乙醇體積分數(shù)比和液料比對炮天雄總生物堿提取率的影響見圖1，在提取時間固定為零水平（30 min）時，乙醇體積分數(shù)對炮天雄生物堿提取率影響顯著，隨著乙醇濃度增加而逐步增加，在乙醇濃度40%～70%時增加尤為明顯，液料比的曲線較為平緩，在1∶9附近達到最高點，表明其對提取率影響相對較小。等高線圖表明兩者交互對提取率影響不顯著。

固定液料比為1∶8時，乙醇體積分數(shù)和提取時間對生物堿提取率的影響見圖2。從圖2A可知，乙醇體積分數(shù)、提取時間對提取率影響較為顯著，生物堿提取率隨著乙醇濃度和提取時間的增加而增加，其增幅逐步收窄。從3D曲線圖的曲面分析和高線圖直觀分析，可見兩者交互影響比較明顯。

固定乙醇體積分數(shù)為60%時，液料比與提取時間對生物堿提取率的影響見圖3。從3D曲面圖直觀分析可知，提取時間對生物堿提取率影響較大，而液料比影響因素相應(yīng)的曲線較為平緩。兩者的交互作用也不明顯。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行最優(yōu)化分析，確定最佳提取的生物堿提取條件為乙醇比例76.6%，液料比8.0，提取時間30.7 min，在此條件下生物堿的理論提取率為31.1%。

2.5 工藝驗證

采用模型預(yù)測的結(jié)果進行驗證實驗，考慮到實際應(yīng)用情況，定義修正后的最優(yōu)提取條件為乙醇比例75%，液料比8.0，提取時間30 min，按此工藝提取3次，得到生物堿平均提取率為32.5%，略高于理論值31.1%。

3 討論

本研究在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化嶺南特色藥材品種炮天雄的總生物堿提取工藝最佳條件為乙醇比例76.6%，液料比8.0，提取時間30.7 min。根據(jù)實際情況修訂提取參數(shù)為乙醇比例75%，液料比8.0，提取時間30 min。在此條件下得到生物堿最佳提取率為32.5%，與理論值31.1%相近，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的生物堿提取參數(shù)條件可靠，可為炮天雄生物堿提取擴大化生產(chǎn)和綜合利用提供了實驗參考和依據(jù)。

過往的研究較多采用單因素考察法和正交實驗方法優(yōu)選總生物堿提取效率[20]。與正交實驗方法相比，響應(yīng)面法通過構(gòu)建二次回歸數(shù)學(xué)模型，能分析多因素干擾下實驗設(shè)置水平之外的最佳水平組合。但響應(yīng)面法優(yōu)化的前提是，對設(shè)計實驗點應(yīng)包括最佳實驗條件在內(nèi)，如實驗設(shè)計點選取不當(dāng)，很難得到最優(yōu)化的結(jié)果?？v然如此，響應(yīng)面法不失為研究多因素問題的有效工具。本文通過響應(yīng)面方法技術(shù)應(yīng)用，為更多中藥及相關(guān)研究工作者利用該技術(shù)方法，有效解決工作中的方法設(shè)計等問題提供研究思路和應(yīng)用案例。

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（收稿日期：2017-03-14 本文編輯：李亞聰）