西洋參莖葉皂苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷炎癥反應(yīng)的影響

任鵬宇　關(guān)亞新　張婷婷

[摘要] 目的 探討西洋參莖葉皂苷（PQS）對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。方法 SD大鼠120只，隨機(jī)分為5組，對(duì)照組、模型組、西洋參莖葉皂苷（50、100、200 mg/kg）組，采用大腦中動(dòng)脈阻塞法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型。缺血再灌24 h后檢測大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分；干濕重法測定腦含水量；生化法檢測腦組織髓過氧物酶（MPO）的活性；ELISA 法檢測大鼠腦組織及血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）的含量。結(jié)果 西洋參莖葉皂苷（100、200 mg/kg）組可明顯減輕缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)功能損傷和腦水腫程度，降低缺血腦組織MPO的活性，降低缺血腦組織和血清TNF-α和IL-6的含量。結(jié)論 西洋參莖葉皂苷可通過降低TNF-α 和IL-6炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減緩炎癥反應(yīng)，減輕腦水腫，降低大鼠腦神經(jīng)功能損傷程度，進(jìn)而對(duì)腦缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 缺血再灌注；西洋參莖葉皂苷；炎癥；腫瘤壞死因子α

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）19-0033-03

[Abstract] Objective To explore the relationship between the protective effect of panax quinquefolium saponins （PQS） on focal cerebral ischemic injury in rats and the inflammatory reactions. Methods 120 SD rats were randomly divided into 5 groups，control group， model group， PQS groups（50， 100， 200 mg/kg）. A model of cerebral ischemia-reperfusion injury was established by middle cerebral artery occlusion. The score of rats' neurological impairment was measured 24 hours after ischemia reperfusion； brain water content was measured by dry and wet weight method； the activity of myeloperoxidase（MPO） in brain tissue was detected by biochemical method. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in rats' brain tissues and serum were measured by ELISA. Results PQS （100， 200 mg/kg） could significantly reduce the degree of cerebral nerve impairment and cerebral edema in the rats with ischemia-reperfusion injury， decrease the activity of MPO in ischemic brain tissue， and lower the contents of TNF-α and IL-6 in ischemic brain tissue and serum. Conclusion Panax quinquefolium saponins（PQS） can slow the inflammatory reactions， alleviate cerebral edema and reduce the degree of neurological impairment in rats by decreasing the expression of TNF-α and IL-6 inflammatory cytokines， and then exert a protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury.

[Key words] Ischemia reperfusion； Panax quinquefolium saponins （PQS）； Inflammations； Tumor necrosis factor-α

西洋參莖葉皂苷（PQS）是由西洋參莖和葉中所提取的主要活性成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗心肌缺血損傷等廣泛的生物活性[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，PQS對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍未完全明確，尤其是其關(guān)于抗炎機(jī)制的報(bào)道相對(duì)較少。因此，本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈阻塞法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察PQS對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用，研究其保護(hù)作用機(jī)制與炎癥反應(yīng)之間的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠50只，清潔級(jí)，雄性，體重280～330 g，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]。所有大鼠給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，保持室內(nèi)安靜，日照12 h，室溫保持在 20℃～25℃，相對(duì)濕度控制在40%～60%。

1.2 藥品與試劑

西洋參莖葉皂苷由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室提供，純度>90%；TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒均由欣博盛生物科技有限公司提供。

1.3 給藥與分組

SD大鼠按體重隨機(jī)被分為以下5組：（1）對(duì)照組；（2）缺血再灌注模型組；（3）PQS治療組（50、100、200 mg/kg）組，每組10只。PQS治療組于模型制備前每天灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃7 d。對(duì)照組和模型組均灌胃給予相同容積的生理鹽水。

1.4 采用 Longa 線栓法[4]加以改進(jìn)制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型

大鼠以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)，頸部采用左旁中切口，暴露左側(cè)頸總（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA），并鈍性分離，ECA結(jié)扎后于其分叉處剪一0.2 mm切口，將直徑為0.245 mm、頭端制成直徑約為0.34 mm光滑圓球的尼龍線自切口處經(jīng)頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，遇輕微阻力時(shí)停止推入，插入深度約為17～20 mm，扎緊并固定線栓，缺血2 h提拉栓線至頸總動(dòng)脈內(nèi)進(jìn)行再灌注。術(shù)后以電熱毯保暖使大鼠直腸體溫維持在（37±0.5）℃。對(duì)照組僅分離血管，并把尼龍線插入頸總動(dòng)脈1 cm左右，不達(dá)到大腦中動(dòng)脈位置。

1.5 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

動(dòng)物蘇醒后放回籠內(nèi)，自由飲食，腦缺血再灌注24 h后根據(jù)Longa的5分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。0分：無神經(jīng)功能障礙；1分：右前爪不能充分外展；2分：行走時(shí)朝右轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)朝右傾倒；4分：不能自主行走，伴意識(shí)障礙[5]。選取神經(jīng)功能損傷評(píng)分為1～3分大鼠用于以下實(shí)驗(yàn)，每組各6只。

1.6 干濕重法行腦含水量測定

缺血再灌注24 h后，大鼠迅速斷頭取腦。用濾紙吸除缺血側(cè)腦皮質(zhì)表面的殘血，電子天平精確稱其濕重，然后將腦組織置于105℃常壓恒溫烘箱中，烘烤至恒重水平，電子天平精確稱其干重。采用如下公式：腦組織含水量（%）=（腦組織濕重-腦組織干重）/腦組織濕重×100%，計(jì)算腦組織含水量。

1.7 腦組織髓過氧化物酶（MPO）活性測定

各組大鼠在缺血再灌注24 h后，迅速斷頭，取大鼠缺血側(cè)額頂葉皮層腦組織100 mg，用試劑盒提供的介質(zhì)溶液將大鼠腦組織制成 10%的勻漿液，嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，計(jì)算腦組織MPO活性。

1.8 腦組織及血清TNF-α和IL-6含量測定

各組大鼠在缺血再灌注24 h后，心臟取血3～5 mL，于4℃ 2000 r/min條件下離心10 min，取血清并放置于-80℃冰箱保存；各組大鼠在缺血再灌注24 h后迅速斷頭，用加冰生理鹽水將缺血側(cè)皮層腦組織制成10%的勻漿液，于4℃條件下離心10 min，吸取上清保存于-80℃冰箱；按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測腦組織及血清樣品中TNF-α和IL-6的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間資料統(tǒng)計(jì)采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PQS對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能障礙的影響

對(duì)照組大鼠無神經(jīng)功能損傷障礙表現(xiàn)；腦缺血再灌注24 h 后，模型組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，相比對(duì)照組，模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯增高（P<0.01），提示造模成功；與模型組相比，PQS（100、200 mg/kg）劑量組可明顯降低大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分（P<0.05）。見表1。

2.2 PQS對(duì)缺血腦組織含水量的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠缺血腦組織含水量明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，PQS高劑量組可明顯降低大鼠腦組織含水量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 PQS對(duì)缺血腦組織MPO活性的影響

模型組大鼠缺血腦組織中MPO 活性明顯高于對(duì)照組（P<0.01）；PQS（100、200 mg/kg）劑量組可明顯降低缺血腦組織MPO活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.4 PQS對(duì)缺血腦組織TNF-α和IL-6含量的影響

模型組大鼠腦組織TNF-α和IL-6的含量較對(duì)照組均明顯升高（P<0.01，P<0.05）；相比模型組，PQS（100、200 mg/kg）劑量組均可明顯降低缺血腦組織TNF-α和IL-6的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.5 PQS對(duì)大鼠血清TNF-α和IL-6含量的影響

模型組大鼠血清TNF-α和IL-6的含量較對(duì)照組均明顯升高 （P<0.01）；相比模型組，PQS（100、200 mg/kg）劑量組均可明顯降低血清TNF-α和IL-6的含量，差異具有顯著性（P<0.05）。見表3。

3 討論

既往研究提示在缺血再灌注腦損傷的生理病理發(fā)展過程中炎癥反應(yīng)起著非常重要的作用[6-7]。缺血再灌注發(fā)生后，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞被激活，血腦屏障由于內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)而受到損傷，從而引發(fā)腦水腫，形成缺血與炎性反應(yīng)之間的惡性循環(huán)。腦缺血后釋放多種炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素 6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）、白介素10（IL-10）等均參與以上病理生理學(xué)反應(yīng)過程，從而促進(jìn)腦缺血性損傷向炎癥性損傷發(fā)生轉(zhuǎn)變[8-9]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，阻斷腦缺血再灌注引發(fā)的炎癥應(yīng)答過程對(duì)腦組織具有一定的保護(hù)作用[10-11]。因此，通過抑制炎癥反應(yīng)、減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷可成為防治腦缺血再灌注損傷的一個(gè)重要策略。

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性缺血再灌注腦損傷模型模擬臨床腦缺血損傷病理變化，觀察發(fā)現(xiàn)PQS可減輕腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷、抑制腦水腫，這與以往研究結(jié)果一致[12]，提示PQS對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定程度的保護(hù)作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，PQS（100、200 mg/kg）劑量組可明顯降低缺血腦組織MPO活性（P<0.05）。位于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的MPO，可作為中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，其活性可評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞在組織中的浸潤程度及組織炎癥反應(yīng)的程度[13-14]。本研究觀察結(jié)果提示PQS可減輕由腦缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

TNF-α主要由活化的單核巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分泌產(chǎn)生，是體內(nèi)最為重要的炎癥介質(zhì)之一。研究表明在腦缺血早期即出現(xiàn)TNF-α表達(dá)水平上調(diào)高，其可激活炎性細(xì)胞、誘導(dǎo)IL-6、IL-1β等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、壞死和腦水腫的形成，TNF-α在腦缺血早期分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因[15-16]。IL-6在腦缺血損傷中的作用機(jī)制復(fù)雜，具有保護(hù)和損傷雙重作用。IL-6在正常生理狀態(tài)下，其血清表達(dá)水平很低，具有保護(hù)和修復(fù)神經(jīng)元的作用；IL-6在腦缺血后的急性損傷期，其表達(dá)量迅速升高，可導(dǎo)致神經(jīng)元的破壞及內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。IL-6作為缺血性腦損傷急性期嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志，可受TNF-α、IL-1β的調(diào)控，進(jìn)而參與機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)[17-18]。因此，抑制炎性因子TNF-α、IL-6等的合成、分泌及表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷可成為減輕缺血再灌注腦損傷的一項(xiàng)重要策略。在本研究結(jié)果中TNF-α和IL-6在對(duì)照組大鼠血清和腦組織中的含量均較低，而模型組大鼠血清和腦組織中TNF-α和IL-6的含量均顯著升高，且TNF-α與IL-6的含量變化趨勢基本一致，也提示二者在腦組織發(fā)生缺血再灌注損傷后具有協(xié)同作用。PQS（100、200 mg/kg）劑量組均可明顯降低缺血再灌注損傷后大鼠血清和腦組織中TNF-α和IL-6的含量，提示PQS可通過抑制炎性細(xì)胞因子減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕缺血性腦損傷。

綜上所述，PQS可通過調(diào)節(jié)炎癥性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的合成及分泌，減緩炎性反應(yīng)，抑制腦水腫，減輕缺血大腦神經(jīng)功能損傷程度，進(jìn)而對(duì)大鼠缺血再灌注腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

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