Cx43對腦膠質瘤C6細胞增殖的影響及機制

李業(yè)如，龐祥媚，李 敏， 王 清，楊宇清，韓小建， 蔣麗萍

(南昌大學藥學院藥理學教研室，江西 南昌 330006)

Cx43對腦膠質瘤C6細胞增殖的影響及機制

李業(yè)如，龐祥媚，李 敏， 王 清，楊宇清，韓小建， 蔣麗萍

(南昌大學藥學院藥理學教研室，江西 南昌 330006)

目的 將pCMV-Cx43cDNA重組質粒轉染入大鼠腦膠質瘤C6細胞，上調C6細胞Cx43表達，進而探討C6細胞Cx43過表達對其增殖能力的影響及機制。方法 通過脂質體將pCMV-Cx43cDNA重組質粒轉入C6細胞，使C6細胞過表達Cx43，并用G418篩選出穩(wěn)定過表達Cx43的C6細胞；測定細胞倍增時間和軟瓊脂集落形成實驗，檢測各組細胞的增殖程度；分別用ERK1/2特異性阻斷劑PD98059(30 μmol·L-1)、p38MAPK特異性阻斷劑SB20219(10 μmol·L-1)處理各組細胞，Western blot檢測各組細胞Cx43、p-Cx43、p-ERK1/2和p-p38MAPK的表達；MTT比色法檢測各組細胞活性。結果 成功將pCMV-Cx43cDNA重組質粒轉入C6細胞，并篩選出穩(wěn)定轉染Cx43基因的C6細胞；測定細胞倍增時間和軟瓊脂集落形成實驗表明C6-Cx43組比C6組、C6-pCMV組細胞增殖速度減慢，細胞集落數(shù)明顯減少(P<0.01)；ERK1/2、p38MAPK特異性阻斷劑處理細胞后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)C6-Cx43+PD98059組、C6-Cx43+SB202190組較C6-Cx43組Cx43表達升高(P<0.01)、p-Cx43(P<0.05)表達下調。結論 阻斷ERK1/2、p38MAPK通路，導致Cx43 蛋白表達升高，從而抑制C6細胞的增殖。

腦膠質瘤C6細胞；縫隙連接；Cx43；增殖；ERK1/2；p38MAPK

腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腫瘤，約占顱內(nèi)各類型腫瘤發(fā)生率的0.4～0.6。目前，治療腦膠質瘤的主要手段是行腫瘤切除術，其次是放療和化療。由于腫塊的不均一性、腫塊與正常組織結合在一起無界限及膠質瘤細胞的高侵襲性，使得預后不良，術后易復發(fā)。因此，迫切需要探索新的觀念和方法、新的分子靶點來治療腦膠質瘤。

縫隙連接(gap junction,GJ)通道是相鄰兩細胞通過連接子兩兩對接而成，生理條件下，允許細胞間電流、離子、分子質量小于1.2 ku、直徑小于10 nm的分子及第二信使物質通過[1]。Cx43是中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達最豐富的縫隙連接通道蛋白(connexins,Cxs)，且主要分布在星型膠質細胞中。已有研究表明，Cx43是一種腫瘤抑制基因，可以扭轉乳腺癌、神經(jīng)膠質瘤細胞等癌細胞的表型轉化。盡管Cx43表達水平的變化不是腦膠質瘤的始動因素，但Cx43表達水平與神經(jīng)膠質瘤病理類型及惡性程度有關。Herrero-Gonzalez等[2]研究表明，Cx43能夠抑制腦膠質瘤C6細胞中c-Src致癌活性，從而進一步降低C6細胞增殖率。此外，洪濤等[3]發(fā)現(xiàn)，轉染Cx43 cDNA可明顯抑制C6細胞增殖，且導致縫隙連接通訊功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)增強。上述研究均證明Cx43參與腫瘤細胞增殖、遷移和黏附，所以Cx43成為治療腦膠質瘤的一個潛在重要靶點。細胞因子能維持腫瘤細胞的快速生長，促進其播散轉移，從而使腫瘤細胞不斷增殖、轉移侵襲入體正常組織。由于基因的突變，大部分腫瘤細胞都過表達EGF、IGF、PDGF等生長因子和其受體，這些因子的信號主要通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路傳導到細胞核引起細胞過增殖反應。MAPK是一類重要的細胞內(nèi)信息傳遞物質，參與細胞的增殖、分化和凋亡等生理、病理過程。大量的研究表明MAPK可將膜受體刺激信號傳遞入細胞核內(nèi)靶部位，調節(jié)細胞基因轉錄和蛋白合成，它是許多胞外促細胞增殖信號傳導通路的核心環(huán)節(jié)[4]。其中ERK1/2通路在生長因子相關的刺激引起的細胞增殖反應中起著重要的作用，而p38MAPK通路主要受紫外線、過氧化氫和促炎細胞因子等損傷性因素的激活和調節(jié)，參與應激反應[5]。Cx43對腫瘤細胞快速增殖的影響與MAPK信號通路是否密切相關尚不清楚，因此在前人研究的基礎上，本實驗通過轉染Cx43cDNA介導C6細胞過表達Cx43，探討C6細胞過表達Cx43與其增殖關系及可能的機制，為臨床防治腦膠質瘤提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠C6細胞(中山大學生物實驗中心盧慧敏博士后惠贈)，pcDNA3.1 質粒(南昌大學分子生物中心惠贈)，pCMV-cx43cDNA重組質粒(本實驗構建)。胎牛血清、DMEM、Lipofectamine 2000、G418(美國Gibco公司)，MTT(北京天根公司)，兔抗Cx43、p-Cx43、ERK1/2、p-ERK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)，山羊抗兔IgG(北京康為世紀生物科技有限公司)、明膠(西安國安生物科技有限公司)，其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒及空載質粒轉染C6細胞并篩選穩(wěn)定細胞株

1.2.1.1 G418藥物最優(yōu)濃度篩選 將細胞以1×106·L-1，接種到24孔板。接種后d 2按G418(0、50、100、200、400、800、1 000 mg·L-1)進行篩選。每3 d更換1次含相同濃度G418的新鮮培養(yǎng)基，觀察細胞生長及死亡情況，以孔中細胞全部死亡的最低G418濃度為篩選劑量。本實驗篩選出G418最優(yōu)濃度為800 mg·L-1。

1.2.1.2 篩選穩(wěn)轉細胞株 將細胞以5×107個·L-1接種到6孔板，培養(yǎng)24 h進行轉染。配制溶液a：240 μL無血清培養(yǎng)基+10 μL Lipofectamine 2000，總體積250 μL，室溫孵育5 min。溶液b：每孔加220 μL無血清培養(yǎng)基+30 μL質粒(130 mg·L-1)，總體積250 μL。將溶液a與b充分混合，室溫孵育20 min。將6孔板中的細胞用PBS沖洗2遍，加入2 mL無血清培養(yǎng)基，再加入溶液a與b的混合液500 μL，邊加邊搖動培養(yǎng)板混勻。6 h后，更換含體積分數(shù)為0.1 FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，更換含G418(800 mg·L-1)的DMEM培養(yǎng)液進行篩選。每隔3 d換用新鮮的含G418培養(yǎng)基，以替換含大量死細胞的培養(yǎng)基。待抗性細胞長滿后，傳代培養(yǎng)并凍存保種。

1.2.2 Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達 用BCA法進行總蛋白定量，在保證蛋白上樣量一致的情況下，進行SDS-PAGE后，轉移到PVDF膜上，用體積分數(shù)為0.05的脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，以及室溫孵育二抗1 h，使用ECL發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)照相并記錄，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.3 細胞倍增時間測定 收集各組細胞，經(jīng)胰酶消化離心后，用含體積分數(shù)0.001的BSA DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，以5×107個·L-1接種到6孔板，每組設5個復孔，放在體積分數(shù)0.05的CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后胰酶消化離心，用體積分數(shù)0.001的BSA DMEM培養(yǎng)基重懸各組細胞，從每組細胞懸液中吸取20 μL滴入細胞計數(shù)板進行計數(shù)，并計算各組細胞倍增時間。細胞倍增時間計算公式為：Td=T×lg2/lg(N/N0)。Td：倍增時間、T：間隔時間、N：終點細胞數(shù)量、N0：初始細胞數(shù)量。

1.2.4 細胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)實驗 收集各組細胞，胰酶消化后吹散成單細胞懸液，計數(shù)并調節(jié)細胞濃度為5×107·L-1。取6孔板，將體積分數(shù)0.012的瓊脂糖(在65℃水浴中放置保持融化狀態(tài))與2×細胞培養(yǎng)基以1 ∶1的體積比混合制備成體積分數(shù)0.006的底層瓊脂，每孔迅速加入1.4 mL，室溫凝固。將體積分數(shù)0.006的瓊脂糖與2×細胞培養(yǎng)基以1 ∶1的體積比混合，制備體積分數(shù)為0.003的上層瓊脂，每孔加1 mL上層瓊脂和100 μL單細胞懸液(約1 000個/孔)，混勻，室溫凝固。置于體積分數(shù)為0.05的CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。

1.2.5 MTT比色法測定細胞活性 收集各組細胞，消化離心重懸，以3×106·L-1接種到96孔板，每組設5個復孔，放在體積分數(shù)為0.05的CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后每孔分別加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1，0.005 MTT)，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出96孔板，每孔加100 μL DMSO，輕輕震蕩混勻，用全自動酶標儀在570 nm波長下測量光吸度值。

2 結果

2.1 Western blot檢測重組質粒穩(wěn)定轉染C6細胞后Cx43蛋白表達水平 采用Lipofectamine 2000將重組質粒穩(wěn)定轉染至C6細胞，Western blot檢測Cx43表達水平。如Fig 1所示：C6-Cx43組與C6組相比，Cx43表達明顯升高(P<0.01)，C6-pCMV組與C6相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明成功將重組質粒轉入C6細胞并穩(wěn)定表達Cx43。

2.2 體外培養(yǎng)測定各組細胞倍增時間 通過繪制細胞生長曲線，反映各組細胞增殖速度。經(jīng)計算，3組細胞的倍增時間分別為28.5、29.4、70.3 h。如Fig 2所示，C6-Cx43組細胞倍增時間較C6組明顯延長(P<0.01)，而C6-pCMV與C6組細胞倍增時間差別不大，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示Cx43蛋白過表達后C6細胞增殖速度明顯減弱。

Fig 1 Relative Cx43 protein level of each group

**P<0.01vsC6

Fig 2 The cell growth curve of each group

**P<0.01vsC6

2.3 軟瓊脂集落培養(yǎng)實驗測定各組細胞惡性增殖程度 實驗以肉眼可見的細胞團(含500個以上細胞)作為計數(shù)集落的標準。C6組、C6-pCMV組在含0.003的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，每個孔中可見有多個集落形成，集落數(shù)分別為(33±4)、(36±4)，而C6-Cx43組集落數(shù)為(7±2)。如Fig 3所示，C6-Cx43組與C6組相比，軟瓊脂中的集落數(shù)明顯減少(P<0.01)；而C6-pCMV組與C6組相比集落數(shù)相當，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示過表達Cx43后C6細胞的惡性增殖程度降低。

Fig 3 The cell colony number of each group

**P<0.01vsC6

2.4 ERK1/2阻斷劑PD98059處理后Cx43、p-Cx43、p-ERK1/2的表達情況 各組細胞用ERK1/2阻斷劑PD98059(30 μmol·L-1)處理2 h后收集細胞，提取總蛋白，檢測各組細胞Cx43、p-Cx43、p-ERK1/2的表達情況。如Fig 4A所示，C6-Cx43 +PD98059組較C6-Cx43組Cx43蛋白表達增多(P<0.05)，提示ERK1/2途徑被阻斷后，Cx43蛋白表達明顯上調；C6-Cx43+PD98059組較C6-Cx43 組p-Cx43蛋白表達減少(P<0.05)，提示ERK1/2途徑受阻斷后，p-Cx43蛋白表達明顯下調。如Fig 4B所示，C6-Cx43 +PD98059組較C6+PD98059組p-ERK1/2蛋白表達量明顯下調(P<0.05)，提示Cx43蛋白高表達降低了p-ERK1/2蛋白表達水平。

2.5 p38MAPK阻斷劑SB202190處理后Cx43、p-Cx43、p-p38MAPK的表達情況 各組細胞用p38MAPK阻斷劑SB202190(30 μmol·L-1)處理2 h后收集細胞，提取總蛋白，檢測各組細胞Cx43、p-Cx43、p-p38MAPK的表達情況。如Fig 5A所示，C6-Cx43 +SB202190組較C6-Cx43組Cx43蛋白表達增多(P<0.05)，提示p38MAPK途徑被阻斷后，Cx43蛋白表達明顯上調；C6-Cx43 +SB202190組較C6-Cx43組p-Cx43蛋白表達減少(P<0.05)，提示p38MAPK途徑受阻斷后，p-Cx43蛋白表達明顯下調。如Fig 5B所示，C6-Cx43 +SB202190組比C6+SB202190組p-p38MAPK蛋白表達量明顯下調(P<0.05)，提示Cx43蛋白高表達明顯降低了p-p38MAPK蛋白表達水平。

2.6 ERK1/2、p38MAPK阻斷劑處理后MTT比色法測定細胞活性 如Fig 6、7所示，C6-Cx43組較C6組吸光度值明顯減少(P<0.01)，提示Cx43蛋白過表達后C6細胞增殖能力明顯下降；C6+PD98059組、C6+SB202190組較C6組吸光度值均明顯減小(P<0.01)，C6-Cx43+PD98059組、C6-Cx43+SB202190組較C6-Cx43組吸光度值均明顯減小(P<0.05)，提示經(jīng)ERK1/2、p38MAPK阻斷劑處理后C6細胞增殖能力明顯下降。

Fig 4 Relative Cx43, p-Cx43(A) and p-ERK1/2(B)protein levels of each group

1:C6;2:C6-pCMV;3:C6-Cx43;4:C6+PD98059;5:C6-pCMV+PD98059;6:C6-Cx43+PD98059.**P<0.01vsC6;#P<0.05vsC6-Cx43

Fig 5 Relative Cx43, p-Cx43(A) and p-p38MAPK(B)protein level of each group

1:C6;2:C6-pCMV;3:C6-Cx43;4:C6+SB202190;5:C6-pCMV+SB202190;6:C6-Cx43+SB202190.**P<0.01vsC6;#P<0.05vsC6-Cx43

Fig 6 The absorbance values of each group

1:C6;2:C6-pCMV;3:C6-Cx43;4:C6+PD98059;5:C6-pCMV+PD98059;6:C6-Cx43+PD98059.**P<0.01vsC6;#P<0.05vsC6-Cx43

Fig 7 The absorbance values of each group

1:C6;2:C6-pCMV;3:C6-Cx43;4:C6+SB202190;5:C6-pCMV+SB202190;6:C6-Cx43+SB202190.**P<0.01vsC6;#P<0.05vsC6-Cx43

3 討論

GJIC與腫瘤密切相關，多數(shù)腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)Cxs突變、表達或胞內(nèi)定位改變，GJIC能力降低或喪失[6]。Cx43作為構成GJIC的重要組成部分，在很大程度上調控著GJIC的功能。有研究者指出，腦膠質瘤惡性程度越高，GJIC功能越弱，Cx43表達越少[7]。將Cx43轉染于人腦膠質瘤細胞U251和T98G，細胞增殖明顯受到抑制，由此推測，Cx43可能是一種抑癌基因[8]。之后有許多研究都表明，Cxs能夠抑制腫瘤細胞增殖，并把它視為一個抑癌基因家族，且Cxs可通過多種途徑抑制腫瘤的增殖。MAPK信號通路對Cx43的調節(jié)近年來已成為一研究熱點，其中ERK1/2、p38MAPK這兩條通路已被證實可以調節(jié)Cx43的表達。ERK1/2和其他的一些激酶能促使縫隙連接蛋白Cxs磷酸化，從而調控縫隙連接通道的開合，同時它還能誘導Cx43的內(nèi)吞作用。致癌物質通過激活細胞中ERK1/2通道，使細胞在早期核小體中滯留Cx43使得腫瘤細胞中Cx43蛋白的表達量減少，進而導致GJIC功能下降[9]，該研究結果提示，化學物質激活MAPK信號轉導通路并使得抑癌基因Cx43的功能受到抑制，導致細胞生長失控，腫瘤細胞增殖[10]。p38MAPK同樣為MAPK家族中的重要成員，是調節(jié)細胞內(nèi)生理和病理功能的主要信號通道，通過由Cx43蛋白組成的GJ，與胞內(nèi)其他信號物質協(xié)同調節(jié)ATP的釋放[11]。腫瘤細胞間縫隙連接通訊的減少和細胞膜通透性的增加也受到p38MAPK活性的調節(jié)[12]。有實驗證明，Cx43的磷酸化導致GJIC功能減弱，p38MAPK的激活也會導致GJIC的減少。Cx43的磷酸化激活可能導致Cx43蛋白的損耗，而這些損失可能就是細胞間縫隙連接減少和GJIC減少的原因[13]。Cx43的高度磷酸化和Cx43表達的減少導致細胞間通訊的減少，Cx43的高度磷酸化部分原因是受到p38MAPK下游的兩個直接靶點Ser279和Ser282位點的調節(jié)，相反，p38MAPK活性的抑制使Cx43的磷酸化減少[14]。同時p38MAPK的活性的抑制也能導致縫隙連接蛋白ATP釋放通道的開放和誘導巨噬細胞死亡。在腫瘤細胞中p38MAPK介導腫瘤細胞有選擇性的遷移，而這種效應是通過Cx43來調節(jié)的[15]。 本實驗從基因水平上調Cx43表達，觀察大鼠腦膠質瘤細胞C6增殖能力的變化。應用脂質體將Cx43重組質粒轉染于C6細胞并用G418篩選，得到C6-Cx43穩(wěn)定轉染細胞株，同時以轉染空質粒組為陰性對照組。通過體外培養(yǎng)測定細胞倍增時間發(fā)現(xiàn)C6-Cx43組細胞增殖速度明顯降低，軟瓊脂集落培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)C6-Cx43組細胞惡性增殖程度減弱；ERK1/2、p38MAPK阻斷劑處理后Western blot檢測發(fā)現(xiàn)C6細胞Cx43表達升高，p-Cx43表達降低；MTT法檢測細胞活性發(fā)現(xiàn)，ERK1/2、p38MAPK阻斷劑處理后C6細胞增殖能力減弱。綜上所述，本實驗提示Cx43蛋白可能通過ERK1/2、p38MAPK通路抑制腦膠質瘤C6細胞的增殖。

Cx43抑制腫瘤細胞增殖，可能存在多種機制相互作用。我們研究的MAPK信號通路，從信號轉導的角度證明了Cx43可以對細胞的增殖產(chǎn)生影響，是Cx43作為抑癌因子抑制腫瘤細胞增殖的機制之一，為臨床研究抗腫瘤藥物提供新的途徑和靶點，為Cx43的臨床應用奠定堅實的理論基礎。

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Effect of Cx43 on proliferation of C6 glioma cells and its mechanisms

LI Ye-ru, PANG Xiang-mei, LI Min, WANG Qing, YANG Yu-qing, HAN Xiao-jian, JIANG Li-ping
(SchoolofPharmaceuticalScience,NanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Aim To explore the effect of Cx43 over-expression on proliferation of C6 cells and its mechanisms by transfecting pCMV-Cx43cDNA plasmid into C6 cells.Methods pCMV-Cx43cDNA plasmid was transfected into C6 cells by liposome to up-regulate the expression of Cx43, and C6 cells with over-expression of Cx43 was stably cloned by using G418. Determination of cell doubling time and soft agar colony formation assay to detect the degree of cell proliferation.The cells were treated with ERK1/2 specific blocker PD98059(30 μmol·L-1) and p38MAPK specific blocker SB202190(10 μmol·L-1)respectively, the expression of Cx43, p-Cx43, p-ERK1/2 and p-p38MAPK of each group were detected by Western blot, and the activity of each group was detected by MTT Assay. Results pCMV-Cx43cDNA plasmid was transfected into C6 cells successfully. Cell lines with over-expression Cx43(C6-Cx43) or empty vector (C6-pCMV) were stably selected by using G418. Determination of cell doubling time and soft agar colony formation experiments showed that the proliferative rate and the colony number of C6-Cx43 group were significantly decreased, compared with that of C6 group and C6-pCMV group(P<0.01); ERK1/2, p38MAPK specific blockers were treated with each group,Western blot showed that the expression of Cx43 protein was increased(P<0.01), while p-Cx43 protein was decreased (P<0.05) in C6-Cx43+PD98059 group and C6-Cx43+SB202190 group，compared with that of C6-Cx43 group. Conclusion Cx43 may decrease the proliferation of glioma cells through ERK1/2, p38MAPK pathways.

glioma cells C6; Gap Junction;Cx43;proliferation;ERK1/2; p38MAPK

2017-04-11,

2017-05-20

國家自然科學基金資助項目(No 81660014，30760286)；江西省自然科學基金資助項目(No 20142BAB205022)

李業(yè)如(1994-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學，E-mail: liyeru0564@163.com; 蔣麗萍(1965-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，Tel:0791-86301368,E-mail: lipingjiang2002@aliyun.com; 韓小建(1974-)，男，博士，碩士生導師，研究方向：線粒體動態(tài)變化，通訊作者，Tel:0791-86318955,E-mail: hanxiaojian@hotmail.com

時間：2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.048.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.024

A

1001-1978(2017)07-1008-06

R-332；R329.24；R730.264；R739.41；R977.6