miR-139-5p調(diào)控KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的功能與機(jī)制研究

曹田宇，杜 風(fēng)，李婷宇，盧瑗瑗，趙曉迪

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院,腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710032;*通訊作者,E-mail:leedyzhao@fmmu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:luyuandreamer@aliyun.com)

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miR-139-5p調(diào)控KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的功能與機(jī)制研究

曹田宇，杜 風(fēng)，李婷宇，盧瑗瑗#，趙曉迪*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院,腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710032;*通訊作者,E-mail:leedyzhao@fmmu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:luyuandreamer@aliyun.com)

目的 建立結(jié)直腸癌KRAS突變細(xì)胞DKO-1的miR-139-5p功能獲得模型,探討miR-139-5p對(duì)KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型的影響及可能的分子機(jī)制。 方法 利用real-time PCR檢測(cè)miR-139-5p在KRAS突變同源細(xì)胞系中表達(dá);通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染建立miR-139-5p功能獲得細(xì)胞模型;通過(guò)繪制MTT生長(zhǎng)曲線和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-139-5p對(duì)DKO-1細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響;通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-139-5p對(duì)DKO-1細(xì)胞生長(zhǎng)遷移侵襲的影響;通過(guò)生物信息學(xué)分析miR-139-5p的下游靶基因,利用雙熒光酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-139-5p與靶基因的直接結(jié)合情況。 結(jié)果 miR-139-5p在KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)降低(P<0.01);過(guò)表達(dá)miR-139-5p能夠抑制DKO-1細(xì)胞的生長(zhǎng)能力(P<0.01)、集落形成能力(P<0.01)、遷移和侵襲能力(P<0.01);miR-139-5p能夠直接結(jié)合FOS基因的3′-UTR區(qū)(P<0.01)。 結(jié)論 miR-139-5p能夠抑制DKO-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,其機(jī)制可能與抑制FOS基因表達(dá)有關(guān)。

結(jié)直腸癌; miR-139-5p; KRAS突變; 細(xì)胞增殖; 遷移; 侵襲

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)均居第3位[1]。在我國(guó),結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升,其中死亡率已躍居第5位[2]。近年來(lái),以抗表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)為代表的分子靶向治療的出現(xiàn),豐富和發(fā)展了結(jié)直腸癌的綜合治療手段。大量研究表明,分子靶向藥物聯(lián)合化療能有效提高結(jié)直腸癌患者的生存率[3],其中KRAS基因狀態(tài)是影響療效的重要因素。KRAS基因是EGFR信號(hào)通路中的重要分子,其編碼的KRAS蛋白為EGFR通路下游的一種G蛋白分子。KRAS基因突變后導(dǎo)致EGFR信號(hào)通路異?；罨?從而對(duì)EGFR單抗治療失效[4]。因此,研究結(jié)直腸癌細(xì)胞中KRAS突變后在分子、通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)水平的改變,有望為KRAS突變的結(jié)直腸癌患者尋找新的治療靶點(diǎn)。

miRNA是一類19-24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子,通過(guò)靶向mRNA的3′末端非編碼區(qū)(3′-UTR)實(shí)現(xiàn)對(duì)下游靶基因的負(fù)性調(diào)節(jié)。miRNA通過(guò)與促癌基因和抑癌基因相互作用,可發(fā)揮抑癌基因或促癌基因的雙重功能,在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、耐藥和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明,miRNA表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的普遍現(xiàn)象,且呈現(xiàn)高度的特異性[5]。近年來(lái),miRNA在結(jié)直腸癌中的研究不斷增多,揭示了其在調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用[6,7]。然而,結(jié)直腸癌KRAS基因突變與細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)異常是否直接相關(guān)還有待研究;KRAS下游的受控的miRNA及其功能和機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究關(guān)注KRAS突變同源細(xì)胞系中差異表達(dá)基因miR-139-5p,通過(guò)建立功能獲得細(xì)胞模型,明確了miR-139-5p在調(diào)控KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮的功能,初步探討了miR-139-5p抑制FOS基因調(diào)控KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系DLD-1、DKs-8和DKO-1引自美國(guó)范德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心胃腸病學(xué)系Robert Coffey教授實(shí)驗(yàn)室;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、抗生素及胰酶(Gibco,美國(guó));轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、miR-139-5p模擬物及陰性對(duì)照(Invitrogen,美國(guó));miRNA提取試劑盒(Qiagen,美國(guó)),miR-139-5p引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及real-time PCR試劑盒(Applied Biosystems,美國(guó));MTT、二甲基亞砜(Sigma,美國(guó));Transwell小室(Millipore,美國(guó)),Matrigel基質(zhì)膠(Corning,美國(guó));RIPA蛋白裂解液(江蘇碧云天),BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國(guó)Thermo,美國(guó));c-FOS抗體、β-actin抗體(Cell Signaling,美國(guó)),山羊抗鼠、抗兔二抗(北京中杉);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega,美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

DLD-1、DKs-8和DKO-1細(xì)胞均用含10%胎牛血清、1%抗生素(青霉素、鏈霉素和絲裂霉素)的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將DKO-1細(xì)胞接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū),將20 nmol/L陰性對(duì)照和miR-139-5p模擬物(miR-139-5p mimic,miR-139-5p)分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,使用miRNA提取試劑盒抽提細(xì)胞RNA并測(cè)量RNA濃度及A260/A280比值。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,設(shè)置反應(yīng)體系為20 μl,設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)?16 ℃,30 min;42 ℃,30 min;85 ℃,5 min。使用PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)miR-139-5p在各細(xì)胞系中的表達(dá),設(shè)置反應(yīng)體系為20 μl,設(shè)置PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃,20 s;95 ℃,1 s;60 ℃,20 s;60個(gè)反應(yīng)循環(huán)。以U6 snRNA基因?yàn)閮?nèi)參,通過(guò)2-ΔΔCt方法分析實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,接種至5塊48孔板,按分組每組設(shè)置5個(gè)重復(fù),每孔細(xì)胞數(shù)約為3×103個(gè)。每24 h取出其中1塊48孔板,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h。移除每孔中的液體,加入150 μl二甲基亞砜;室溫輕微震蕩10 min以溶解甲臜產(chǎn)物。使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm測(cè)定各孔吸光度值;以時(shí)間為橫軸、吸光度值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 集落形成實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,接種至6孔板,按分組每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每孔細(xì)胞數(shù)約為1×103個(gè),輕微搖晃培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)直至形成肉眼可見(jiàn)集落。移除培養(yǎng)基,PBS漂洗3次;每孔加入甲醇2 ml,固定15 min;移除甲醇,PBS漂洗3次。每孔加入結(jié)晶紫染色液2 ml,染色15 min;移除結(jié)晶紫染色液,PBS沖洗,在清潔空氣中干燥。計(jì)數(shù)每孔集落形成數(shù)量并照相。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,接種至6孔板。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度約90%-95%時(shí),用20 μl槍頭垂直于6孔板制造細(xì)胞劃痕,吸去細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS沖洗劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。加入無(wú)血清培養(yǎng)基,將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),每隔24 h取出拍照。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃過(guò)夜,次日將液化的Matrigel與培養(yǎng)基以1 ∶6的比例稀釋。將濾膜孔徑為8 μm的Transwell小室放入24孔板中,在小室內(nèi)加入50 μl Matrigel稀釋液包被濾膜。將培養(yǎng)板置于孵箱中4 h使包被液晾干。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,使用含10%BSA的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。在小室外加入600 μl含10%血清的培養(yǎng)基,在小室內(nèi)加入100 μl細(xì)胞懸液,放入孵箱培養(yǎng)48 h。取出小室,用PBS漂洗3次后置于95%乙醇中固定5 min,在0.5%結(jié)晶紫染色液中染色10 min;用PBS漂洗去除未結(jié)合細(xì)胞的染色液。用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細(xì)胞,在顯微鏡下觀察濾膜下層細(xì)胞,每個(gè)樣本隨機(jī)選取10個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.8 蛋白提取與Western blot檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,加入約200 μl細(xì)胞裂解液(含Cocktail蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑),置于冰上裂解20 min;離心收集上清,用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取40 μg蛋白加入上樣緩沖液,經(jīng)100 ℃、5 min變性后用10%的SDS-PAGE分離。蛋白質(zhì)半干轉(zhuǎn)移至NC膜。10%脫脂牛奶室溫封閉2 h。移除封閉液,分別加入c-FOS(1 ∶500)和β-actin(1 ∶2 000)一抗,置于4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次后加入相應(yīng)二抗(1 ∶2 000),室溫孵育1 h。TBST洗滌后,使用ECL化學(xué)發(fā)光液,在Bio-Rad ChemiDox XRS凝膠成像系統(tǒng)中顯影。

1.9 載體構(gòu)建與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過(guò)TargetScan等數(shù)據(jù)庫(kù),確定FOS基因3′UTR上的miR-139-5p的結(jié)合位點(diǎn)核苷酸序列。PCR擴(kuò)增獲得含有miR-139-5p結(jié)合位點(diǎn)的FOS基因序列,克隆到psiCHECK-2載體的XhoⅠ與NotⅠ的酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建熒光報(bào)告基因載體。測(cè)序鑒定后,用熒光報(bào)告基因載體分別和miR-139-5p或NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后Reporter lysis buffer裂解細(xì)胞,使用Luminometer熒光發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-139-5p在KRAS突變同源細(xì)胞系中表達(dá)降低

在親本細(xì)胞DLD-1以及由DLD-1衍生出的兩株分別包含野生型和G13D突變體KRAS等位基因的DKO-1(僅含突變的KRAS等位基因)和DKs-8(僅含野生型KRAS等位基因)等3株細(xì)胞系中檢測(cè)miR-139-5p的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明:miR-139-5p在DKs-8細(xì)胞中的表達(dá)較DLD-1明顯升高(P<0.01,見(jiàn)圖1A),在DKO-1細(xì)胞中則較DLD-1有所降低(P<0.01,見(jiàn)圖1A),提示miR-139-5p表達(dá)水平與結(jié)直腸癌細(xì)胞KRAS等位基因的突變狀態(tài)密切相關(guān)。為研究miR-139-5p在不同KRAS基因突變狀態(tài)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中的功能,利用miR-139-5p模擬物(miR-139-5p mimic)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DKO-1細(xì)胞建立miR-139-5p功能獲得細(xì)胞模型。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)miR-139-5p的表達(dá),結(jié)果表明:與陰性對(duì)照相比,轉(zhuǎn)染miR-139-5p mimic后DKO-1細(xì)胞中miR-139-5p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01,見(jiàn)圖1B),提示成功建立miR-139-5p功能獲得模型。

與DKs-8和DKO-1比較,**P<0.01 與陰性對(duì)照組比較,**P<0.01 A.不同突變狀態(tài)細(xì)胞中表達(dá) B.DKO-1細(xì)胞中miR-139-5p轉(zhuǎn)染效率圖1 miR-139-5p在不同KRAS突變狀態(tài)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及在DKO-1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率Figure 1 The expression of miR-139-5p in isogenic colon cancer cells harbor different KRAS mutation status and transfection efficiency of miR-139-5p mimic in DKO-1 cells

2.2 過(guò)表達(dá)miR-139-5p抑制KRAS突變細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)

為觀察miR-139-5p對(duì)KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖表型的影響,我們對(duì)miR-139-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型分別進(jìn)行了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和集落形成能力的檢測(cè)。利用MTT法檢測(cè)miR-139-5p對(duì)細(xì)胞體外增殖的影響,結(jié)果表明:上調(diào)miR-139-5p后DKO-1細(xì)胞的存活率低于對(duì)照組(P<0.01,見(jiàn)圖2)。進(jìn)一步通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:上調(diào)miR-139-5p后DKO-1細(xì)胞的集落形成數(shù)明顯少于對(duì)照組(P<0.01,見(jiàn)圖3)。上述結(jié)果表明,miR-139-5p能抑制體外KRAS突變腸癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)能力。

與對(duì)照組比較,**P<0.01圖2 miR-139-5p對(duì)DKO-1細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響Figure 2 The effects of miR-139-5p on proliferation in DKO-1 cells

2.3 過(guò)表達(dá)miR-139-5p抑制KRAS突變細(xì)胞遷移和侵襲

為進(jìn)一步觀察miR-139-5p對(duì)KRAS突變腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型的影響,分別利用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-139-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型的遷移和侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:上調(diào)miR-139-5p后,DKO-1細(xì)胞遷移的能力明顯降低(見(jiàn)圖4),DKO-1細(xì)胞侵襲的數(shù)量也明顯下降(P<0.01,見(jiàn)圖5)。上述實(shí)驗(yàn)表明,miR-139-5p能在體外抑制KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

與對(duì)照組和空白組比較,**P<0.01圖3 miR-139-5p對(duì)DKO-1細(xì)胞集落形成能力的影響Figure 3 The effects of miR-139-5p on colony formation in DKO-1 cells

圖4 miR-139-5p對(duì)DKO-1細(xì)胞劃痕遷移能力的影響Figure 4 The effects of miR-139-5p on migration of DKO-1 cells

2.4 miR-139-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中靶基因的預(yù)測(cè)和鑒定

為探討miR-139-5p抑制KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移表型的分子機(jī)制,利用TargetScan、PicTar和miRanda等公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-139-5p與靶基因3′-UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分析表明,FOS基因的3′-UTR的96-102和526-432段堿基序列分別含有miR-139-5p的2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖6A)。利用Western blot檢測(cè)DLD-1、DKO-1和DKs-8細(xì)胞中FOS基因的表達(dá),結(jié)果表明:與DLD-1細(xì)胞相比,FOS蛋白在DKs-8中表達(dá)降低,在DKO-1細(xì)胞中表達(dá)則明顯升高(圖6B),提示FOS蛋白表達(dá)水平與KRAS基因的突變狀態(tài)密切相關(guān)。分別構(gòu)建包含野生型和突變型miR-139-5p結(jié)合位點(diǎn)的FOS基因3′-UTR的熒光素酶報(bào)告基因載體,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),結(jié)果表明:上調(diào)miR-139-5p可抑制含有其結(jié)合位點(diǎn)的FOS野生型3′-UTR報(bào)告基因的熒光強(qiáng)度,而對(duì)于突變型質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度則無(wú)明顯影響(P<0.01,圖6C)。上述實(shí)驗(yàn)表明,miR-139-5p能通過(guò)與FOS的3′-UTR區(qū)域上的結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合,FOS是miR-139-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的直接靶分子。

與對(duì)照組比較,**P<0.01圖5 miR-139-5p對(duì)DKO-1細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 5 The effects of miR-139-5p on invasion in DKO-1 cells

A.FOS基因3’UTR區(qū)上的miR-139-5p結(jié)合位點(diǎn)示意；B.c-Fos蛋白在不同KRAS突變狀態(tài)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)；C.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)觀察miR-139-5p對(duì)FOS基因的抑制圖6 miR-139-5p對(duì)KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞中靶基因的預(yù)測(cè)和FOS蛋白的影響Figure 6 Effect of miR-139-5p on the prediction of target genes and the gene and protein expression of FOS in isogenic colon cancer cells harbor different KRAS mutation status

3 討論

KRAS基因是RAS基因家族的重要組成成員,含有4個(gè)編碼外顯子和1個(gè)5′端非編碼外顯子,共同編碼含189個(gè)氨基酸組成的KRAS蛋白[8]。作為小G蛋白,KRAS蛋白通過(guò)GTP/GDP的相互轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路的活性,在細(xì)胞生長(zhǎng)分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。KRAS基因突變后,RAS蛋白始終處于GTP結(jié)合的活化形式,刺激細(xì)胞生長(zhǎng)增殖,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。KRAS基因突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中,KRAS基因突變發(fā)生率為30%-60%[1]。多項(xiàng)研究表明,KRAS基因突變可預(yù)測(cè)西妥昔單抗治療轉(zhuǎn)移性大腸癌的療效且與預(yù)后不良相關(guān)[9,10]。盡管KRAS基因突變可以作為抗EGFR治療的參考依據(jù),但是KRAS基因是否能為結(jié)直腸癌的預(yù)后提供參考依據(jù)存在爭(zhēng)議,尚有證據(jù)顯示KRAS基因突變并不影響預(yù)后[11-13]。KRAS基因在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中究竟發(fā)揮多大的關(guān)鍵性作用? 不同KRAS基因型如何影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性表型?上述問(wèn)題仍有待深入研究。本研究利用結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD-1(含野生型KRAS等位基因和G13D突變體KRAS等位基因)及其衍生出的DKO-1細(xì)胞(僅G13D突變體KRAS等位基因)和DKs-8細(xì)胞(僅野生型KRAS等位基因)作為模型,以排除不同遺傳背景對(duì)KRAS突變基因作用機(jī)制的影響。此外,由于結(jié)直腸癌患者KRAS基因突變多發(fā)生于2號(hào)外顯子上的12、13號(hào)密碼子,尤其在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)直腸癌及非家族遺傳性息肉病中以G13D突變最為常見(jiàn),因此僅含G13D突變體的DKO-1細(xì)胞代表了臨床典型的KRAS基因突變亞型,為后續(xù)研究提供了理想的細(xì)胞模型。

miRNA-139的表達(dá)異常在肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、急性粒細(xì)胞淋巴瘤等多種腫瘤中均有報(bào)道[14,15]。在結(jié)直腸癌中,Li等[16]發(fā)現(xiàn)miR-139-5p在癌組織的表達(dá)顯著低于正常組織,且與腫瘤分期相關(guān);上調(diào)miR-139-5p可通過(guò)EMT和BLC凋亡通路影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能和藥物抵抗。Cao等[17]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-139-5p表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PDE4D下調(diào)和cAMP上調(diào),導(dǎo)致BIM介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯,從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究中利用real-time PCR檢測(cè)miR-139-5p在KRAS突變同源細(xì)胞系中表達(dá),明確miR-139-5p在KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)降低;進(jìn)一步過(guò)表達(dá)miR-139-5p能夠抑制DKO-1細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、遷移和侵襲能力,提示miR-139-5p可抑制KRAS基因突變后的惡性表型。

由于miRNA通過(guò)負(fù)向調(diào)控下游靶基因發(fā)揮其功能,因此分析和鑒定靶分子是研究miR-139-5p功能的基礎(chǔ)。利用生物信息學(xué)對(duì)miR-139-5p與靶基因3′-UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),FOS基因含有miR-139-5p的2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。Fos癌基因家族由4個(gè)成員組成:FOS,FOSB,FOSL1和FOSL2,這些基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白,與JUN家族的蛋白質(zhì)二聚化形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡[18]。FOS基因作為經(jīng)典的癌基因家族,與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。與癌旁組織相比,侵襲性宮頸癌中c-FOS表達(dá)水平明顯升高。在骨肉瘤和子宮內(nèi)膜癌中,c-FOS基因表達(dá)升高與腫瘤高級(jí)別病理分級(jí)及不良預(yù)后相關(guān)[18]。乳腺癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),c-FOS表達(dá)水平可作為獨(dú)立預(yù)測(cè)危險(xiǎn)因子[19]。在本研究中,FOS蛋白在突變KRAS細(xì)胞系的表達(dá)明顯高于野生KRAS細(xì)胞系,提示FOS基因過(guò)表達(dá)可能與KRAS突變細(xì)胞系的惡性表型相關(guān)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),證實(shí)FOS基因?yàn)閙iR-139-5p的直接靶分子,受miR-139-5p的負(fù)性調(diào)控?；谏鲜鼋Y(jié)果,我們推測(cè),在結(jié)直腸癌細(xì)胞中,KRAS突變使miR-139-5p表達(dá)下降,使得后者對(duì)FOS基因的負(fù)性調(diào)控解除,FOS升高則進(jìn)一步促進(jìn)KRAS突變細(xì)胞系的惡性生物學(xué)表型。應(yīng)當(dāng)指出,KRAS與miR-139-5p的間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系尚不明確,有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上,本研究明確了miR-139-5p在KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲表型中發(fā)揮抑制作用的基因的功能,并提出miR-139-5p通過(guò)抑制FOS調(diào)控KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型分子機(jī)制,本研究將為KRAS突變結(jié)直腸癌患者尋找新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The miR-139-5p regulates proliferation,migration and invasion in KRAS-mutated colon cancer cells

CAO Tianyu,DU Feng,LI Tingyu,LU Yuanyuan#,ZHAO Xiaodi*

(XijingHospitalofDigestiveDiseases,StateKeyLaboratoryofCancerBiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;*Correspondingauthor,E-mail:leedyzhao@fmmu.edu.cn;#Co-correspondingauthor,E-mail:luyuandreamer@aliyun.com)

ObjectiveTo explore the effect of miR-139-5p on the malignant phenotype of KRAS mutant colon cancer cells and its potential molecular mechanisms.MethodsReal-time PCR was performed to detect the expression of miR-139-5p in KRAS isogenic cell lines.Gain-of-function cell model was established by transient transfection with miR-139-5p mimics.MTT growth curve and colony formation assay were conducted to determine the effect of miR-139-5p on growth and proliferation of DKO-1 cells.Would healing and Transwell invasion assays were used to investigate the effect of miR-139-5p on migration and invasion of DKO-1 cells.Bioinformatic analysis was employed to predict downstream target genes of miR-139-5p.Dual luciferase reporter assay was used to verify direct interaction between miR-139-5p and its target gene.ResultsThe miR-139-5p was down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells(P<0.01).The miR-139-5p overexpression significantly inhibited the proliferation,migration and invasion of DKO-1 cells(P<0.01).The miR-139-5p was directly bound to the 3′-UTR of the FOS gene.ConclusionThe miR-139-5p could inhibit the proliferation,migration and invasion of DKO-1 cells via inhibiting expression of FOS gene.

colorectal cancer； miR-139-5p； KRAS mutation； proliferation； migration； invasion

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81602641;81572929)

曹田宇,男,1993-05生,在讀本科,第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅,E-mail:15249261543@163.com

2017-01-10

R735.3

A

1007-6611(2017)04-0322-07

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.005