苦豆子提取物對多重耐藥大腸桿菌的體外抑菌作用

李志君，崔生玲，張 雯，張寶鎖，邵 倩，楊 奇*，張為民*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100，2.寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川 750004，3.寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司，寧夏吳忠 751600)

近年來，隨著抗生素在畜牧業(yè)和疾病治療中長期應(yīng)用和濫用，臨床分離出的大腸桿菌多呈現(xiàn)多重耐藥(Multiple drug resistance，MDR)現(xiàn)狀。根據(jù)歐洲抗生素耐藥性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)顯示，大腸桿菌對頭孢菌素類藥物的耐藥性在歐洲顯著增加，且喹諾酮類和氨基糖苷類聯(lián)用對大腸桿菌的治療效果也顯著下降[1]。耐藥細菌的出現(xiàn)和傳播，對多數(shù)國家都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟負擔(dān)。據(jù)報道，美國每年的財政負擔(dān)約增加3.8%用于控制MDR細菌感染，增加了約1.2萬億美元[2]。我國各地分離的大腸桿菌不僅耐藥的種類、范圍有所擴大，并且多重耐藥、交叉耐藥現(xiàn)象也在加劇。梁少姍等研究發(fā)現(xiàn)從湛江地區(qū)分離的90株大腸桿菌均為多重耐藥，21%的菌株耐9種抗菌藥物[3]，廖智慧等對分離自河北衡水地區(qū)的大腸桿菌藥敏檢測，結(jié)果表明分離菌株對磺胺異惡唑、鏈霉素和阿米西林的耐藥率高達80%以上[4]。耐藥細菌的出現(xiàn)，不僅對畜禽健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，可通過動物糞便進入土壤環(huán)境，從而在人類、動物、食物以及環(huán)境之間逐漸相互傳播，進而對人類健康產(chǎn)生潛在的威脅。因此，為了解決耐藥菌株引起的威脅，科學(xué)家們正在迫切探索新型抗生素和解決耐藥性問題的新方法[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，中草藥或中草藥中提取出的某些成分對耐藥菌具有良好的抑菌作用，有望成為目前有效解決細菌耐藥性問題的策略之一。如蜂蜜和蘆薈提取物可抑制糞腸球菌和大腸桿菌生長[6]?？喽棺?SophoraalopecuroidesL.)是豆科，槐屬的一種多年生草本或亞灌木植物，來源豐富，其根、莖、葉和種子均可入藥，具有重要的藥用價值[7]。研究發(fā)現(xiàn)，苦豆子提取成分中含有多種生物堿和黃酮類化合物[8]，不僅對多種細菌具有抑菌作用，并能增強耐藥菌對抗菌藥物的敏感性[9]。因此，本研究選用了天然中草藥苦豆子作為研究對象，探討了其對臨床分離的多重耐藥大腸桿菌的抑菌活性，為探索控制耐藥細菌的抗菌藥物資源開發(fā)提供了前期研究數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 試驗所用試劑胰蛋白胨大豆瓊脂、MH肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司)、注射用氨芐西林鈉(河北遠征藥業(yè)有限公司)、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶有限公司)、大觀霉素和頭孢噻呋(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、結(jié)晶紫(北京化工廠)、生物安全柜A2型(賽默飛世爾儀器有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱SHX350II(上海樹立儀器儀表有限公司)、電子天平BCE622-1CCN(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、比濁儀CBZ-1(北京潮聲公司)、酶標(biāo)儀Multiskan FC(賽默飛世爾科技Thermo)、立式壓力蒸汽滅菌鍋STIK IMJ-78A(上海朗銀壓力容器有限公司)。

1.1.2 藥材和菌株 苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)提取物(10:1，水提取于苦豆草的種子及地上部分)，購自陜西沐菲生物科技有限公司。1株多重耐藥大腸桿菌(MDRE.coli)由寧夏回族自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察從蛋雞糞便樣本中分離得到，對氨芐西林、慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、頭孢噻呋、恩諾沙星等抗菌藥物耐藥，同時攜帶blaTEM、blaCTX-M、aacC2、aac(3′)-Ⅱ、sul2和sul3 6種耐藥基因。標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌ATCC25922由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2 方法

1.2.1 供試菌液制備 在超凈工作臺內(nèi)，將試驗菌株接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，用一次性接種環(huán)挑取單菌落接種于3 mL無菌的LB肉湯中，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度至1×108CFU/mL，用LB肉湯稀釋成1×106CFU/mL，備用。

1.2.2 藥液制備 將苦豆子提取物溶于蒸餾水中，煮沸，配制成濃度為1 g/mL的藥液，置于4 ℃保存，備用。

1.2.3 最小抑菌濃度測定 采用微量肉湯二倍稀釋法測定苦豆子提取物、氨芐西林鈉、大觀霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和頭孢噻呋對MDRE.coli的最小抑菌濃度。在96孔板中每孔加入100 μL的MH肉湯，然后加入等量配制好的藥液與MH肉湯進行二倍稀釋混合，每孔接種100 μL菌液，使得每孔菌液終濃度為5×105CFU/mL，設(shè)置陰性和陽性對照。讀取結(jié)果前2 h，在每反應(yīng)孔內(nèi)加入5 μL 0.05%的TTC作為生長指示劑，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察每個孔中的顏色變化，以未變紅的最后一孔的濃度視為MIC[10]。

1.2.4 聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果測定 采用棋盤稀釋法測定苦豆子提取物和氨芐西林鈉、大觀霉素、氟苯尼考、恩諾沙星和頭孢噻呋5種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果[11]。

1.2.5 生長曲線的測定 將LB肉湯和苦豆子提取物混合，使培養(yǎng)基中的藥物濃度分別為MIC、1/2MIC、0，然后將調(diào)整好的菌液1000倍稀釋后加入含藥培養(yǎng)基內(nèi)，所有分組按照37 ℃、180 r/min條件下恒溫培養(yǎng)。各組從0 h開始，每隔2 h取等量菌液使用酶標(biāo)儀在630 nm處測定吸光值。以各時間點為橫坐標(biāo)，OD630nm為縱坐標(biāo)做生長曲線圖。

1.2.6 生物被膜形成能力的測定 在96孔板中分別加入20 μL 0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊腅.coli懸浮液和180 μL不同濃度的苦豆子提取物(MIC、1/2MIC和1/4MIC)，不加藥物組作為對照，置于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h后，棄上清，無菌PBS(pH 7.2)輕輕洗滌3次，甲醇固定15 min，倒出液體并風(fēng)干，然后向每孔中加入1%的結(jié)晶紫，并在37 ℃下孵育15 min，以使結(jié)晶紫滲透到生物被膜結(jié)構(gòu)中，將96孔板用水洗滌并風(fēng)干，加入200 μL 33%的冰醋酸中，孵育30 min，用以溶解染色的生物被膜，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測量OD值[12]。生物被膜形成的相對百分比=(OD藥物處理組/OD陰性對照組)×100[13]。

1.2.7 生物被膜清除作用測定 將E.coli菌懸液和LB肉湯在96孔板中進行24 h培養(yǎng)，然后去除上清液，向每孔加入200 μL的不同濃度苦豆子提取物，陰性對照組加入200 μL LB肉湯，37 ℃培養(yǎng)24 h后，按照1.2.6方法，棄去上清，無菌PBS洗滌3次后，甲醇固定15 min，用水洗滌風(fēng)干，然后加入200 μL 33%的冰醋酸孵育30 min，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測量OD值。生物被膜清除百分比=(OD陰性對照組-OD藥物處理組)/ OD陰性對照組×100。

1.2.8 運動能力的測定 在半固體培養(yǎng)基上研究E.coli群集運動性。LB培養(yǎng)基添加0.5%葡萄糖和0.5% 瓊脂用于群集運動試驗?？喽棺犹崛∥镆?/4 MIC至MIC的終濃度添加到LB培養(yǎng)基中。吸取5 μL菌液置于培養(yǎng)平板的中心，并在37 ℃下正置培養(yǎng)24 h，測量菌落直徑，未經(jīng)苦豆子提取物處理的E.coli作為陽性對照，試驗平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦豆子提取物和抗菌藥物的MIC測定結(jié)果 苦豆子提取物和5種抗菌藥物對MDRE.coli的MIC測定結(jié)果見表1。由表可知，苦豆子提取物對試驗菌株的MIC值為125 mg/mL。

表1 苦豆子提取物和抗菌藥物的MIC測定結(jié)果

2.2 苦豆子提取物與抗菌藥物聯(lián)用抑菌效果 由表2可知，苦豆子提取物與氨芐西林鈉、大觀霉素和恩諾沙星聯(lián)合應(yīng)用對試驗菌株表現(xiàn)為無關(guān)作用；與氟苯尼考表現(xiàn)為相加作用，與頭孢噻呋表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表2 苦豆子提取物與抗菌藥物聯(lián)用的抑菌效果

2.3 苦豆子提取物對試驗菌株生長曲線的影響 0～4 h期間，試驗組E.coli無明顯生長，4 h之后1/2MIC組E.coli生長進入快速繁殖階段，12 h之后生長趨于平緩，菌株進入平穩(wěn)生長期，但E.coli總量明顯低于對照組。MIC試驗組的E.coli生長明顯受到抑制，表明苦豆子提取物可抑制E.coli的生長(圖1)。

圖1 苦豆子提取物對MDR E.coli生長曲線的影響

2.4 苦豆子提取物對試驗菌株生物被膜抑制和清除的作用 苦豆子提取物對試驗菌株生物被膜的形成和清除作用見圖2。不同濃度苦豆子提取物(MIC、1/2MIC和1/4MIC)對試驗菌株生物被膜均具有良好的抑制活性，抑制率分別為54%、48%和29%，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。不同濃度的苦豆子提取物對試驗菌株生物被膜清除率為11%～27%。

圖2 不同濃度的苦豆子提取物對MDR E.coli生物被膜抑制和清除的作用

2.5 苦豆子提取物對試驗菌株群集運動測定 由圖3可知，MIC和1/2MIC可極顯著減少試驗菌株的群集運動擴散直徑(P<0.01)，并隨著苦豆子提取物濃度增加，試驗菌株的群集運動能力逐漸下降。

圖3 不同濃度的苦豆子提取物對MDR E.coli群集運動的影響

3 討 論

細菌獲得抗生素耐藥性已成為世界范圍的主要問題，被世界衛(wèi)生組織列為全球醫(yī)療保健威脅[14]，嚴(yán)重影響臨床療效和動物健康，中草藥因來源廣泛、安全性高、成本低等特點，其抗菌效果的研究已成為近幾年學(xué)者研究的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥及其化學(xué)成分不僅對耐藥菌具有良好的抑菌作用，且在一定程度可以消減細菌的耐藥性，對如今應(yīng)對細菌耐藥性日益嚴(yán)重的現(xiàn)狀具有重大意義[15]。

本研究測得苦豆子提取物對分離E.coli的MIC值為125 mg/mL，與其它中藥相比，其抑菌能力處于中等水平，為進一步驗證苦豆子提取物的抑菌作用，測定了其對E.coli生長曲線的影響。結(jié)果表明，不同濃度的苦豆子提取物均可以抑制E.coli的正常生長，短時間內(nèi)可以延緩菌株從遲緩期進入對數(shù)生長期，且MIC組比1/2MIC組抑制效果更強，表明苦豆子提取物對E.coli具有抑菌作用，且抑制效果呈濃度依賴性。張子越為探究馬齒莧水煎液對E.coli的抑菌活性繪制了生長曲線，結(jié)果顯示在不同濃度馬齒莧水煎液作用下，E.coli生長受到抑制，并隨著藥物濃度增加，對E.coli的抑制作用增強，這與本試驗研究的結(jié)果相符合[16]。

研究顯示，某些抗微生物的天然藥物能夠增強抗菌藥物的抑菌效果，或恢復(fù)藥物對細菌的敏感性，如Hossain等通過棋盤法測定了新型酚類化合物與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對E.coli的抑制作用，結(jié)果表明沒食子酸與甲砜霉素聯(lián)用、金縷梅單寧與紅霉素或甲砜霉素聯(lián)用對E.coli表現(xiàn)為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI分別為0.281、0.375 和 0.50[17]。黃柏水提取物與氟苯尼考和阿莫西林聯(lián)用對臨床分離產(chǎn)ESBLs大腸桿菌分別表現(xiàn)為協(xié)同、相加作用[18]。因此，中藥與抗菌藥物聯(lián)合使用可以有效促進抗菌藥物對病原菌的靶向作用，可能成為減少細菌耐藥性的一種有效途徑。本研究選擇了苦豆子提取物與5種抗菌藥物進行聯(lián)合作用效果測定，結(jié)果表明，苦豆子提取物與氟苯尼考聯(lián)合應(yīng)用為相加作用，與頭孢噻呋聯(lián)用呈現(xiàn)協(xié)同作用?？梢姡兴幘哂锌咕鲂У淖饔?，但一種中藥提取物與不同抗菌藥物聯(lián)用對菌株的作用效果可能有所差異，其原因可能是與菌株特異性或存在其他耐藥機制有關(guān)。

細菌在抗菌藥物的持續(xù)作用下，為了生存會通過各種方式來對抗抗菌藥物,因此，細菌針對不同抗菌藥物產(chǎn)生了相對應(yīng)的耐藥機制，目前大腸桿菌耐藥機制主要涉及產(chǎn)生鈍化酶或水解酶、藥物滲透屏障、藥物作用靶位點改變和生物被膜形成等幾個方面。據(jù)報道，80%的臨床感染性疾病與細菌的生物被膜有關(guān)[19]，說明生物被膜是細菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一，而群集運動可促進生物被膜的形成，增強細菌耐藥性。因此，本研究通過半固體瓊脂法探討了苦豆子提取物對E.coli群集運動的影響，結(jié)果表明，1/2MIC和MIC苦豆子提取物可極顯著降低E.coli的群集運動能力，并呈劑量依賴性。Ruan等評估了白藜蘆醇對禽致病性大腸桿菌(APEC)游泳和群集運動的影響，發(fā)現(xiàn)隨著白藜蘆醇濃度的增加，APEC的運動能力逐漸下降，抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴式[20]，與本研究結(jié)果相似。同時采用了結(jié)晶紫染色法檢測苦豆子提取物對試驗菌株生物被膜形成和清除的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦豆子提取物可抑制29%～54%的生物被膜形成，MIC濃度的苦豆子提取物可清除27%的生物被膜，破壞生物被膜的完整性。說明苦豆子提取物對細菌生物被膜具有抑制作用，但針對其它抑菌機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究對苦豆子的抑菌作用進行了初步探討，苦豆子提取物具有一定的體外抑菌和消除耐藥性的作用，對防控耐藥大腸桿菌感染具有重要意義。但研究結(jié)果顯示，苦豆子提取物的作用濃度較高，因此使其臨床的應(yīng)用價值較低?，F(xiàn)代研究表明，中藥主要是通過其某些活性成分來起到抑菌殺菌的作用[21]，因此對于苦豆子提取物中的具體有效活性成分還有待進一步的研究，以期為獸醫(yī)臨床應(yīng)用苦豆子防治細菌性感染疾病提供理論數(shù)據(jù)。