不同丙泊酚劑量對大鼠下丘腦垂體、海馬Akt及淀粉樣β蛋白的影響

謝恒韜　潘俠　何旋

[摘要] 目的 觀察不同劑量的丙泊酚對大鼠下丘腦垂體、海馬Akt以及海馬淀粉樣β蛋白的影響。 方法 雄性SPF級SD大鼠24只，采用大鼠尾部靜脈注射的方式，較小劑量分次尾部靜脈注射的方法，注射共3次。每次劑量為10 mg/mL，根據(jù)累積劑量分為丙泊酚Ⅰ組（10 mg/mL），丙泊酚Ⅱ組（20 mg/mL）和丙泊酚Ⅲ組（30 mg/mL），對照組不進行麻醉處理，每組各6只。腦電圖儀檢測大鼠的腦電信號，HE染色觀察大鼠下丘腦弓狀核神經(jīng)元和垂體促性腺細(xì)胞病理學(xué)變化，Western blot檢測各組大鼠海馬Akt及淀粉樣β蛋白（Aβ）表達水平。結(jié)果 與對照組比較，棘波、α波和β波隨著丙泊酚劑量的增加而顯著增加（P < 0.05），δ波隨著丙泊酚劑量的的增加而顯著降低（P < 0.05）；對照組的下丘腦弓狀核神經(jīng)元密度和分布正常，腺垂體細(xì)胞整體數(shù)目多，細(xì)胞間有豐富的竇狀毛細(xì)血管，細(xì)胞排列規(guī)則；丙泊酚Ⅰ組的大鼠弓狀核神經(jīng)元無明顯病變，腺垂體細(xì)胞也并無出現(xiàn)明顯的降低；隨著劑量的增加，丙泊酚Ⅱ組和丙泊酚Ⅲ組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞和垂體細(xì)胞數(shù)量明顯減少，核膜界限不清，細(xì)胞排列不規(guī)則增加；Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著丙泊酚劑量的增加，海馬內(nèi)的Akt蛋白表達呈降低趨勢（P < 0.01），Aβ表達明顯增加（P < 0.01）。 結(jié)論 低劑量丙泊酚不足以促使下丘腦和垂體發(fā)生病變，當(dāng)丙泊酚劑量增大時，下丘腦和腺垂體反饋作用增強，導(dǎo)致病理變化的發(fā)生，丙泊酚麻醉對β淀粉樣蛋白沉積作用可能是通過抑制Akt途徑實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 丙泊酚；下丘腦；垂體；淀粉樣β蛋白

[中圖分類號] R614 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0024-04

[Abstract] Objective To observe the effects of different Propofol anesthesia doses on rat hypothalamus， pituitary， hippocampus Akt and amyloid beta protein （Aβ）. Methods 24 SPF grade male rats were used by method of low-dose tail intravenous injection （10 mg/mL） for 3 times. The rats were divided into 4 groups by methods of cumulative dose， control， Propofol group Ⅰ （10 mg/mL）， Propofol group Ⅱ （20 mg/mL） and Propofol group Ⅲ （30 mg/mL）， respectively. No anaesthetic management was given in control group， with 6 rates in each group. Electroencephalogram was detected by electroencephalograph； the pathology of rat hypothalamic arcuate nucleus neurons and pituitary gonadotropin cell was observed by HE staining. Western blot detection was used to detect the expression of the Akt and Aβ. Results Compared with the control group， the spike wave， α wave and β wave increased significantly with the increase of the Propofol dose （P < 0.05）， and the δ wave decreased significantly with the Propofol dose increasing （P < 0.05）. The density and distribution of hypothalamic arcuate nucleus were normal in the control group， with the large whole number of adenohypophysis cells， abundant sinusoid capillary between cells， and the cells were arranged regularly； no obvious lesions of rats arcuate nucleus neuron in Propofol group Ⅰ was observed， as well as no obvious reduction in adenohypophysis cells. With increasing of dose of anesthesia， the number of hypothalamic neuron cells and adenohypophysis cells reduced significantly， with unclear boundary of nuclear membrane and an increase in the number of irregular arrangement cells. The Western blot results suggested that with increasing of the Propofol dose， the Akt hippocampus protein expression reduced dramatically （P < 0.01） while Aβ expression increased significantly （P < 0.01） in anesthesia group comparing with control. Conclusion Low-dose Propofol anesthesia can not cause lesions in hypothalamus and hypophysis， but their feedback effects enhanced with Propofol dose increasing， causing pathological changes. The deposition effects of Propofol anesthesia on Aβ may be achieved by inhibiting Akt pathway.

[Key words] Propofol； Hypothalamus； Pituitary； Hippocampus amyloid β protein

術(shù)后認(rèn)知功能障礙是麻醉手術(shù)患者常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。海馬在機體的學(xué)習(xí)、記憶及意識行為等生理過程中起到重要的作用[1-2]，麻醉藥對海馬的結(jié)構(gòu)和功能有顯著的影響作用，其通過調(diào)節(jié)GABA-A受體抑制長時程增強，進而達到麻醉時的遺忘狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚及其他全麻藥可使在體記錄到的海馬腦電反應(yīng)和誘發(fā)電位產(chǎn)生明顯的劑量依賴性改變[3-4]。此外，丘腦也是麻醉藥發(fā)揮作用的主要靶位，皮質(zhì)環(huán)路在麻醉藥對感覺信息處理產(chǎn)生影響[5]，而腦下垂體在功能上與下丘腦緊密相連，所以一般將下丘腦與垂體看作為一個完整的功能系統(tǒng)，對靶器官的功能活動進行調(diào)節(jié)[6-8]。本研究通過不同劑量的丙泊酚麻醉大鼠，觀察不同劑量丙泊酚對大鼠下丘腦和垂體的形態(tài)學(xué)影響，以及大鼠海馬內(nèi)Aβ表達的變化，并研究其可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。

SPF級SD大鼠，雄性，月齡4個月，體重在180～220 g，24只大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6只，室溫（22±3）℃，自然光照，相對濕度60%～65%，自由飲水和進食。

1.2 藥品與試劑

丙泊酚注射液購自美國AstraZeneca公司。羧甲基纖維素鈉購自天津市佳興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司，批號：20090324。磷酸化蛋白富集試劑盒PhosphoProtein Purification Kit購自QIAGEN公司。蛋白質(zhì)定量試劑盒2DQUANTKIT購自美國GE公司。小鼠抗大鼠keratin 18單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。羊抗大鼠apoE多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。HRP標(biāo)記的ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Amersham Pharmacia公司。

1.3 主要儀器和設(shè)備

大鼠尾靜脈注射固定簡購自德國貝朗醫(yī)療有限公司。Milli.Q超純水儀購自美國Millipore公司。大鼠腦組織分離器械購自美國GE公司。Excelsior TMES自動組織脫水機購自美國 Thermo Scientific公司。垂直電泳系統(tǒng)美國美國GE公司。BH-2型OLYM-PUS 顯微鏡及攝像裝置購自日本Olympus公司。低溫離心機美國Sigma公司。漩渦振蕩器購自Bio. Rad公司。凝膠圖像分析儀Kodak 2000購美國GE公司等。

1.4 麻醉模型的建立

24只大鼠設(shè)為4組，每組各6只，本實驗采用較小劑量分次大鼠尾部靜脈注射的方式，注射共3次。每次劑量為10 mg/mL，在30 min內(nèi)給藥完畢，各次注射后的累積劑量依次為10、20、30 mg/mL，分別設(shè)為丙泊酚Ⅰ組，丙泊酚Ⅱ組和丙泊酚Ⅲ組，每天麻醉實驗1次，對照組為清醒狀態(tài)下大鼠，不進行麻醉處理。對照組腦電信號測量時，參考高春芳的方法[9]，取大鼠俯臥位，采用雙極導(dǎo)聯(lián)法，作用電極一極放置在兩眼外眥連線中點處，一極放置在兩耳廓中部連線中點處，參考電極放置在左側(cè)頸部皮下位置，用自制的銀電極刺入皮下并設(shè)置倒鉤防止脫落。電極插入并待大鼠進入安靜狀態(tài)后采集腦電信號，丙泊酚組大鼠在注射不同劑量丙泊酚的情況下，注射后5 min開始采集，每5分鐘測量1次，共采集3次，采用Matlab軟件計算各波段的信號值，并求平均值。

1.5 HE染色

連續(xù)麻醉10 d后，各組大鼠均于末次麻醉后，開胸，暴露心臟，自左心室升主動脈灌注約250 mL生理鹽水，待流出液為無色；繼以灌注4%多聚甲醛約300 mL至大鼠變硬。灌注結(jié)束后，取腦、垂體，放入4%多聚甲醛進行后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察下丘腦、垂體形態(tài)學(xué)變化。

1.6 Western blot法檢測海馬中Akt和Aβ的表達

連續(xù)麻醉10 d后，分離大鼠海馬組織，將各組的大鼠海馬組織加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液中進行勻漿處理，將完畢的勻漿液12 000 r/min下離心20 min，之后取上清液，測定總的蛋白濃度。通過調(diào)整相同的蛋白濃度后，進行電泳獲得分子量分離的蛋白條帶，各實驗組蛋白液與等體積上樣緩沖液混勻袁煮沸3 min，以15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)印蛋白至硝酸纖維素膜。然后將其放在封閉液中封閉2 h，根據(jù)Western blot顯像試劑盒的指導(dǎo)說明來進行，蛋白的NC膜電轉(zhuǎn)，進行蛋白封閉和一抗孵育標(biāo)記兔抗大鼠的多克隆抗體。ECL試劑盒顯色后，暗室發(fā)光拍照，以β-actin為內(nèi)參進行系統(tǒng)軟件分析[10]。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用方差齊性檢驗，方差齊者采用SNK-q檢驗法，方差不齊者采用Tamhane's T2檢驗法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同麻醉深度時腦電波頻率變化

與對照組比較，棘波、α波和β波隨著丙泊酚麻醉深度的增加而顯著增加（P < 0.05），δ波隨著丙泊酚麻醉深度的增加而顯著降低（P < 0.05）。見表1。

2.2 不同劑量丙泊酚對下丘腦弓狀核神經(jīng)元的影響

對照組下丘腦弓狀核神經(jīng)元密度較大，分布均勻，胞核清楚，胞漿染色較深；丙泊酚Ⅰ組大鼠弓狀核神經(jīng)元無明顯病變；隨著劑量丙泊酚的增加，下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，染色質(zhì)出現(xiàn)邊際化，胞漿尼氏體溶解，核膜界限不清，鬼影細(xì)胞出現(xiàn)程度增加。見圖1。

2.3 不同劑量丙泊酚對腺垂體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

對照組腺垂體細(xì)胞整體數(shù)目多，細(xì)胞間有豐富的竇狀毛細(xì)血管，細(xì)胞排列規(guī)則；與對照組比較，丙泊酚Ⅰ組的腺垂體細(xì)胞并無出現(xiàn)明顯的降低；隨著丙泊酚劑量的增加，丙泊酚Ⅱ組和丙泊酚Ⅲ組垂體細(xì)胞整體數(shù)目有所減少，細(xì)胞間竇狀毛細(xì)血管增多，細(xì)胞排列不規(guī)則增加。見圖 2。

2.4 大鼠海馬內(nèi)Akt及Aβ含量變化

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，連續(xù)麻醉10 d后，與對照組比較，丙泊酚Ⅰ組、丙泊酚Ⅱ組和丙泊酚Ⅲ組海馬內(nèi)的Akt 蛋白表達降低（P < 0.01），Aβ表達明顯增加（P < 0.01）。見圖3。

3 討論

清醒狀態(tài)下大鼠大腦中的神經(jīng)元處于活動狀態(tài)，信號主要為高頻低幅的去同步波，序列的復(fù)雜度高，自相似性低，對應(yīng)δ波值高；麻醉狀態(tài)大鼠大腦中的神經(jīng)元處于意識和感覺的抑制狀態(tài)，信號主要為低頻同步波，序列復(fù)雜度低，自相似性高，對應(yīng)的δ波值低；麻醉狀態(tài)愈深，神經(jīng)元抑制越嚴(yán)重，對應(yīng)的腦電δ波值越低。

為了避免丙泊酚在腹腔注射出現(xiàn)部分吸收的缺點，在給藥的途徑上利用大鼠尾部靜脈注射的方式使這一缺點得到大大的改善，能夠確保丙泊酚在大鼠體內(nèi)的血藥濃度的穩(wěn)定性，本研究從麻醉誘導(dǎo)到維持僅僅使用了丙泊酚這一種麻醉藥，很好地避免了其他麻醉藥物對實驗結(jié)果的干擾，因此筆者觀察到丙泊酚對大鼠下丘腦，垂體以及海馬的影響變得更加準(zhǔn)確。Larsson等[11]和Jang等[12]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚按10 mg/mL麻醉大鼠時，其血流動力學(xué)波動最小且麻醉效果最穩(wěn)定，因此，本研究選用10 mg/mL為起點，檢測10、20、30 mg/mL三個濃度下的丙泊酚對大鼠下丘腦，垂體以及海馬Aβ的影響。

下丘腦與腦下垂體共同組成了完整的神經(jīng)內(nèi)分泌功能系統(tǒng)[13-14]，此系統(tǒng)可以通過下丘腦促垂體區(qū)的肽能神經(jīng)元分泌的肽類神經(jīng)激素，經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)輸送至腺垂體，促使相應(yīng)的腺垂體激素分泌，此外，還可通過軸漿流動方式把下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的肽類神經(jīng)激素經(jīng)送達神經(jīng)垂體，并在神經(jīng)垂體中貯存。垂體分泌的激素除了能夠直接分泌促激素作用于相應(yīng)的靶腺外，還可以調(diào)節(jié)靶器官的功能活動，并經(jīng)靶腺激素間接調(diào)節(jié)某些器官的生理功能[15-17]。麻醉對下丘腦、腺垂體的作用是可能是通過HPOA反饋過程間接發(fā)生的，只有當(dāng)丙泊酚對靶器官的毒性作用增強到極限時，這時才會反饋于下丘腦和腺垂體，導(dǎo)致其病理的發(fā)生，而本實驗發(fā)現(xiàn)，低劑量麻醉時由于麻醉劑量較低或給藥時間較短，尚不足以使下丘腦垂體發(fā)生病變，當(dāng)不斷地加大麻醉劑量時，下丘腦和腺垂體反饋作用增強，導(dǎo)致病理變化的發(fā)生[18]。

Akt是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是多條信號通路的重要交叉點，Akt具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及凋亡的關(guān)鍵作用，有研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)kt途徑能夠減輕Aβ對細(xì)胞的毒性作用[19-21]，本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)麻醉10 d后不同劑量丙泊酚都對Aβ的沉積產(chǎn)生了促進作用，這意味著高劑量的丙泊酚對大鼠淀粉樣β蛋白的影響作用可能是通過降低Akt途徑實現(xiàn)的。

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（收稿日期：2017-04-02 本文編輯：蘇 暢）