氣相色譜法檢測(cè)多西環(huán)素中乙醇含量的不確定度評(píng)定

季 璇，王 軒，戴 青，趙 暉，韓寧寧，楊秀玉

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

鹽酸多西環(huán)素是由土霉素的α-6位脫氧得到的一種半合成四環(huán)素類抗生素，主要用于防治敏感細(xì)菌所致的畜禽呼吸道、膽道、尿道和皮膚軟組織感染，是一種在臨床上被廣泛使用的長(zhǎng)效廣譜抗生素類藥。多西環(huán)素原料藥制備的最后一步使用的是氯化氫-無(wú)水乙醇置換，因此成品中含有部分殘留的乙醇[1-2]。乙醇?xì)埩袅勘仨殗?yán)格控制，否則將直接影響多西環(huán)素原料藥的質(zhì)量，因此，各國(guó)藥典中的多西環(huán)素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)都對(duì)其中乙醇的含量進(jìn)行了控制。氣相色譜內(nèi)標(biāo)法是《中國(guó)獸藥典》2020年版規(guī)定的測(cè)定多西環(huán)素中乙醇含量的方法，內(nèi)標(biāo)法是氣相色譜定量分析中的一種重要技術(shù)，是一種比較準(zhǔn)確的定量方法；在色譜柱不超載的情況下，內(nèi)標(biāo)法的定量結(jié)果與儀器進(jìn)樣量重復(fù)性無(wú)關(guān)，因此，相對(duì)來(lái)說(shuō)，內(nèi)標(biāo)法保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性[3]。在獸藥檢測(cè)領(lǐng)域中，實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的量具、實(shí)驗(yàn)儀器和人員等都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差，所得的測(cè)量值只能為該檢驗(yàn)條件下的一個(gè)最佳估計(jì)值。因此，如何能表達(dá)出更加準(zhǔn)確或有效的結(jié)果，得出更加科學(xué)可靠的結(jié)論對(duì)獸藥檢測(cè)工作者來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。測(cè)量不確定度是被用來(lái)表征被測(cè)量值分散性的參數(shù)，是對(duì)測(cè)量結(jié)果可能誤差的度量，用來(lái)定量表示測(cè)量結(jié)果的可信程度[4-5]。一個(gè)完整的測(cè)量結(jié)果，除了應(yīng)給出被測(cè)量的最佳估計(jì)值之外，還應(yīng)同時(shí)給出測(cè)量結(jié)果的不確定度[6]。目前廣泛通用的不確定度評(píng)定模型是《測(cè)量不確定度評(píng)估指南》中的模型，根據(jù)《JJF1059.1-2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[7]，本文采用氣相色譜法對(duì)多西環(huán)素中乙醇的含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)測(cè)定過(guò)程的不確定度進(jìn)行了分析和評(píng)估，可為檢測(cè)方法的優(yōu)化和檢驗(yàn)結(jié)論的科學(xué)判定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與材料

1.1.1 試藥 供試品(鹽酸多西環(huán)素)，批號(hào)為A202108132，某市售商品；對(duì)照品(乙醇)，含量為100.0%，批號(hào)為130106-202105，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.2 材料 容量瓶：10 mL、50 mL和100 mL，A級(jí)；移液管：5 mL，A級(jí)。

1.2 儀器設(shè)備 氣相色譜儀：Agilent7890A氣相色譜儀，配有FID檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技公司；電子天平：型號(hào)XS205Du，分度值0.1 mg，Mettler Toledo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的制備

1.3.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液 取正丙醇約0.5 g，置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.1.2 供試品溶液 取供試品約1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.1.3 對(duì)照品溶液 取乙醇對(duì)照品約0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.1.4 系統(tǒng)適用性溶液 取乙醇對(duì)照品約5 g，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取2、5、3 mL，分別置25、50、25 mL量瓶中，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度制成每1 mL中含乙醇4、5、6 mg的系統(tǒng)適用性溶液，分別相當(dāng)于對(duì)照品溶液的80%、100%和120%。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：HP-PLOT/U，30 m×0.53 mm×1 mm/USB346822H；柱溫：135 ℃；進(jìn)樣口溫度：150 ℃；檢測(cè)器溫度：180 ℃；載氣：氮?dú)?，流速? mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇含量的測(cè)定

2.1.1 校正因子的計(jì)算 取對(duì)照品溶液，照1.3.2項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算校正因子，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 校正因子結(jié)果表

2.1.2 多西環(huán)素中乙醇的含量 取供試品溶液，照1.3.2項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算多西環(huán)素中乙醇的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。本實(shí)驗(yàn)多西環(huán)素中乙醇含量的測(cè)定結(jié)果為5.0%。

表2 乙醇含量測(cè)定結(jié)果表

從數(shù)學(xué)模型中可知X和W、V是相互獨(dú)立的非線性關(guān)系，可根據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》中的要求計(jì)算相對(duì)合成不確定度，無(wú)需計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的靈敏系數(shù)。

2.1.4 不確定分量的分析與計(jì)算 本實(shí)驗(yàn)測(cè)量不確定度來(lái)源的分析受檢測(cè)過(guò)程數(shù)學(xué)模型中各參數(shù)的影響，多西環(huán)素乙醇含量的不確定度來(lái)源主要來(lái)自稱量，溶液配制和儀器測(cè)量等其他因素，因果分析圖見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇含量測(cè)定不確定因素因果圖

2.2 測(cè)量不確定度評(píng)定

2.2.2 溶液制備過(guò)程的不確定度分析 溶液制備過(guò)程的不確定度主要來(lái)源于校準(zhǔn)的容量瓶?jī)?nèi)部體積u(V1)、容量瓶讀數(shù)重復(fù)性u(píng)(V2)和容量瓶實(shí)際溶解時(shí)的溫度和校準(zhǔn)溫度的偏離程度u(V3)3個(gè)方面。

表3 100 mL容量瓶的重復(fù)測(cè)量結(jié)果

表4 10 mL容量瓶的重復(fù)測(cè)量結(jié)果

2.2.2.3 內(nèi)標(biāo)引入的不確定度分析 加入內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來(lái)自于內(nèi)標(biāo)物的稱量、稀釋定容和實(shí)驗(yàn)溫度與校正溫度的差異3方面的因素，本實(shí)驗(yàn)中的供試品溶液和對(duì)照品溶液用的是同一內(nèi)標(biāo)溶液溶解稀釋，所以內(nèi)標(biāo)物的稱量和稀釋定容在計(jì)算中能夠相互抵消，因此，本實(shí)驗(yàn)中內(nèi)標(biāo)引入的不確定度忽略不計(jì)。

2.2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液的不確定度分析 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液僅用來(lái)評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)樣的重復(fù)性能，不參與最終乙醇含量的計(jì)算，因此，本實(shí)驗(yàn)不考慮系統(tǒng)適用性溶液引入的不確定度。

表5 重復(fù)性測(cè)量結(jié)果

2.3 合成不確定度的計(jì)算 u(X)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度即不確定分量的總方差的正平方根[10]，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(表6)，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(X)計(jì)算如下：u(X)

表6 分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度表

2.4 擴(kuò)展不確定度的計(jì)算 擴(kuò)展不確定度為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展因子(k)的乘積，U=u(X)·k=0.03%×2=0.06%(k=2，置信區(qū)間為95%)，含量可由測(cè)定值±擴(kuò)展不確定度表示[7]，因此多西環(huán)素中乙醇含量的結(jié)果可表示為(5±0.06)%，k=2。

3 討論與結(jié)論

測(cè)量不確定度的計(jì)算是將可能代入不確定度的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)作為分量，再將分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成所得。分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度能夠?qū)⒏鱾€(gè)檢驗(yàn)步驟對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響程度量化，檢驗(yàn)人員可參考不確定度計(jì)算結(jié)果，提高對(duì)結(jié)果影響較大的步驟的關(guān)注度，從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。引入不確定度的測(cè)量后，檢測(cè)結(jié)果可用“測(cè)定值+擴(kuò)展不確定度(U)”表示，從單一值變?yōu)闇y(cè)定值可能出現(xiàn)的范圍，該值若在限度值以內(nèi)，則可判定為合格；若該值在該限度值以外，可判定為不合格；若該值橫跨在限度值兩側(cè)，則應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注，可通過(guò)增加檢測(cè)次數(shù)或選擇經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)員進(jìn)行復(fù)檢以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本文對(duì)氣相色譜法測(cè)量多西環(huán)素中乙醇的含量進(jìn)行了不確定度評(píng)定，對(duì)各個(gè)影響不確定度的分項(xiàng)如稱量、溶液配制和儀器測(cè)量等因素分別進(jìn)行評(píng)定，發(fā)現(xiàn)對(duì)測(cè)量結(jié)果影響最大的分量為供試品溶液的配制過(guò)程，其余的環(huán)節(jié)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響程度從大到小依次為儀器測(cè)量、對(duì)照品配制、對(duì)照品稱量、供試品稱量。因此在固體制劑的檢驗(yàn)過(guò)程中，檢驗(yàn)人員要重點(diǎn)關(guān)注天平的稱量、容量瓶的使用和氣相色譜儀的使用和維護(hù)。在天平的使用過(guò)程中，檢驗(yàn)人員要做到根據(jù)樣品性質(zhì)、天平精度和量程范圍選擇合適的稱樣量，儀器管理人員要定期將玻璃量器送至計(jì)量機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)和校準(zhǔn)，對(duì)于天平和氣相色譜儀，除定期進(jìn)行檢定外，還要做到根據(jù)維護(hù)規(guī)程定期維護(hù)以保證天平稱重的準(zhǔn)確性和色譜峰分離的穩(wěn)定性，以減小不確定度分量對(duì)測(cè)定結(jié)果不確定度的影響，從而減小測(cè)定結(jié)果的不確定度。

測(cè)量不確定度的評(píng)定能夠把握測(cè)定過(guò)程中影響結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素，有利于確保相同實(shí)驗(yàn)條件下各個(gè)環(huán)節(jié)的重現(xiàn)性及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，為保證檢測(cè)方法的可靠性和測(cè)量結(jié)果的可信度提供了重要的參考依據(jù)[11]。