乙酰氨基阿維菌素國(guó)家對(duì)照品的研制

戴 青，陸連壽，趙富華，張秀英

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

乙酰氨基阿維菌素是乙酰氨基阿維菌素B1a和B1b兩個(gè)組分的混合物，主要組分為乙酰氨基阿維菌素B1a，是一種高效、廣譜、低殘留的獸用驅(qū)蟲(chóng)藥物，是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局和歐盟批準(zhǔn)的唯一應(yīng)用于泌乳奶牛無(wú)需棄奶的廣譜驅(qū)蟲(chóng)藥[1-2]，臨床上主要用于防治畜類的虱、螨、蠅等各種內(nèi)外寄生蟲(chóng)，目前制劑為乙酰氨基阿維菌素注射液和乙酰氨基阿維菌素澆潑劑。經(jīng)國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，目前我國(guó)在有效期內(nèi)的乙酰氨基阿維菌素原料及制劑的獸藥批準(zhǔn)文號(hào)有100多個(gè)。《中國(guó)獸藥典》一部收載了乙酰氨基阿維菌素與乙酰氨基阿維菌素注射液[3]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均需用到乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品來(lái)測(cè)定乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)的含量。美國(guó)藥典委員會(huì)可供應(yīng)乙酰氨基阿維菌素USP對(duì)照品，但國(guó)外對(duì)照品價(jià)格昂貴，購(gòu)買周期長(zhǎng)，給國(guó)內(nèi)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的質(zhì)量控制帶來(lái)不便。因此，擬研制乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品，用于乙酰氨基阿維菌素及其制劑的鑒別與含量測(cè)定，對(duì)于獸藥生產(chǎn)企業(yè)乙酰氨基阿維菌素及制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。

本次研制分別采用質(zhì)量平衡法與高效液相色譜外標(biāo)法兩種方法對(duì)乙酰氨基阿維菌素原料的含量進(jìn)行定值研究。其中質(zhì)量平衡法以色譜純度、水分、殘留溶劑、熾灼殘?jiān)汝P(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行定值，高效液相色譜外標(biāo)法以USP對(duì)照品作為溯源對(duì)照品進(jìn)行定值，以確保含量賦值的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津2010A高效液相色譜儀；Waters Synapt HDMS質(zhì)譜儀；Agilent 7890A氣相色譜儀；Mettler Toledo XS205電子分析天平(精度0.01 mg)； Metrohm 701 KF Titrino卡氏水分測(cè)定儀；CWF 11/5高溫爐。

1.2 試藥 乙酰氨基阿維菌素原料由浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；乙酰氨基阿維菌素USP對(duì)照品批號(hào)1237752，含量95.1%(其中乙酰氨基阿維菌素B1a含量90.09%，B1b含量5.01%)；乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶解度 分別考察乙酰氨基阿維菌素原料在甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮、水中的溶解度，測(cè)定結(jié)果(表1)與獸藥典中對(duì)乙酰氨基阿維菌素溶解度的規(guī)定一致。

表1 乙酰氨基阿維菌素原料的溶解度

2.2 引濕性 根據(jù)獸藥引濕性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，將原料在恒溫恒濕條件下(溫度25 ℃，相對(duì)濕度80%)放置24 h后計(jì)算增重百分率，判定樣品引濕性。結(jié)果測(cè)得樣品的增重百分率為8.7%，表明原料有引濕性。為進(jìn)一步判定試驗(yàn)條件下暴露時(shí)間對(duì)水分的影響，將原料在常規(guī)試驗(yàn)條件下(溫度25 ℃，相對(duì)濕度40%)于天平室內(nèi)敞口放置10、20、30、40、50、60 min，分別計(jì)算增重百分率，結(jié)果見(jiàn)表2，10分鐘內(nèi)樣品增重百分率小于0.5%，隨著放置時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸吸濕增重，表明稱量時(shí)應(yīng)控制好稱量環(huán)境的濕度，快速稱樣。

表2 乙酰氨基阿維菌素原料增重百分率

2.3 高效液相色譜法結(jié)構(gòu)確證 采用2.6項(xiàng)下的高效液相色譜方法，分別取供試品溶液與對(duì)照品溶液進(jìn)樣，采集液相色譜圖，考察供試品溶液主峰與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間是否一致。結(jié)果見(jiàn)圖1～圖2，在乙酰氨基阿維菌素含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜圖中，乙酰氨基阿維菌素原料主峰與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。

圖1 乙酰氨基阿維菌素USP對(duì)照品液相色譜圖

圖2 乙酰氨基阿維菌素原料液相色譜圖

2.4 高分辨質(zhì)譜法結(jié)構(gòu)確證

2.4.1 質(zhì)譜條件 模式：ESI正離子模式；毛細(xì)管電壓：2kv；錐孔電壓：10v；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：500L/h。

2.4.2 供試品溶液的制備 取乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，再用20%甲醇溶液稀釋制成每1 mL中含1 μg的溶液，進(jìn)樣測(cè)定分子量。

2.4.3 測(cè)定結(jié)果 在該質(zhì)譜條件下，乙酰氨基阿維菌素理論分子量為936.5086，供試品的測(cè)定分子量為936.5085(圖3)。供試品的測(cè)定分子量與理論值一致。

圖3 乙酰氨基阿維菌素原料質(zhì)譜圖

2.5 質(zhì)量平衡法定值

2.5.1 色譜純度

2.5.1.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Sunfire C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%高氯酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，45%A，55%B；15～25 min，5%A，95%B；25～30 min，45%A，55%B；30～35 min，45%A，55%B)；流速：1.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.5.1.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.1.3 測(cè)定結(jié)果 采用峰面積歸一化法分別計(jì)算乙酰氨基阿維菌素B1a和B1b的色譜純度，結(jié)果B1a純度為96.60%，B1b純度為2.40%，二者之和為乙酰氨基阿維菌素純度99.00%。

2.5.2 殘留溶劑 據(jù)查閱乙酰氨基阿維菌素原料企業(yè)的生產(chǎn)工藝可知，原料合成過(guò)程中所使用的有機(jī)溶劑為乙醇、甲醇和丙酮，因此采用頂空氣相色譜法測(cè)定這三種有機(jī)溶劑的含量。

2.5.2.1 氣相色譜條件 色譜柱：Agilent HP-5色譜柱(5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液)；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持10 min，再以每分鐘10 ℃的速率升溫至180 ℃，保持1 min；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度：250 ℃；頂空瓶平衡溫度：80 ℃；平衡時(shí)間：30 min。

2.5.2.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料0.5 g，置20 mL頂空瓶中，精密加入二甲基甲酰胺5 mL，搖勻，即得。

2.5.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甲醇、乙醇和丙酮各適量，分別用二甲基甲酰胺稀釋制成48 μg/mL的乙醇對(duì)照品溶液、8 μg/mL的甲醇對(duì)照品溶液和12 μg/mL的丙酮對(duì)照品溶液。

2.5.2.4 測(cè)定結(jié)果 取對(duì)照品溶液和供試品溶液分別頂空進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品中甲醇和丙酮的含量均低于檢測(cè)限，因此忽略不計(jì)。按外標(biāo)法計(jì)算供試品中乙醇的含量，結(jié)果為0.05%。

2.5.3 水分 照《中國(guó)獸藥典》一部附錄0832測(cè)定水分，結(jié)果為1.15%。

2.5.4 熾灼殘?jiān)?照《中國(guó)獸藥典》一部附錄0841測(cè)定殘?jiān)?，結(jié)果為0.02%。

2.5.5 質(zhì)量平衡法計(jì)算結(jié)果 質(zhì)量平衡法計(jì)算公式為含量=色譜純度×(1-水分-殘留溶劑-熾灼殘?jiān)?×100%，按照這公式分別計(jì)算乙酰氨基阿維菌素B1a與B1b的含量，結(jié)果為B1a：96.60%×(1-1.15%-0.05%-0.02%)×100%=95.42%；B1b：2.40%×(1-1.15%-0.05%-0.02%)×100%=2.37%。乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)含量為97.79%。

2.6 高效液相色譜外標(biāo)法定值

2.6.1 液相色譜條件 同2.5.1.1項(xiàng)下色譜條件。

2.6.2 供試品溶液的制備 取分裝后的乙酰氨基阿維菌素原料25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.3 對(duì)照品溶液的制備 取乙酰氨基阿維菌素USP對(duì)照品25 mg，置50 mL量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取對(duì)照品溶液1.5 mL，置液相進(jìn)樣瓶中，加1滴1 mol/L氫氧化鈉溶液，放置20 min后進(jìn)樣。系統(tǒng)適用性溶液色譜圖見(jiàn)圖4，乙酰氨基阿維菌素B1b峰、B1a峰、雜質(zhì)C+D峰和雜質(zhì)E峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.77、1.00、1.05和1.29，各峰間分離度均符合要求。

圖4 系統(tǒng)適用性溶液液相色譜圖

2.6.5 方法專屬性研究 為進(jìn)一步確定雜質(zhì)的分離情況，應(yīng)在測(cè)定前進(jìn)行專屬性試驗(yàn)考察。在10 mL供試品溶液中分別加入3滴鹽酸、1 mol/L氫氧化鈉溶液和30%過(guò)氧化氫溶液，放置30 min后進(jìn)樣，另取10 mL供試品溶液水浴加熱5分鐘，放冷后進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果乙酰氨基阿維菌素均產(chǎn)生了雜質(zhì)峰，但主峰與雜質(zhì)均能較好地分離，表明該方法具有較好的專屬性，見(jiàn)圖5～圖8。

圖5 酸破壞試驗(yàn)液相色譜圖

圖6 堿破壞試驗(yàn)液相色譜圖

圖7 氧化破壞試驗(yàn)液相色譜圖

圖8 加熱破壞試驗(yàn)液相色譜圖

2.6.6 測(cè)定結(jié)果 由三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室按照該方法進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，平均結(jié)果為乙酰氨基阿維菌素B1a含量95.79%，B1b含量2.39%。乙酰氨基阿維菌素(B1a+B1b)含量為98.18%。

2.7 穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn) 按《中國(guó)獸藥典》一部附錄穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則要求，進(jìn)行高溫(60 ℃)、高濕(相對(duì)濕度90%)和光照(4500lx)試驗(yàn)的穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)，分裝后的樣品在放置5 d和10 d后，按2.5.1項(xiàng)下方法考察乙酰氨基阿維菌素的純度變化。純度結(jié)果見(jiàn)表3，高濕條件下樣品幾乎無(wú)變化，高溫對(duì)樣品略有影響，10 d后純度下降0.28%，光照對(duì)樣品影響較大，10 d后純度下降2.10%。

表3 穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 對(duì)照品含量賦值 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[4]中列出5種定值方式，單一實(shí)驗(yàn)室通常采用兩種或更多不同原理的獨(dú)立參考方法定值。本研究采用質(zhì)量平衡法與高效液相色譜外標(biāo)法兩種不同原理的定值方法測(cè)定乙酰氨基阿維菌素含量，測(cè)定結(jié)果基本一致，相互佐證，可以保證定值的準(zhǔn)確性。質(zhì)量平衡法通常被認(rèn)為是一種具有較高準(zhǔn)確度的方法，其能夠直接溯源到國(guó)際單位制中的質(zhì)量單位，結(jié)果穩(wěn)定性好，測(cè)量結(jié)果比其他方法更準(zhǔn)確，世界衛(wèi)生組織及歐洲藥典推薦質(zhì)量平衡法為藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法[5-6]。雖然本研究?jī)煞N方法測(cè)定結(jié)果基本一致，但考慮到外標(biāo)法溯源各人間偏差較大，因此本研究最終采用質(zhì)量平衡法的定值結(jié)果對(duì)含量進(jìn)行賦值。

3.2 對(duì)照品的穩(wěn)定性 對(duì)照品具有較好的穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一個(gè)重要前提，使用中需要特別注意穩(wěn)定性問(wèn)題。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)該對(duì)照品進(jìn)行高溫、高濕和光照穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明該對(duì)照品對(duì)熱和光照均比較敏感，因此應(yīng)避光低溫保存。同時(shí)為了保證對(duì)照品在保存條件下的含量值的準(zhǔn)確性，根據(jù)獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范[7]要求，我們還應(yīng)對(duì)制備的對(duì)照品進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)，即在規(guī)定的貯存條件下，定期地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的穩(wěn)定性評(píng)估。分析該對(duì)照品的特性，由于該對(duì)照品采用安瓿分裝，水分、殘留溶劑和殘?jiān)蓟静粫?huì)發(fā)生變化，因此最能反映該對(duì)照品的變化的特性值為純度，因此確定第一次監(jiān)測(cè)時(shí)間為一年后，以后每年定期測(cè)定一次。對(duì)該對(duì)照品的純度進(jìn)行考察，由1人進(jìn)行測(cè)定，每次測(cè)定平行樣不少于5份，測(cè)定的結(jié)果與原純度結(jié)果相對(duì)偏差不得大于0.3%。