基于核糖體工程技術(shù)的泰樂菌素高產(chǎn)菌株的選育研究

牛 春，丁亞蓮， 張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

泰樂菌素是一類大環(huán)類酯類抗生素，在弗氏鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)[1]。泰樂菌素主要由泰樂菌素A、B、C、D 四個組分組成，其中泰樂菌素A為主要組分，并且生物活性最強[2]。泰樂菌素A的主體結(jié)構(gòu)上有三個脫氧糖苷配基性質(zhì)決定了這類藥物的藥學動力特性[3]。泰樂菌素是一種用于畜禽的抗菌藥物，其抑菌機制是阻止肽?；鵷RNA從mRNA的移位，使氨?；鵷RNA不能結(jié)合到原位點，使細菌蛋白質(zhì)合成受阻[4]。泰樂菌素對畜禽有明顯的促生長作用，又不與人類產(chǎn)生交叉耐藥性，在養(yǎng)殖業(yè)市場中需求較大，因此應用空間較為廣闊[5]。在抗生素發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中，有三項重要工藝，即菌種選育、發(fā)酵工藝與產(chǎn)品提純工藝，其中菌種選育是源頭工作，最為主要。核糖體工程育種技術(shù)主要作用于細胞的核糖體與RNA聚合酶，微生物次級代謝產(chǎn)物開始產(chǎn)生時，反應中ppGpp(鳥苷-5′-二磷酸-3′-二磷酸)才有明顯積累，抗生素的抗性突變可激活依賴ppGpp積累來啟動的菌體產(chǎn)生抗生素能力[6-7]。

核糖體對微生物次級代謝產(chǎn)物的合成有重要的調(diào)控作用，使用核糖體工程技術(shù)篩選高產(chǎn)突變株，其原理是利用作用于核糖體上的抗生素為藥物標記，使核糖體蛋白或rRNA發(fā)生定向突變導致蛋白質(zhì)合成能力的改變[8-9]。這種靶向核糖體或RNA聚合酶的自發(fā)抗藥性突變改變了菌落形態(tài)而引起發(fā)酵產(chǎn)量的改變[10]。劉華華等利用核糖體工程技術(shù)將阿維拉霉素的產(chǎn)量提高了1.8倍[11]。Wang等用了7或8種藥物的耐藥性獲得產(chǎn)生了大量的聚酮類放線菌素抗生素，比野生型產(chǎn)生的水平高出180倍[12]。本文使用核糖體工程技術(shù)篩選泰樂菌素高產(chǎn)突變株，在泰樂菌素高產(chǎn)菌的選育過程中，采用遞推的方式，從單一抗性突變株到多重抗性突變株，使泰樂菌的產(chǎn)素能力有了很大的提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 泰樂菌素產(chǎn)生菌株T19-805，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術(shù)中心提供。

1.1.2 試劑 鏈霉素、慶大霉素、夫西地酸、硫鏈絲菌素、林可霉素、遺傳霉素、巴龍霉素，以上抗生素均購于Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 斜面和分離平板培養(yǎng)基(g/L)：淀粉2.5、蛋白胨2.0、氯化鎂0.5、硫酸亞鐵0.1、硫酸鋅0.1、瓊脂2。調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2， 培養(yǎng)溫度28±1 ℃，培養(yǎng)濕度35%～45%，培養(yǎng)周期9～15 d。

種子培養(yǎng)基(g/L)：黃豆餅粉4、酵母抽提粉2.5、玉米漿3、碳酸鈣4、豆油4。調(diào)節(jié)pH值為7.6～7.8， 培養(yǎng)溫度28±1 ℃，培養(yǎng)濕度35%～45%，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)周期46～48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉15、玉米蛋白粉15、棉籽蛋白粉13、甜菜堿鹽酸鹽0.62、磷酸氫二銨0.5、氯化鉀1.2、氯化鈉1.1、碳酸鈣20、豆油45。調(diào)節(jié)pH值為7.6～7.8，培養(yǎng)溫度28±1 ℃，培養(yǎng)濕度為35%～45%，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min條件下，培養(yǎng)周期6～7 d。

1.2 方法

1.2.1 單孢子懸液的制備 取出發(fā)菌株T19-805新鮮斜面孢子，放入帶有玻璃珠的三角瓶中，加適量的生理鹽水，于28 ℃，150 r/min振蕩15～20 min，使孢子充分分散，經(jīng)脫脂棉過濾，制得單孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，控制孢子濃度為108～1010cfu/mL備用。

1.2.2 抗生素最小抑制濃度(MIC)的確定 取1.2.1項制備好的單孢子懸浮液0.1 mL分別涂布于含有不同濃度的7種抗生素(鏈霉素、慶大霉素、夫西地酸、硫鏈絲菌素、林可霉素、遺傳霉素、巴龍霉素)分離平板上，以不含抗生素的培養(yǎng)基平板為對照，28±1 ℃培養(yǎng)15～18 d。觀察并記錄不同平板上的菌落生長狀況，未長菌落的抗生素最小濃度即為抗生素對該菌的最小抑制濃度(Minimum inhibition concentration, MIC)。并統(tǒng)計致死率與正突變率。

致死率(%)=(對照組菌落數(shù)-抗生素處理后的菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)×100%，正突變率(%)=效價高于對照的正突變菌株數(shù)/所測菌株總數(shù)×100%。

1.2.3 單重抗藥性突變株的選育 挑取臨界MIC的抗生素平板上長出的單菌落30株，劃在含同等劑量抗生素的試管斜面中，28±1 ℃培養(yǎng)9～15 d。將生長起來的斜面孢子用無菌接種鏟刮取適量接種于種子培養(yǎng)基，28±1 ℃培養(yǎng)46～48 h，以15%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基(500 mL的三角瓶，裝量為45 mL)，28±1 ℃培養(yǎng)周期6～7 d，放瓶提取發(fā)酵產(chǎn)物檢測效價，篩選高產(chǎn)突變株保藏備用。

1.2.4 雙重抗藥性突變株的篩選 以1.2.3項獲得的單重抗性高產(chǎn)突變菌株為出發(fā)菌株，按1.2.2項制備成孢子菌懸液，稀釋后涂布在含兩種臨界濃度抗生素平板上，28±1 ℃培養(yǎng)9～15 d，生長出的菌落即為雙重抗性突變株。待菌落長成后挑取劃在含同等劑量的雙重抗生素斜面上。發(fā)酵搖瓶驗證篩選高產(chǎn)突變株保藏備用。

1.2.5 多重抗藥性突變株的篩選 以1.2.4項獲得的雙重抗性高產(chǎn)突變菌株為出發(fā)菌株，按1.2.1項制備成孢子菌懸液，稀釋后涂布在含四重臨界濃度抗生素平板上，28±1 ℃培養(yǎng)9～15 d，生長出的菌落即為四重抗性突變株。待菌落長成后挑取劃在含同等劑量的四重抗生素斜面上。發(fā)酵搖瓶驗證篩選高產(chǎn)突變株保藏備用。

1.2.6 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性試驗：將泰樂菌素高產(chǎn)菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，搖瓶發(fā)酵后測定泰樂菌素的化學效價，驗證其是否具有遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素最小抑制濃度的確定 以不含抗生素的空白平板上菌落數(shù)和菌落外觀為對照，與含不同抗生素濃度平板菌落進行對比，不同抗生素濃度對出發(fā)菌株T19-805孢子最小抑制濃度的測定，結(jié)果見表1。

表1 不同抗生素的致死率和正突變率

由表1結(jié)果可知，幾種抗生素對泰樂菌株都有一定的抑制作用，不同抗生素對其抑制的最小濃度不同。隨著抗生素濃度的不斷增加，菌株在篩選平板上的單菌落數(shù)逐漸減少，菌落外觀也逐漸變化，在抗生素濃度較小時對菌落形態(tài)影響較小，菌落大、邊緣整齊、孢子白潤豐富；第二次增加一個梯度的抗生素濃度平板上的菌落稍小、孢子較干、菌落成典型的饅頭型、邊緣整齊；第三次增加一個梯度的抗生素濃度菌落較小，挑取時發(fā)現(xiàn)是一層不易劃碎的結(jié)皮；第四次加大抗生素濃度，平板上的菌落很少，而且都是基質(zhì)，沒有白孢子形成。第五次與第六次加大抗生素濃度時，平板上都沒有單菌落形成，全部死亡。所以鏈霉素、慶大霉素、夫西地酸、硫鏈絲菌素、林可霉素、遺傳霉素與巴龍霉素的最小抑制濃度分別為2.6、2.8、2.7、0.35、4.0、0.25、0.5 μg/mL。正突變率分別約為27.3%、23.6%、24.2%、28.3%、28.5%、26.1%與24.6%。從正突變率分析不同抗生素對泰樂菌株產(chǎn)生效果由高到弱的順序依次為林可霉素、硫鏈絲菌素、鏈霉素、遺傳霉素、巴龍霉素、夫西地酸與慶大霉素。

2.2 單重抗性突變株篩選結(jié)果 在臨近最小抑制濃度的每種抗生素平板上挑取單菌落劃在含同等濃度的抗生素試管斜面上，7種抗生素每種挑取30株，共210株，斜面孢子培養(yǎng)至成熟。經(jīng)發(fā)酵搖瓶驗證，結(jié)果見圖1。

圖1 不同抗生素突變株的篩選結(jié)果

由圖1可知，210株中有3株菌的效價達到13000 μg/mL以上，分別是林可霉素、硫鏈絲菌素與鏈霉素的單重抗性突變株，菌株號及效價分別為Tlin-30(13256 μg/mL)、Ttsp-24(13118 μg/mL)、Tstr-15(13077 μg/mL)。其中Tlin-30(13256 μg/mL)效價最高，將出發(fā)菌株T19-805(12000 μg/mL)提高了10.5%。以Tlin-30為菌源進行雙重抗生素選育。

2.3 雙重抗生素突變株篩選結(jié)果 以Tlin-30為出發(fā)菌株，分離在含林可霉素與硫鏈絲菌素最小抑制濃度的雙重抗生素平板上，等菌落長成后挑取單菌落30株進行驗證，結(jié)果見圖2。

圖2 雙重抗生素突變株的篩選結(jié)果

由圖2可知，含林可霉素與硫鏈絲菌素雙重抗生素突變株中有3株菌的效價達到14000 μg/mL以上，其中Tlt-52(14885 μg/mL)效價最高，將單重抗生素標記菌株Tlin-30(13256 μg/mL)提高了12.3%，將原始出發(fā)菌株T19-805(12000 μg/mL)提高了24.0%。所以選菌株Tlt-52進行多重抗生素突變株的篩選。

2.4 多重抗生素抗性突變株的篩選 隨著抗生素種類不斷增加，篩選獲得的突變株耐藥性逐漸增強，所以本輪篩選同時多增加了兩種抗生素，按正突變率由高到低順序選用鏈霉素與遺傳霉素兩種抗生素，結(jié)果見圖3。隨著不同抗生素的逐級添加，抗性突變株的效價也逐步增高，結(jié)果見圖4。

圖3 四重抗生素突變株的篩選結(jié)果

由圖3可知，在含四種抗生素的突變株中有1株菌的效價明顯高于其他菌株，菌種號為Tltsg-69，效價達到16185 μg/mL。由圖4可知，原始出發(fā)菌株T19-805經(jīng)林可霉素單重抗生素突變，逐級增加硫鏈絲菌素、鏈霉素與遺傳霉素，高產(chǎn)突變株的效價不斷增加。突變株Tltsg-69(16185 μg/mL)將單重抗生素標記菌株Tlin-30(13256 μg/mL)提高了22.1%，將雙重抗生素標記菌株Tlt-52(14885 μg/mL)提高了8.7%，將原始出發(fā)菌株T19-805(12000 μg/mL)提高了34.9%。

圖4 出發(fā)菌株T19-805逐級增加抗生素時泰樂菌素產(chǎn)量不斷增長

2.5 高產(chǎn)突變株的遺傳穩(wěn)定性分析 將篩選到的高產(chǎn)菌株在斜面上連續(xù)培養(yǎng)4代，各代菌種經(jīng)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)測其化學效價，結(jié)果見表2。

表2 Tltsg-69菌株遺傳穩(wěn)定性實驗

由表2結(jié)果可知，突變株Tlpsg-69前四代的化學效價基本穩(wěn)定，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，第五代開始穩(wěn)定性較差，為了保證生產(chǎn)質(zhì)量，一般選取前兩代斜面使用。

2.6 高產(chǎn)突變株與出發(fā)菌株的菌絲形態(tài)比較 種子液的菌絲用美蘭染色，用光學顯微鏡，在100倍的油鏡下觀察，結(jié)果見圖5。

圖5 出發(fā)菌株T19-805與四重抗性突變株Tlpsg-69在種子液中指數(shù)增長時期的菌絲形態(tài)特征

由圖5可知，將突變株與出發(fā)菌株同時培養(yǎng)，觀察指數(shù)生長期種子液(發(fā)酵罐所需的最佳種子液)的菌絲形態(tài)，四重抗性突變株Tltsg-69的菌絲較粗、圓潤、著色深、舒展，網(wǎng)織稍疏松但不緊密，末端菌絲伸展有力，芽枝較長連成網(wǎng)織，菌絲網(wǎng)成大垛生長。出發(fā)菌株T19-805的菌絲較彎曲、稍細，末端菌絲舒展程度差，菌絲芽多較短。所以，四重抗性突變株的菌絲特征明顯優(yōu)于原始出發(fā)菌株的菌絲，菌絲形態(tài)的改善是發(fā)酵產(chǎn)量明顯提高的有力保障。

2.7 豆油加量對泰樂菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響 在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)穩(wěn)定突變株Tltsg-69的發(fā)酵液中豆油的利用率較差，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中含有較多的油脂，而原始菌株發(fā)酵液對豆油利用較充分。所以，推斷突變株對豆油的消耗較低(圖6)。

圖6 豆油加量對泰樂菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

由圖6可知，豆油加量對發(fā)酵產(chǎn)量影響較為明顯，隨著豆油加量不斷增大，發(fā)酵產(chǎn)量先升高后降低。豆油的加量為30 g/L時突變株Tltsg-69的產(chǎn)量最高為16507 μg/mL，而豆油的加量為45 g/L時出發(fā)菌株T19-805的產(chǎn)量最高為12000 μg/mL。所以突變株Tltsg-69的發(fā)酵液中豆油最適加量為30 g/L，對豆油消耗減少了33.3%，這樣就降低了原材料的成本。最終突變株Tltsg-69產(chǎn)量達到16507 μg/mL，將原始出發(fā)菌株T19-805(12000 μg/mL)提高了37.6%，具有很好的工業(yè)化生產(chǎn)價值。

3 小結(jié)與討論

本研究共選用了7種已報道對鏈霉菌突變有效的抗生素，分別是鏈霉素、慶大霉素、夫西地酸、硫鏈絲菌素、林可霉素、遺傳霉素與巴龍霉素。這7種抗生素對泰樂菌株都有一定的抑制作用。最小抑制濃度分別為2.6、2.8、2.7、0.35、4.0、0.25、0.5 μg/mL。正突變率分別約為27.3%、23.6%、24.2%、28.3%、28.5%、26.1%、24.6%。從正突變率分析對泰樂菌株產(chǎn)量有明顯提高作用的抗生素有4種，分別為林可霉素、硫鏈絲菌素、鏈霉素、遺傳霉素。

在單重抗生素突變株中共挑選了210株菌，以其中1株高產(chǎn)突變株Tlin-30(13256 μg/mL)為出發(fā)菌株進行雙重抗生素抗性突變株的篩選，獲得雙重抗生素高產(chǎn)突變株Tlt-52(14885 μg/mL)，再以其進行四重抗生素突變株的篩選，在含四種抗生素的突變株篩選中獲得1株高產(chǎn)突變株Tltsg-69，效價達到16185 μg/mL，將單重抗生素標記菌株Tlin-30(13256 μg/mL)提高了22.1%，將雙重抗生素標記菌株Tlts-52(14885 μg/mL)提高了8.7%，將原始出發(fā)菌株T19-805(12000 μg/mL)提高了34.9%。突變株Tltsg-69前四代的化學效價基本穩(wěn)定，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。從種子液指數(shù)生長期的菌絲形態(tài)特征分析，四重抗性突變株Tltsg-69的菌絲明顯好于原始出發(fā)菌株的菌絲，種子液菌絲形態(tài)的改善是發(fā)酵產(chǎn)量明顯提高的有力保障。

豆油加量對發(fā)酵產(chǎn)量影響較為明顯，隨著豆油加量不斷增大，發(fā)酵產(chǎn)量先升高后降低。豆油的加量為30 g/L時突變株Tltsg-69的產(chǎn)量最高為16507 μg/mL，而豆油的加量為45 g/L時出發(fā)菌株T19-805的產(chǎn)量最高為12000 μg/mL。所以突變株Tltsg-69的發(fā)酵液中豆油最適加量為30 g/L，對豆油消耗降低了33.3%，這樣就降低了原材料的成本。最終突變株Tltsg-69產(chǎn)量達到16507 μg/mL，將原始出發(fā)菌株T19-805(12000 μg/mL)提高了37.6%，所以利用核糖體工程育種方法有效的提高泰樂素產(chǎn)量。

微生物次級代謝的調(diào)控基因可能被激活，提高次級代謝產(chǎn)物的合成能力，是一種遺傳性改變[13]。研究發(fā)現(xiàn)，抗性突變是由于編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因或其它基因發(fā)生突變導致核糖體或核糖體蛋白發(fā)生改變而產(chǎn)生[14]。井岡霉素[15]，去甲基萬古霉素[16]利用帶鏈霉素抗性標記均篩到產(chǎn)素較高的菌株。核糖體工程育種技術(shù)需要的時間、成本較少，在菌株改良方面應用較為簡便。雖然本文應用核糖體工程技術(shù)選用了幾種抗生素處理泰樂菌素產(chǎn)生菌株，經(jīng)過大量發(fā)酵搖瓶篩選出高產(chǎn)突變菌株，但對于編碼核糖體蛋白的基因、突變位點的研究較少，有關(guān)的誘導機制需繼續(xù)加強學習研究。