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    烏芪舒筋通絡(luò)片微生物限度檢查方法學(xué)研究

    2017-07-29 16:47:38陳震堯謝鍇標(biāo)姚偉生
    中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥 2017年18期
    關(guān)鍵詞:平皿試液菌液

    陳震堯+謝鍇標(biāo)+姚偉生

    [摘要]目的 建立烏芪舒筋通絡(luò)片的微生物限度檢查方法。方法 根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版第四部“1105、1106、1107”對(duì)烏芪舒筋通絡(luò)片進(jìn)行微生物限度檢查方法學(xué)研究。結(jié)果 需氧菌總數(shù)采用平皿稀釋法和薄膜過(guò)濾法、霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿常規(guī)法,回收率均在0.5~2,控制菌采用直接接種法可以檢查出大腸埃希菌、沙門(mén)菌、耐膽鹽革蘭陰性菌。結(jié)論 需氧菌總數(shù)選取平皿稀釋法、霉菌和酵母菌總數(shù)選取平皿常規(guī)法、控制菌選取直接接種法檢測(cè),方法可行,操作更簡(jiǎn)便,適用于烏芪舒筋通絡(luò)片的微生物限度檢查。

    [關(guān)鍵詞]烏芪舒筋通絡(luò)片;微生物限度;方法學(xué)研究;《中國(guó)藥典》2015年版

    [中圖分類號(hào)] R286 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721(2017)06(c)-0093-04

    [Abstract]Objective To establish a microbial limit test method of Wuqi Shujin Tongluo tablets.Methods Methodology research on microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets was conducted according to the "1105,1106,1107" of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition with the fourth part.Results The total number of aerobic bacteria could be tested by plate dilution method and membrane filtration method,the total number of fungus and yeasts could be tested by the plate routine method,and the recovery was between 0.5 and 2,Escherichia coli,Salmonella,Bile salt resistant Gram-negative bacteria could be detected through control bacteria by direct inoculation method.Conclusion The total number of aerobic bacteria can be tested by plate dilution method,the total number of fungus and yeasts can be tested by plate routine method,and the control bacteria can be tested by direct inoculation method,the methods used are feasible,and easier to operate,which are suitable for the microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets.

    [Key words]Wuqi Shujin Tongluo Tablets;Microbial limit;Methodology research;Chinese Pharmacopoeia 2015 edition

    烏芪舒筋通絡(luò)片是根據(jù)我院省名中醫(yī)驗(yàn)方制成的純中藥制劑,具有補(bǔ)肝腎,通絡(luò)止痛的作用,由細(xì)辛、制川烏、制草烏、桂枝、牛大力、防己、黑老虎、蜈蚣、走馬胎、羚羊角骨、牛膝、黃芪、杜仲、續(xù)斷、甘草等藥味組成[1]。該制劑微生物限度檢查法原按《中國(guó)藥典》2010年版進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[2],隨著《中國(guó)藥典》2015年版的實(shí)施,新版微生物限度檢查方法變化很大,必須重新進(jìn)行驗(yàn)證。為此,本研究按《中國(guó)藥典》2015 年版四部“1105、1106、1107”項(xiàng)下方法[3],對(duì)該制劑的微生物限度檢查方法進(jìn)行了再次驗(yàn)證研究,制訂了新的切實(shí)可行的微生物限度檢查法,替代了舊標(biāo)準(zhǔn),并應(yīng)用于該制劑的日常檢驗(yàn),使該制劑的微生物限度檢查法提升到新版《中國(guó)藥典》的水平。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    SZX型超凈工作臺(tái)(上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng)廠);BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜(蘇州凈化設(shè)備有限公司);YXQWF32-500臥式榘形壓力蒸氣消毒器(湖南衡陽(yáng)醫(yī)療器械廠);LRH-250A生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司);MJ-160B-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);CX31生物顯微鏡(奧林巴斯);HTY HOMO761勻漿儀(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司);JA2003N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);JC101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海成順儀器儀表有限公司、南通嘉程儀器有限公司合作出品)。

    1.2 樣品

    烏芪舒筋通絡(luò)片(肇慶市中醫(yī)院,批號(hào):15050401;15051102;15052401)。

    1.3 菌種

    實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代[4],并采用適宜的保藏方法保存,確保試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、乙型副傷寒沙門(mén)菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B)50094]。以上菌種均來(lái)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    1.4 培養(yǎng)基

    胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):3105210)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):3105120)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào):3105305)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào):3105054)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào):3105291)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):3105138)、RV沙門(mén)增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào):3104847)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):3104852)、三鐵塘瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):3105052)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號(hào):3105093)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):3104750),均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn),使用前先進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查,并且在有效期內(nèi)使用,培養(yǎng)基的制備按照標(biāo)示方法進(jìn)行。

    1.5稀釋液、沖洗液

    pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,批號(hào):3105256)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào):3105305)、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(自制)。

    2 方法與結(jié)果

    參照《中國(guó)藥典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度檢查法[3]進(jìn)行驗(yàn)證。

    2.1 菌液制備

    2.1.1 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌

    取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,30~35℃培養(yǎng)18~24 h;分別取各培養(yǎng)物 1 ml,加 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9 ml,按10 倍遞增稀釋級(jí)數(shù)制成每毫升含菌數(shù)為<100 cfu 的菌懸液[4]。

    2.1.2 白色念珠菌

    取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至100 ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,20~25℃培養(yǎng)2~3 d,取培養(yǎng)物 1 ml,加 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9 ml,按10 倍遞增稀釋級(jí)數(shù)制備成每毫升含菌數(shù)<100 cfu 的菌懸液[4]。

    2.1.3黑曲霉

    取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中,20~25℃培養(yǎng)5~7 d,加入3~5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液,洗脫孢子。再選用適宜的方法將孢子懸液吸至無(wú)菌試管內(nèi),用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每毫升含菌數(shù)<100 cfu 的孢子懸液[4]。

    2.2 供試液的制備

    取供試品10 g,加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 ml,用勻漿儀打碎,混勻,作為1∶10的供試液。量取1∶10的供試液10 ml,加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋至100 ml,混勻,作1∶100的供試液。

    2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

    2.3.1 平皿常規(guī)法

    2.3.1.1 試驗(yàn)組 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù):取1∶10的供試液5份,每份100 ml,分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌液適量,振搖均勻,使每毫升供試液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中,平行制備2份,立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,凝固,30~35℃中培養(yǎng)≤3 d,計(jì)數(shù)。

    霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù):取1∶10的供試液2份,每份100 ml,分別加入白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌液適量,振搖均勻,使每毫升供試液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中,平行制備2份,立刻傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,凝固,20~25℃中培養(yǎng)≤5 d,計(jì)數(shù)。

    2.3.1.2 供試品對(duì)照組 取1∶10的供試液,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液,同試驗(yàn)組操作。

    2.3.1.3 菌液對(duì)照組 取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替1∶10的供試液,按試驗(yàn)組項(xiàng)下方法操作,加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

    2.3.1.4 計(jì)算 各菌株的回收率(R)=(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù))/菌液組的平均菌落數(shù)×100%[5-6],依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部規(guī)定,比值R應(yīng)為0.5≤R≤2[7-9](表1)。

    2.3.2 平皿稀釋法

    2.3.2.1 試驗(yàn)組 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù):取1∶100的供試液5份,每份100 ml,按“2.3.1.1”項(xiàng)下方法操作。

    霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù):采用平皿常規(guī)法R為0.5~2,所以不再進(jìn)行稀釋法研究。

    2.3.2.2 供試品對(duì)照組 取1∶100的供試液,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

    2.3.2.3 菌液對(duì)照組 取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替1∶100的供試液,按試驗(yàn)組項(xiàng)下操作方法加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

    2.3.2.4 計(jì)算 按“2.3.1.4”項(xiàng)下公式計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表2。

    2.3.3 薄膜過(guò)濾法

    2.3.3.1試驗(yàn)組 取1∶10供試液10 ml,濾過(guò),取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液200 ml,分2次沖洗濾膜,在第2次沖洗中加入相應(yīng)的菌液適量(含菌量≤100 cfu),濾過(guò),取出濾膜,需氧菌檢查將膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中,在30~35℃下培養(yǎng),≤3 d,霉菌和酵母菌檢查將膜貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中,在20~25℃下培養(yǎng)≤3 d。

    2.3.3.2 供試品對(duì)照組 取1∶10供試液10 ml,以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

    2.3.3.3 菌液對(duì)照組 取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替1∶10的供試液,按試驗(yàn)組項(xiàng)下操作方法加入試驗(yàn)菌液,同時(shí)進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

    2.3.3.4 計(jì)算 按“2.3.1.4”項(xiàng)下公式計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表3。

    由表1~3可知,烏芪舒筋通絡(luò)片需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查采用平皿稀釋法、薄膜過(guò)濾法,霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢查采用平皿常規(guī)法、薄膜過(guò)濾法,R均在0.5~2內(nèi),符合《中國(guó)藥典》2015年版四部微生物學(xué)限度檢查驗(yàn)證的要求??紤]到實(shí)際操作中,平皿常規(guī)法、平皿稀釋法操作簡(jiǎn)便,優(yōu)于操作繁瑣的薄膜過(guò)濾法,故需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)法可選用培養(yǎng)基稀釋法,霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查選用平皿常規(guī)法為最佳方法。

    2.4 控制菌適用性試驗(yàn)

    2.4.1耐膽鹽革蘭陰性菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

    取1∶10供試液適量,混勻,20~25℃培養(yǎng)2 h,作為預(yù)培養(yǎng)供試品。取預(yù)培養(yǎng)供試品3份,每份10 ml,分別加入10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基,第1份加入1 ml緩沖液作為供試品組,第2份加入1 ml大腸埃希菌(含菌量≤100 cfu/ml)作大腸埃希菌陽(yáng)性對(duì)照組,第3份加入1 ml銅綠假單胞菌(含菌量≤100 cfu/ml)作為銅綠假單胞菌陽(yáng)性對(duì)照組。另取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基10 ml,加入10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基及1 ml緩沖液,作為陰性對(duì)照組。于30~35℃培養(yǎng)24~48 h,劃線接種到紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的平板上,30~35℃下培養(yǎng)18~24 h,觀察菌落形態(tài),結(jié)果見(jiàn)表4。

    2.4.2大腸埃希菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

    取1∶10供試液2份,每份10 ml,分別加入到100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,第1份加入1 ml緩沖液,混勻,作為供試品組,第2份加入1 ml大腸埃希菌(含菌量≤100 cfu/ml),混勻,作陽(yáng)性對(duì)照組;另取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基110 ml,加入1 ml緩沖液,作為陰性對(duì)照組,均于30~35℃中培養(yǎng)18~24 h。

    取以上培養(yǎng)物1 ml加入到100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,在42~44℃下培養(yǎng)24~48 h。然后劃線接種于麥康凱瓊脂平板上,在30~35℃下培養(yǎng)18~72 h,觀察菌落形態(tài),結(jié)果見(jiàn)表5。

    2.4.3沙門(mén)菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)

    取1∶10供試液2份,每份100 ml,第1份加入1 ml緩沖液,混勻,作為供試品組,第2份加入1 ml沙門(mén)菌(含菌量≤100 cfu/ml),混勻,作陽(yáng)性對(duì)照組。另取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml,加入1 ml緩沖液,作為陰性對(duì)照組,在30~35℃下培養(yǎng)18~24 h。然后分別取培養(yǎng)物0.1 ml,接種至10 ml RV沙門(mén)增菌液體培養(yǎng)基中,在30~35℃下培養(yǎng)18~24 h,取少量RV沙門(mén)增菌液體培養(yǎng)物,劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂的培養(yǎng)基上,在30~35℃下培養(yǎng)18~48 h,用接種針挑選疑似菌落,進(jìn)行斜面和高層穿刺接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上,于30~35℃中培養(yǎng)18~24 h,觀察菌落形態(tài),結(jié)果見(jiàn)表6。

    由表4~6可知,控制菌檢查采用直接接種法,即可達(dá)到要求。

    3討論

    2015年版與2010年版《中國(guó)藥典》相比[10-11],微生物計(jì)數(shù)法適用性試驗(yàn),從對(duì)細(xì)菌總數(shù)作方法適用性檢查,變成對(duì)需氧菌總數(shù)作方法適用性試驗(yàn),試驗(yàn)菌株3種變?yōu)?種;培養(yǎng)基由胰酪大豆胨瓊脂替代營(yíng)養(yǎng)瓊脂,用于檢查需氧菌,沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基代替玫瑰紅鈉培養(yǎng)基,用于檢查霉菌與酵母菌,雖然增加了試驗(yàn)的工作量,但卻具有良好的廣譜性,提高檢出率,方法更靈敏[12]。對(duì)控制菌的檢查,新版刪除了大腸菌群的檢查,新增了耐膽鹽革蘭陰性菌的檢查[13],對(duì)含有藥材粉末的固體口服給藥制劑都必須檢查沙門(mén)菌,提高了對(duì)致病菌控制的要求。

    烏芪舒筋通絡(luò)片處方藥味中多種成分含有抗菌活性[14-15],由實(shí)驗(yàn)可知,對(duì)需氧菌具有抑制作用,故需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查時(shí)采用常規(guī)平皿法回收率較低,需選用平皿稀釋法或薄膜過(guò)濾法。

    在實(shí)際工作中,勻漿儀打碎樣品時(shí),經(jīng)常出現(xiàn)泡沫,往往對(duì)驗(yàn)證結(jié)果造成影響,待泡沫消除后再加入菌種,基本能消除由操作引起的影響。

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    (收稿日期:2017-05-16 本文編輯:許俊琴)

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